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【摘 要】 目的：建立蒙成药塔斯音-10中胡椒碱含量测定的方法。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法，色谱柱为InertSustain AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（77∶ 23），流速为1.0 mL·min-1，检测波长343 nm，柱温30 ℃，进样量为10 μL。结果：胡椒碱在0.0103～0.2580 μg范围内呈良好的线性关系，相关系数r=0.9993，平均回收率为99.86%，RSD为0.76%。结论：该方法准确稳定，重复性好，专属性强，可用于蒙成药塔斯音-10的质量控制。
【关键词】 塔斯音-10;高效液相色谱（HPLC）法;胡椒碱;含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）11-0037-04
Abstract：Objective To establish the high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of Piperine in Mongolian Tasiyin-10.Methods The HPLC was carried out with InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），using methanol-water （77∶ 23） as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 343 nm and the column temperature was 30 ℃.Rseults The linear of Piperine was in the range of 0.0103～0.2580 μg （r=0.9993） . The average recovery was 99.86% （RSD=0.76%）.Conclusion This method is accurate，stable，reproducible and specific，which can be used for the quality control of Tasiyin-10.
Keywords：Tasiyin-10;HPLC;Piperine;Content Determination
塔斯音-10由荜拨、雕粪炭、寒水石（煅）、万年灰（制）、铁线透骨草、全石榴、干姜、光明盐、苏格木勒、肉桂等10味药组成[1]，主治胃火衰弱、胃寒食积、消化不良等[2]。荜茇为胡椒科植物荜茇Piper longum L. 的干燥近成熟果穗，作为中、蒙药常用药材，近些年来药理研究发现荜拨中所含胡椒碱Piperine具有抗氧化、抗炎杀菌、抗肿瘤、镇静、抗焦虑、抗胃溃疡、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用[3-4]。作为临床常用的蒙药医院制剂，目前为止，塔斯音-10质量控制方面的标准严重缺失，只有简单的外观性状和检查项目[2]。建立塔斯音-10主要药效成份胡椒碱含量测定的方法，能有效控制该成药的内在质量，为该成药质量标准的提升提供参考。
1 仪器及试药
1.1 仪器 Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪，Shimadzu LC-2030C液相色谱仪，InertSustain AQ-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。92SM-202A型电子天平，XS3DU电子天平，KQ5200DE超声波清洗机。
1.2 试药 对照品胡椒碱（批号：110775—201706，98.9%）由中国食品药品检定研究院所提供;样品塔斯音-10来源：1号样品（批号：20190909）由通辽市蒙医整骨医院提供;2号样品（批号：20181221）由库伦旗蒙医院制剂室提供;3号样品（批号：20190223）由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供。水为高纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 HPLC 方法学考察
2.1 色谱条件[5] 色谱柱：InertSustain AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Sepax Bio C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，检测波长343 nm。流动相：甲醇-水（77∶ 23），流速为1.0 mL·min-1，进样量为10 μL。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取胡椒碱对照品10.32 mg，置100 mL棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取1 mL置10 mL棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀即得胡椒碱对照品溶液（10.32 μg·mL-1）。
2.3 供试品溶液配制[6] 取本品粉末（过四号筛）约0.1 g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入无水乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 Hz）30 min，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.4 专属性试验 取按处方比例制备的不含胡椒碱药材的阴性对照供试品，按2.3项下供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性对照色谱图中在与胡椒碱对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明该方法专属性强，其他组分对胡椒碱的测定无干扰。色谱图如图1所示。
