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摘 要：【目的】利用建立的多效唑诱导中国水仙的SSH文库，克隆中国水仙NtCCHC锌指基因的cDNA序列，进行原核表达，为深入研究NtCCHC锌指基因在中国水仙中的功能奠定基础。【方法】采用Trizol法提取多效唑处理后的中国水仙叶片总RNA，反转录成cDNA后，根据已知的CCHC锌指蛋白基因序列设计引物进行基因克隆和同源性分析，并构建原核表达载体进行诱导表达。【结果】克隆一段810bp的cDNA编码区序列，编码269个氨基酸，同源性分析表明与多个物种的CCHC基因存在着较高的同源性，命名为NtCCHC。该基因能成功在pGEX-4T-3原核表达载体上实现诱导表达，系统进化树分析表明：NtCCHC与中国莲遗传距离最近。【结论】克隆了中国水仙NtCCHC基因序列，并成功诱导表达。
关键词：中国水仙;锌指蛋白;基因克隆;蛋白表达
中图分类号：S 682文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）08-889-05
Abstract：【Objective】 Based on the information in the SSH Library on Narcissus tazetta var.chinensis，the zinc finger gene was cloned and prokaryotic expressed for future studies. 【Method】 Total RNA of N.tazetta var. chinensis from the paclobutrazol-treated leaves was extracted using the Trizol method. After reverse transcription into cDNA， gene cloning and homology analysis were carried out on it with primers designed according to the known sequence of CCHC. A prokaryotic expression vector was constructed to induce expression. 【Result】 The 810 bp sequence encoding 269 amino acids was cloned. The cloned gene showed high homologies with the CCHC genes of many species and was named NtCCHC， which could be successfully induced and expressed in pGEX-4T-3. The phylogenetic tree constructed by MEGA 6.0 indicated that the closest genetic distance of NtCCHC lied with Nelunbo nucifera. 【Conclusion】This study successfully cloned and expressed the NtCCHC gene sequence of N. chinensis.
Key words：Narcissus tazetta var. chinensis; zinc finger protein; gene cloning; protein expression
0 引言
【研究意義】锌指蛋白（zinc finger protein）是一类通过结合锌离子折叠成手指状结构域的蛋白，主要由半胱氨酸（Csy）和组氨酸（His）组成，通过锌离子形成“指”状四面体结构[1]。其中CCHC型锌指蛋白既能结合单链DNA也能结合RNA，广泛地参与细胞生长过程的转录调控、3′顺式剪接位点选择、多顺反子RNA切割、多聚腺苷酸化和同源重组[2-3]。锌指蛋白基因是逆境响应的调节物，中国水仙Narcissus tazetta var.chinensis为石蒜科水仙属植物，是中国传统名花之一。研究中国水仙CCHC型锌指蛋白基因的克隆与原核表达情况，对提高中国水仙的抗性水平具有十分重要意义。【前人研究进展】郑恒等[4]从日本晴中克隆已知基因OsC2HC （AK103785），其含有1个C2HC型锌指结构域，研究表明过表达OsC2HC-1∷GFP的拟南芥比野生型优势生长，表现出较强的抗盐碱性和抗氧化性，说明OsC2HC-1基因与抗盐碱性及抗氧化性有关。在大豆疫霉的基因组，锌指蛋白CCHC类的含量特别高，约为1.9%，比高等植物高出近4倍，说明这类转录因子有可能在大豆疫霉的生理功能中起着重要的作用。从水稻中克隆的含CCHC结构域的OsZFP6基因，经NaCl、 NaHCO3、 H2O2 处理后，表达量增加;将基因转到酵母菌中，经NaHCO3处理后与对照相比表达量具有明显的增加，说明含CCHC基因的OsZFP6，可提高植株对碱和H2O2的抗性[5]。