2.5 线性关系考察 精密称取胡椒碱对照品0.00645 g，置25 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，做为胡椒碱对照品储备液（258 μg·mL-1）。精密吸取该贮备液40、200、400、600、800、1000 μL，分别置于10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释定容后得到含有1.032 μg·mL-1、5.16 μg·mL-1、10.32 μg·mL-1、15.48 μg·mL-1、20.64 μg·mL-1、25.8 μg·mL-1的胡椒碱对照品系列浓度溶液。精密量取上述各浓度的标准溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品峰面积Y为纵坐标，相应的对照的量X为横坐标，进行线性回归。得到胡椒碱回归方程为：Y=71998X，r=0.9993，表明胡椒碱在0.0103～0.2580 μg范围内具有良好的线性关系。 2.6 精密度试验 按2.3项下供试品溶液配制方法，精密称取内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，批号为20190223的样品约0.1012 g，配制成精密度试验溶液，精密吸取样品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，重复进样6次，测得峰面积的RSD值为0.36%，表明该方法精密度良好。
2.7 稳定性试验 精密称取内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，批号为20190223的样品约0.1012 g，按2.3项下供试品溶液制备方法配制稳定性试验溶液，室温放置，分别在0、1、3、6、12、24 h进样，记录谱图，测得峰面积。结果24 h内峰面积的RSD值为0.59%，表明该方法提取的样品溶液在24 h内基本稳定。
2.8 重复性试验 取内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，批号为20190223的样品6份，每份约0.1 g，精密称定，按2.3项下供试品溶液制备方法配制重复性试验溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，结果6份平行样的含量RSD值为1.48%。表明该方法重复性良好。
2.9 准确度及范围[7-8] 取已知含量的样品（内蒙古民族大学附屬医院蒙药制剂室提供的，批号为20190223）9份，每份约0.05 g，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，分别加入2.5项下胡椒碱对照品贮备液380 μL、650 μL、1105 μL，按2.3项下供试品溶液制备方法制成加标回收溶液，配制成高、中、低三个浓度的加样回收溶液，精密量取上述9份样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，结果见表1。三个浓度加标回收率平均值为99.86%，RSD值为0.76%。表明胡椒碱含量在1.9～5.7 μg·mL-1范围内测得的结果准确可靠。
2.10 不同色谱柱和仪器设备的耐用性试验 换不同厂家、不同型号的色谱柱及不同的液相色谱仪，取内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，批号为20190223的样品，精密称定，按2.3项下供试品溶液配制方法配制样品溶液，精密吸取该样品溶液和2.2项下的对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算样品中胡椒碱含量。结果见表2。
从表中数据可以看出，胡椒碱的含量变化不大（RSD值0.89%），表明该方法对不同色谱柱和仪器设备耐用性良好。3 样品含量测定[9-10]
分别取三个厂家提供的塔斯音-10样品粉末约0.1g，精密称定，按2.3项下供试品溶液制备方法提取制备样品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，测定结果见表3。
4 讨论
成药粉末以甲醇和无水乙醇作为提取溶剂进行超声提取（功率120 W，频率40 kHz），结果无水乙醇提取效率高于甲醇，故提取溶剂定为无水乙醇。为保证胡椒碱成分提取完全，实验中考察了超声提取15 min、30 min和60 min，结果胡椒碱的含量基本一致（RSD 0.31%），故提取时间定为30 min。
柱温对胡椒碱与其它干扰组分的分离度影响较大。柱温40 ℃时胡椒碱拖尾严重，与相邻干扰组分峰分离度变小（R值为1.218，小于1.5），分不开。柱温调整至30 ℃时，胡椒碱拖尾因子变小，与相邻组分分离度变大，分离较好（R值为1.653）。故将柱温设定为30 ℃。
本实验通过专属性、精密度、稳定性、重复性试验、不同色谱柱及仪器设备的耐用性考察，结果表明该方法准确可靠，可作为塔斯音-10中胡椒碱含量测定的方法。
参考文献
[1]内蒙古医学院中医系.蒙医金匮蒙文版[G].呼和浩特：内蒙古人民出版，1978：82.
[2]内蒙古自治区卫生厅.内蒙古蒙成药标准[M].呼和浩特：内蒙古科学技术出版社，1984.
[3]乔佛晓，禹玉洪，李燕.荜茇的药理作用与毒性作用研究概述[J].环球中医药，2015，8（4）：507-512.
[4]李秦.荜茇化学成分及药理作用研究进展[J].中国伤残医学，2013，6（11）：457-458.
[5]国家药典委员.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：235.
[6]薄彧坤，赵国君，杨 丹. 荜拨中胡椒碱的提取方法研究[J].北方药学， 2016，11（13）：120-121.
[7]张丽萍，韩 怡，施晓卉，等. HPLC 法同时测定荜茇-大黄中 6 种成分的含量[J].实用药物与临床，2020，7（23）：628-631.
[8]徐 僮，杜欢，李琪，等. HPLC 法同时测定六味木香丸中4种成分[J].中成药，2019，10（41）：2315-2318.
[9]潘 遐，才让草，李 魁，等. HPLC 法测定藏药石榴莲花散中鞣花酸和胡椒碱的含量[J].中国民族民间医药，2019，19（28）：37-41.