目前对中国水仙的基因克隆研究主要集中在花色相关基因[6]、MADS-box基因[7]、几丁质酶基因[8]和STK类抗病基因[9]的研究，本课题组前期建立的多效唑诱导中国水仙的SSH文库为基础，克隆了中国水仙植物AT富集序列锌结合蛋白基因（NtPLATZl）[10]，并筛选获得一个全新的中国水仙NtCCHC锌指基因的cDNA序列，经同源性分析，构建了中国水仙锌指基因与其他物种的系统进化关系，以期为深入研究NtCCHC锌指基因在中国水仙中的功能奠定基础。【本研究切入点】NtCCHC与其他物种的同源性及原核表达情况，是研究中国水仙在多效唑处理后在分子水平上如何调控基因的表达的前提条件。【拟解决的关键问题】本研究利用建立的多效唑诱导中国水仙的SSH文库，克隆了中国水仙NtCCHC锌指基因的cDNA序列，进行原核表达，为深入研究NtCCHC锌指基因在中国水仙中的功能奠定基础。 1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为中国水仙“金盏银台”品种，种球来源于实验室保存，水仙花种球水养16 d后，每天用150 mg·L-1的多效唑喷雾1次，连续喷雾10次，取成长期叶片，用液氮冻结后，置于-70℃冰箱中保存备。RNase Inhibitor、dNTP Mixture、pMD19-T、限制性内切酶等购自TaKaRa（大连） 生物有限公司，其他试剂均为国产分析纯。HB101、BL21菌株为本研究室保存。
1.2 试验方法
1.2.1 中国水仙NtCCHC基因克隆 采用Trizol法进行总RNA的提取，用超微量紫外可见光分光光度计（ND-1000）测260 nm和280 nm下的吸光值，计算RNA纯度和浓度。以RNA为模板，合成cDNA第一链。根据已获得的中国水仙含CCHC保守结构域锌指蛋白基因的cDNA核苷酸序列设计5′和3′端扩增引物，通过5′-RACE和3′-RACE的方法，获得中国水仙含CCHC保守结构域锌指蛋白基因的全长 cDNA。
根据已获得的cDNA片段设计引物，CC1：5′-CCC GAA TTC ATG TCT AGC AAG AAT GAA GAA-3′（含EcoRI酶切位点）， CC2：5′-TGC GGC CGC TCA ACA TCT CCG ACC GTG CCT-3′（含NotI酶切位点）。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。
PCR产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片断，检验产物胶回收情况。将PCR胶回收产物连接到pMD19-T上，转化大肠杆菌HB101，挑选单菌落扩繁， PCR验证，送上海生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.2 序列的生物信息学分析 Blast搜索NCBI的核苷酸数据库，进行序列相似分析。利用MEGA6.0软件，构建系统发育树[11]。
1.2.3 NtCCHC基因原核表达载体构建与蛋白表达分析 用EcoR I、Not I双酶切pMD-NtCCHC和pGEX-4T-3，胶回收、连接、转化，挑选单菌落扩繁后提取质粒，酶切鉴定后，送上海生工测序。
阳性重组克隆子转化表达宿主菌Esherichia coli BL21（DE3），加入1 mmol·L-1 IPTG， 在37℃下以250 r·min-1过夜培养，离心收集菌体，用50 mL 50mmol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH8.0）悬浮沉淀;加等体积2×凝胶上样缓冲液，混匀，100℃水浴变性处理10 min;诱导前、后的菌样各取10 μL经SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色检测蛋白表达情况。
2 结果与分析
2.1 中国水仙NtCCHC基因ORF的克隆
以反转录后cDNA模板，用特异性引物CC1和CC2扩增特异性目标条带（图1）。PCR产物经回收、连接、转化大肠杆菌，菌液PCR检测获得阳性克隆。测序结果表明目的片段大小为810 bp。将获得的核苷酸序列应用DNAMAN软件进行分析和预测，编码了269个氨基酸（图2）。
2.2 基因的同源性分析及系统进化树的构建
将测序结果应用NCBI網站（http：//www.ncbi.nhn.nih.gov/）Blast软件进行序列同源性比对分析。分析结果表明，获得的中国水仙NtCCHC基因编码区与多个物种含CCHC结构域基因核苷酸序列同源，其中与中国莲Nelunbo nucifera（XP-010259317）、棉花Gossypium arboretum（KHG03978.1）、葡萄Vitis vinifera（XP002276973.1）等植物一致性达80%以上。
系统进化树是物种的进化史，通过构建系统进化树可以根据这些物种的祖先描述它们的进化关系。利用MEGA 6.0软件对日本水稻Oryza sativa Japonica（AK103785.1）、小麦Aegilops tauschii（EMT31466）、梅花Prunus mume（XP_008223318.1）、拟南芥Arabidopsis thaliana（AAD22698）、水稻Oryza brachyantha（XP_006662806）、 中国莲Nelunbo nucifera（XP_010259317）、葡萄Vitis vinifera（XP_002276973.1）、棉花Gossypium arboretum（KHG03978.1）、桑树Morus notabilis（XP_010097953）、巴旦木Prunus persica（XP_0072237776.1）和中国水仙NtCCHC等11个物种含CCHC结构域基因的核苷酸序列构建系统进化树。从图3看出，从遗传距离上看，这些植物的基因的亲缘关系都比较接近，聚为两大类，一类是拟南芥和小麦，其余9种植物聚为一类，NtCCHC与中国莲遗传距离最近。
2.3 NtCCHC基因的原核蛋白表达分析
2.3.1 原核表达载体的酶切鉴定
对重组质粒pGEX-NtCCHC以EcoR I、Not I双酶切鉴定（图4），分别获得载体片段约4 900 bp和810 bp目的片段两个条带，表明目的片段已成功插入表达载体。
2.3.2 融合蛋白的诱导表达
由pGEX-NtCCHC表达得到的融合蛋白前半部为质粒本身的谷胱甘肽转移酶（GST），后半部为NtCCHC基因编码的蛋白。GST蛋白分子量为26 kDa，而从插入的NtCCHC基因片段的核苷酸序列推导出蛋白分子量为30.046 8 kDa，故融合蛋白的分子量应为56.046 8 kDa。融合蛋白经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE跑胶验证（图5），表明目的蛋白已诱导表达，其分子量约为56 kDa与目的基因片段（30.046 kDa）和GST标签蛋白大小之和基本对等。 3 討论与结论
锌指结构蛋白基因，具有指状结构特征，根据蛋白结构中半胱氨酸和组氨酸残基的数目和顺序有 C2H2， CCHC 和 C2C2 等结构类型，主要通过与核酸的相互作用如促进转录、抑制转录、单链DNA/RNA 结合等进而影响整个生命过程，多数锌指蛋白是逆境响应的正调节物[12]。
本试验以前期建立的多效唑诱导中国水仙的SSH文库为基础，克隆了中国水仙NtCCHC基因，其推导的氨基酸序列具有一个CHCC锌指结构域。多效唑是一种广谱型的植物生长延缓剂，在中国水仙盆栽水养的过程中施用可让水仙植株矮化，株形紧凑，提高观赏价值[13-14]，致矮化的原理为喷施后水仙的根、叶生长降低、叶绿素含量增加、光合速率、光合/呼吸比率提高，同时提高水仙叶片IAA 氧化酶活性，从而降低体内 IAA 含量，致使水仙的矮化[15-16]。NtCHCC基因在喷施多效唑后，水仙植株矮化后的表达情况需进一步的进行试验，另外中国水仙在多效唑处理后，在分子水平上如何调控NtCHCC这些基因的表达，从而达到矮化及改善株型的作用，还未见有相关的研究报道。因此，锌指结构蛋白基因在多效唑矮化中国水仙的过程中在激发抗性方面起的作用还需进一步研究。
参考文献：
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（責任编辑：林海清）
关键词：中国水仙;锌指蛋白;基因克隆;蛋白表达
中图分类号：S 682文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）08-889-05
Abstract：【Objective】 Based on the information in the SSH Library on Narcissus tazetta var.chinensis，the zinc finger gene was cloned and prokaryotic expressed for future studies. 【Method】 Total RNA of N.tazetta var. chinensis from the paclobutrazol-treated leaves was extracted using the Trizol method. After reverse transcription into cDNA， gene cloning and homology analysis were carried out on it with primers designed according to the known sequence of CCHC. A prokaryotic expression vector was constructed to induce expression. 【Result】 The 810 bp sequence encoding 269 amino acids was cloned. The cloned gene showed high homologies with the CCHC genes of many species and was named NtCCHC， which could be successfully induced and expressed in pGEX-4T-3. The phylogenetic tree constructed by MEGA 6.0 indicated that the closest genetic distance of NtCCHC lied with Nelunbo nucifera. 【Conclusion】This study successfully cloned and expressed the NtCCHC gene sequence of N. chinensis.