[10]闫凤杰，关金凤. RP-HPLC法测定苏格木勒-3汤中胡椒碱的含量[J].中国民族民间医药，2012（13）：35-36.
（收稿日期：2020-11-05 编辑：刘 斌）
【关键词】 塔斯音-10;高效液相色谱（HPLC）法;胡椒碱;含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）11-0037-04
Abstract：Objective To establish the high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of Piperine in Mongolian Tasiyin-10.Methods The HPLC was carried out with InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），using methanol-water （77∶ 23） as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 343 nm and the column temperature was 30 ℃.Rseults The linear of Piperine was in the range of 0.0103～0.2580 μg （r=0.9993） . The average recovery was 99.86% （RSD=0.76%）.Conclusion This method is accurate，stable，reproducible and specific，which can be used for the quality control of Tasiyin-10.
Keywords：Tasiyin-10;HPLC;Piperine;Content Determination
塔斯音-10由荜拨、雕粪炭、寒水石（煅）、万年灰（制）、铁线透骨草、全石榴、干姜、光明盐、苏格木勒、肉桂等10味药组成[1]，主治胃火衰弱、胃寒食积、消化不良等[2]。荜茇为胡椒科植物荜茇Piper longum L. 的干燥近成熟果穗，作为中、蒙药常用药材，近些年来药理研究发现荜拨中所含胡椒碱Piperine具有抗氧化、抗炎杀菌、抗肿瘤、镇静、抗焦虑、抗胃溃疡、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用[3-4]。作为临床常用的蒙药医院制剂，目前为止，塔斯音-10质量控制方面的标准严重缺失，只有简单的外观性状和检查项目[2]。建立塔斯音-10主要药效成份胡椒碱含量测定的方法，能有效控制该成药的内在质量，为该成药质量标准的提升提供参考。
1 仪器及试药
1.1 仪器 Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪，Shimadzu LC-2030C液相色谱仪，InertSustain AQ-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。92SM-202A型电子天平，XS3DU电子天平，KQ5200DE超声波清洗机。
1.2 试药 对照品胡椒碱（批号：110775—201706，98.9%）由中国食品药品检定研究院所提供;样品塔斯音-10来源：1号样品（批号：20190909）由通辽市蒙医整骨医院提供;2号样品（批号：20181221）由库伦旗蒙医院制剂室提供;3号样品（批号：20190223）由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供。水为高纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 HPLC 方法学考察
2.1 色谱条件[5] 色谱柱：InertSustain AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Sepax Bio C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，检测波长343 nm。流动相：甲醇-水（77∶ 23），流速为1.0 mL·min-1，进样量为10 μL。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取胡椒碱对照品10.32 mg，置100 mL棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取1 mL置10 mL棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀即得胡椒碱对照品溶液（10.32 μg·mL-1）。
2.3 供试品溶液配制[6] 取本品粉末（过四号筛）约0.1 g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入无水乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 Hz）30 min，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.4 专属性试验 取按处方比例制备的不含胡椒碱药材的阴性对照供试品，按2.3项下供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性对照色谱图中在与胡椒碱对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明该方法专属性强，其他组分对胡椒碱的测定无干扰。色谱图如图1所示。