Key words：Narcissus tazetta var. chinensis; zinc finger protein; gene cloning; protein expression
0 引言
【研究意義】锌指蛋白（zinc finger protein）是一类通过结合锌离子折叠成手指状结构域的蛋白，主要由半胱氨酸（Csy）和组氨酸（His）组成，通过锌离子形成“指”状四面体结构[1]。其中CCHC型锌指蛋白既能结合单链DNA也能结合RNA，广泛地参与细胞生长过程的转录调控、3′顺式剪接位点选择、多顺反子RNA切割、多聚腺苷酸化和同源重组[2-3]。锌指蛋白基因是逆境响应的调节物，中国水仙Narcissus tazetta var.chinensis为石蒜科水仙属植物，是中国传统名花之一。研究中国水仙CCHC型锌指蛋白基因的克隆与原核表达情况，对提高中国水仙的抗性水平具有十分重要意义。【前人研究进展】郑恒等[4]从日本晴中克隆已知基因OsC2HC （AK103785），其含有1个C2HC型锌指结构域，研究表明过表达OsC2HC-1∷GFP的拟南芥比野生型优势生长，表现出较强的抗盐碱性和抗氧化性，说明OsC2HC-1基因与抗盐碱性及抗氧化性有关。在大豆疫霉的基因组，锌指蛋白CCHC类的含量特别高，约为1.9%，比高等植物高出近4倍，说明这类转录因子有可能在大豆疫霉的生理功能中起着重要的作用。从水稻中克隆的含CCHC结构域的OsZFP6基因，经NaCl、 NaHCO3、 H2O2 处理后，表达量增加;将基因转到酵母菌中，经NaHCO3处理后与对照相比表达量具有明显的增加，说明含CCHC基因的OsZFP6，可提高植株对碱和H2O2的抗性[5]。目前对中国水仙的基因克隆研究主要集中在花色相关基因[6]、MADS-box基因[7]、几丁质酶基因[8]和STK类抗病基因[9]的研究，本课题组前期建立的多效唑诱导中国水仙的SSH文库为基础，克隆了中国水仙植物AT富集序列锌结合蛋白基因（NtPLATZl）[10]，并筛选获得一个全新的中国水仙NtCCHC锌指基因的cDNA序列，经同源性分析，构建了中国水仙锌指基因与其他物种的系统进化关系，以期为深入研究NtCCHC锌指基因在中国水仙中的功能奠定基础。【本研究切入点】NtCCHC与其他物种的同源性及原核表达情况，是研究中国水仙在多效唑处理后在分子水平上如何调控基因的表达的前提条件。【拟解决的关键问题】本研究利用建立的多效唑诱导中国水仙的SSH文库，克隆了中国水仙NtCCHC锌指基因的cDNA序列，进行原核表达，为深入研究NtCCHC锌指基因在中国水仙中的功能奠定基础。 1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为中国水仙“金盏银台”品种，种球来源于实验室保存，水仙花种球水养16 d后，每天用150 mg·L-1的多效唑喷雾1次，连续喷雾10次，取成长期叶片，用液氮冻结后，置于-70℃冰箱中保存备。RNase Inhibitor、dNTP Mixture、pMD19-T、限制性内切酶等购自TaKaRa（大连） 生物有限公司，其他试剂均为国产分析纯。HB101、BL21菌株为本研究室保存。
1.2 试验方法
1.2.1 中国水仙NtCCHC基因克隆 采用Trizol法进行总RNA的提取，用超微量紫外可见光分光光度计（ND-1000）测260 nm和280 nm下的吸光值，计算RNA纯度和浓度。以RNA为模板，合成cDNA第一链。根据已获得的中国水仙含CCHC保守结构域锌指蛋白基因的cDNA核苷酸序列设计5′和3′端扩增引物，通过5′-RACE和3′-RACE的方法，获得中国水仙含CCHC保守结构域锌指蛋白基因的全长 cDNA。
根据已获得的cDNA片段设计引物，CC1：5′-CCC GAA TTC ATG TCT AGC AAG AAT GAA GAA-3′（含EcoRI酶切位点）， CC2：5′-TGC GGC CGC TCA ACA TCT CCG ACC GTG CCT-3′（含NotI酶切位点）。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。
PCR产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片断，检验产物胶回收情况。将PCR胶回收产物连接到pMD19-T上，转化大肠杆菌HB101，挑选单菌落扩繁， PCR验证，送上海生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.2 序列的生物信息学分析 Blast搜索NCBI的核苷酸数据库，进行序列相似分析。利用MEGA6.0软件，构建系统发育树[11]。
1.2.3 NtCCHC基因原核表达载体构建与蛋白表达分析 用EcoR I、Not I双酶切pMD-NtCCHC和pGEX-4T-3，胶回收、连接、转化，挑选单菌落扩繁后提取质粒，酶切鉴定后，送上海生工测序。