2.5 线性关系考察 精密称取胡椒碱对照品0.00645 g，置25 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，做为胡椒碱对照品储备液（258 μg·mL-1）。精密吸取该贮备液40、200、400、600、800、1000 μL，分别置于10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释定容后得到含有1.032 μg·mL-1、5.16 μg·mL-1、10.32 μg·mL-1、15.48 μg·mL-1、20.64 μg·mL-1、25.8 μg·mL-1的胡椒碱对照品系列浓度溶液。精密量取上述各浓度的标准溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品峰面积Y为纵坐标，相应的对照的量X为横坐标，进行线性回归。得到胡椒碱回归方程为：Y=71998X，r=0.9993，表明胡椒碱在0.0103～0.2580 μg范围内具有良好的线性关系。 2.6 精密度试验 按2.3项下供试品溶液配制方法，精密称取内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，批号为20190223的样品约0.1012 g，配制成精密度试验溶液，精密吸取样品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，重复进样6次，测得峰面积的RSD值为0.36%，表明该方法精密度良好。
2.7 稳定性试验 精密称取内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，批号为20190223的样品约0.1012 g，按2.3项下供试品溶液制备方法配制稳定性试验溶液，室温放置，分别在0、1、3、6、12、24 h进样，记录谱图，测得峰面积。结果24 h内峰面积的RSD值为0.59%，表明该方法提取的样品溶液在24 h内基本稳定。
2.8 重复性试验 取内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，批号为20190223的样品6份，每份约0.1 g，精密称定，按2.3项下供试品溶液制备方法配制重复性试验溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，结果6份平行样的含量RSD值为1.48%。表明该方法重复性良好。
2.9 准确度及范围[7-8] 取已知含量的样品（内蒙古民族大学附屬医院蒙药制剂室提供的，批号为20190223）9份，每份约0.05 g，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，分别加入2.5项下胡椒碱对照品贮备液380 μL、650 μL、1105 μL，按2.3项下供试品溶液制备方法制成加标回收溶液，配制成高、中、低三个浓度的加样回收溶液，精密量取上述9份样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，结果见表1。三个浓度加标回收率平均值为99.86%，RSD值为0.76%。表明胡椒碱含量在1.9～5.7 μg·mL-1范围内测得的结果准确可靠。
2.10 不同色谱柱和仪器设备的耐用性试验 换不同厂家、不同型号的色谱柱及不同的液相色谱仪，取内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，批号为20190223的样品，精密称定，按2.3项下供试品溶液配制方法配制样品溶液，精密吸取该样品溶液和2.2项下的对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算样品中胡椒碱含量。结果见表2。
从表中数据可以看出，胡椒碱的含量变化不大（RSD值0.89%），表明该方法对不同色谱柱和仪器设备耐用性良好。3 样品含量测定[9-10]
分别取三个厂家提供的塔斯音-10样品粉末约0.1g，精密称定，按2.3项下供试品溶液制备方法提取制备样品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，测定结果见表3。
4 讨论
成药粉末以甲醇和无水乙醇作为提取溶剂进行超声提取（功率120 W，频率40 kHz），结果无水乙醇提取效率高于甲醇，故提取溶剂定为无水乙醇。为保证胡椒碱成分提取完全，实验中考察了超声提取15 min、30 min和60 min，结果胡椒碱的含量基本一致（RSD 0.31%），故提取时间定为30 min。
柱温对胡椒碱与其它干扰组分的分离度影响较大。柱温40 ℃时胡椒碱拖尾严重，与相邻干扰组分峰分离度变小（R值为1.218，小于1.5），分不开。柱温调整至30 ℃时，胡椒碱拖尾因子变小，与相邻组分分离度变大，分离较好（R值为1.653）。故将柱温设定为30 ℃。
本实验通过专属性、精密度、稳定性、重复性试验、不同色谱柱及仪器设备的耐用性考察，结果表明该方法准确可靠，可作为塔斯音-10中胡椒碱含量测定的方法。
参考文献
[1]内蒙古医学院中医系.蒙医金匮蒙文版[G].呼和浩特：内蒙古人民出版，1978：82.
[2]内蒙古自治区卫生厅.内蒙古蒙成药标准[M].呼和浩特：内蒙古科学技术出版社，1984.
[3]乔佛晓，禹玉洪，李燕.荜茇的药理作用与毒性作用研究概述[J].环球中医药，2015，8（4）：507-512.
[4]李秦.荜茇化学成分及药理作用研究进展[J].中国伤残医学，2013，6（11）：457-458.
[5]国家药典委员.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：235.
[6]薄彧坤，赵国君，杨 丹. 荜拨中胡椒碱的提取方法研究[J].北方药学， 2016，11（13）：120-121.
[7]张丽萍，韩 怡，施晓卉，等. HPLC 法同时测定荜茇-大黄中 6 种成分的含量[J].实用药物与临床，2020，7（23）：628-631.
[8]徐 僮，杜欢，李琪，等. HPLC 法同时测定六味木香丸中4种成分[J].中成药，2019，10（41）：2315-2318.
[9]潘 遐，才让草，李 魁，等. HPLC 法测定藏药石榴莲花散中鞣花酸和胡椒碱的含量[J].中国民族民间医药，2019，19（28）：37-41.
[10]闫凤杰，关金凤. RP-HPLC法测定苏格木勒-3汤中胡椒碱的含量[J].中国民族民间医药，2012（13）：35-36.
（收稿日期：2020-11-05 编辑：刘 斌）