阳性重组克隆子转化表达宿主菌Esherichia coli BL21（DE3），加入1 mmol·L-1 IPTG， 在37℃下以250 r·min-1过夜培养，离心收集菌体，用50 mL 50mmol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH8.0）悬浮沉淀;加等体积2×凝胶上样缓冲液，混匀，100℃水浴变性处理10 min;诱导前、后的菌样各取10 μL经SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色检测蛋白表达情况。
2 结果与分析
2.1 中国水仙NtCCHC基因ORF的克隆
以反转录后cDNA模板，用特异性引物CC1和CC2扩增特异性目标条带（图1）。PCR产物经回收、连接、转化大肠杆菌，菌液PCR检测获得阳性克隆。测序结果表明目的片段大小为810 bp。将获得的核苷酸序列应用DNAMAN软件进行分析和预测，编码了269个氨基酸（图2）。
2.2 基因的同源性分析及系统进化树的构建
将测序结果应用NCBI網站（http：//www.ncbi.nhn.nih.gov/）Blast软件进行序列同源性比对分析。分析结果表明，获得的中国水仙NtCCHC基因编码区与多个物种含CCHC结构域基因核苷酸序列同源，其中与中国莲Nelunbo nucifera（XP-010259317）、棉花Gossypium arboretum（KHG03978.1）、葡萄Vitis vinifera（XP002276973.1）等植物一致性达80%以上。
系统进化树是物种的进化史，通过构建系统进化树可以根据这些物种的祖先描述它们的进化关系。利用MEGA 6.0软件对日本水稻Oryza sativa Japonica（AK103785.1）、小麦Aegilops tauschii（EMT31466）、梅花Prunus mume（XP_008223318.1）、拟南芥Arabidopsis thaliana（AAD22698）、水稻Oryza brachyantha（XP_006662806）、 中国莲Nelunbo nucifera（XP_010259317）、葡萄Vitis vinifera（XP_002276973.1）、棉花Gossypium arboretum（KHG03978.1）、桑树Morus notabilis（XP_010097953）、巴旦木Prunus persica（XP_0072237776.1）和中国水仙NtCCHC等11个物种含CCHC结构域基因的核苷酸序列构建系统进化树。从图3看出，从遗传距离上看，这些植物的基因的亲缘关系都比较接近，聚为两大类，一类是拟南芥和小麦，其余9种植物聚为一类，NtCCHC与中国莲遗传距离最近。
2.3 NtCCHC基因的原核蛋白表达分析
2.3.1 原核表达载体的酶切鉴定
对重组质粒pGEX-NtCCHC以EcoR I、Not I双酶切鉴定（图4），分别获得载体片段约4 900 bp和810 bp目的片段两个条带，表明目的片段已成功插入表达载体。
2.3.2 融合蛋白的诱导表达
由pGEX-NtCCHC表达得到的融合蛋白前半部为质粒本身的谷胱甘肽转移酶（GST），后半部为NtCCHC基因编码的蛋白。GST蛋白分子量为26 kDa，而从插入的NtCCHC基因片段的核苷酸序列推导出蛋白分子量为30.046 8 kDa，故融合蛋白的分子量应为56.046 8 kDa。融合蛋白经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE跑胶验证（图5），表明目的蛋白已诱导表达，其分子量约为56 kDa与目的基因片段（30.046 kDa）和GST标签蛋白大小之和基本对等。 3 討论与结论
锌指结构蛋白基因，具有指状结构特征，根据蛋白结构中半胱氨酸和组氨酸残基的数目和顺序有 C2H2， CCHC 和 C2C2 等结构类型，主要通过与核酸的相互作用如促进转录、抑制转录、单链DNA/RNA 结合等进而影响整个生命过程，多数锌指蛋白是逆境响应的正调节物[12]。
本试验以前期建立的多效唑诱导中国水仙的SSH文库为基础，克隆了中国水仙NtCCHC基因，其推导的氨基酸序列具有一个CHCC锌指结构域。多效唑是一种广谱型的植物生长延缓剂，在中国水仙盆栽水养的过程中施用可让水仙植株矮化，株形紧凑，提高观赏价值[13-14]，致矮化的原理为喷施后水仙的根、叶生长降低、叶绿素含量增加、光合速率、光合/呼吸比率提高，同时提高水仙叶片IAA 氧化酶活性，从而降低体内 IAA 含量，致使水仙的矮化[15-16]。NtCHCC基因在喷施多效唑后，水仙植株矮化后的表达情况需进一步的进行试验，另外中国水仙在多效唑处理后，在分子水平上如何调控NtCHCC这些基因的表达，从而达到矮化及改善株型的作用，还未见有相关的研究报道。因此，锌指结构蛋白基因在多效唑矮化中国水仙的过程中在激发抗性方面起的作用还需进一步研究。
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（責任编辑：林海清）