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[摘要]目的探讨串联质谱技术在东莞地区筛查先天性遗传代谢病的应用价值，为先天性遗传代谢病的临床诊断提供实验室依据。方法采用干血滴滤纸片法将患儿血液标本滴于采血纸片形成血斑，自然风干后应用APl3200串联质谱仪进行检测。结果在1206例遗传代谢病高危儿的检测中，筛查出高瓜氨酸血症12例，Citrin缺陷病4例，丙酸血症4例，戊二酸血症2例，高精氨酸血症3例，脂肪酸代谢异常6例（其中短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症2例，中短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，肉碱棕榈酰转移酶一Ⅱ缺乏症1例多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例），多种氨基酸代谢异常症2例，尿素循环障碍症2例，同型半胱氨酸尿症1例，高甲硫胺酸血症5例，苯丙酮尿症5例，高苯丙氨酸血症5例。结论串联质谱技术具有高效快捷并可实现标准化自动化操作等优点，在先天性遗传代谢病早期诊断方面有重要应用价值。
[关键词]串联质谱；遗传代谢病；筛查；东莞地区
[中图分类号]R722.1
[文献标识码]B
[文章编号]2095-0616（2016）03-167-04
遗传代谢病，又称先天性代谢异常（inbornerrors of metabolism，IEM），是指由于基因突变引起机体各类的缺陷或功能异常，使机体生化代谢发生改变，从而出现一系列相对应的机体生理变化和临床症状。近年来，随着人民生活水平的提高和医
[基金项目]广东省东莞市科技计划项目（2012105150130266）。学科技的日益发展，很多非遗传因素造成的疾病得到了控制，而遗传因素在疾病构成中则日益突出。因此，解决先天性遗传代谢病高危患儿的问题不容忽视。传统的IEM检测方法（如Guthrie细菌抑制法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附试验等）都属于“一种试验检测一种疾病”。自1990年Millington等首次将串联质谱技术应用于新生儿遗传病筛查以来，经过20多年的发展，串联质谱已经发展成为IEM筛查诊断中最理想的朝阳技术。利用高灵敏性、高特异性和快速检测的串联质谱技术，能在2min内通过同时测定同一生物样品中多种目标代谢物，实现一次实验即可检测出包括因氨基酸、有机酸代谢紊乱、脂肪酸氧化缺陷而导致的数十种遗传代谢性疾病。将串联质谱技术应用于遗传代谢病的筛查，有助于IEM的早期诊断和治疗。本研究应用串联质谱技术对东莞市2011年9月～2014年12月的1206例IEM高危患儿进行了筛查，现报道如下。
1.资料与方法
1.1一般资料
2011年9月～2014年12月来东莞市妇幼保健院进行IEM检查的疑似患儿共1206例，其中男829例，女377例，年龄为1d～12岁，中位年龄2.5岁。疑似IEM患儿具体表现为早产儿黄疸、心功能不全、脑功能障碍、肝内胆汁淤积、反复呕吐、高乳酸、低血糖、智障、脑瘫及器官功能损伤等。
1.2研究方法
1.2.1标本采集标本采集采用干血滴滤纸片法，采血部位可以是指端、足跟及耳垂。具体方法为：将患儿血标本滴于采血纸片形成一个或数个均匀血斑，自然风干后上机检测。
1.2.2标本保存标本如不能及时检测应密封_于20°C冰箱中待检。
1.2.3仪器
采用美国生物应用系统公司（Applied Biosysterms）的APl3200串联质谱仪。
1.2.4试剂、材料盐酸正丁醇（3mol/L）由正丁醇和乙酰氯按9：1配制。氮气纯度为99.999%。96孔聚丙烯板，96孔过滤板（滤膜孔径0.45um）。甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等纯度均为高效液相色谱级。以上试剂及材料均购自德国Merck Millipore公司。
1.3测足方法
1.3.1样品处理采用足跟或指端采血，滴于滤纸使之形成直径>lcm的血斑，用打孔器将血斑制成直径3mm的圆形滤纸血片，置于96孔过滤板中，每孔加入100uL含氨基酸和酰基肉碱同位素内标液的甲醇，室温放置20min，然后离心至另一个96孔聚丙烯板，50°C加热吹干，再加入60uL盐酸正丁醇（3mol/L），Teflon膜覆盖，置65℃恒温箱内15min，随后50℃加热吹干，再加入80%乙腈100uL溶解，铝膜覆盖，即可上样检测。
1.3.2资料分析数据分析采用美国生物应用系统公司分析软件Chemo View 2.0。根据已知浓度的同位素内标和各种丁酯化的氨基酸和酰基肉碱的离子峰强度，仪器可自动计算出所测样品中氨基酸和酰基肉碱的浓度，然后进行临床分析。
1.3.3质量控制
凡是第一次检钡IEM得儿童显示阳性异常，排除了人工误差和实验室误差之后，再用原血片重新检测一遍，如果2次IEM筛查的结果都超出了参考值范围，那该标本的IEM检测结果为阳性。本院新生儿疾病筛查中心参加了美国疾病控制中心专项质量保证和定期进行实验室间的实验比对。串联质谱仪操作人员、数据分析人员及诊疗人员曾多次到广州妇女儿童医疗中心进行专项培训进修，保证了串联质谱结果的准确性，保证了IEM疾病诊断分析的可信性，治疗的规范性。
2.结果
2.1检测阳性病例
检测疑似遗传代谢病高危患儿血片1206份，诊断遗传代谢病12种51例，检出率为4.23%。筛查出的遗传代谢病依次为：A，高瓜氨酸血症12例；B.Citrin缺陷病4例；c.丙酸血症4例；D.戊二酸血症2例；E.高精氨酸血症3例；F.脂肪酸代谢异常6例（其中已知浓度，中短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，肉碱棕榈酰转移酶-II缺乏症1例）；G.多种氨基酸代谢异常2例；H.尿素循环障碍2例；I.同型半胱氨酸尿症1例；J.高甲硫胺酸血症5例；K.苯丙酮尿症5例；L高苯丙氨酸血症5例。 2.2临床资料及临床表现
2.2.1发病年龄51例阳性病例中新生儿时期发病21例（41.18%），1～12月发病18例（35.29%），2～4岁发病8例（15.69%），>4岁发病4例（7.84%）。
2.2.2临床表现29例患儿脑功能障碍；14例早产儿黄疸、抽搐、昏迷；41例患儿喂养困难，出现反复呕吐或慢性迁延性腹泻的情况；5例患儿心力衰竭或心跳骤停（2例有易惊症状）；31例患儿肝脾肿大或肝硬变；26例患儿分别皮肤粗糙、干裂、脱皮且久治不愈以及伴有听力障碍或视神经萎缩、唇裂等器官发育畸形。见表1。3讨论
IEM的早期诊断对国民的健康保障重视程度息息相关，是衡量一个国家医学发展水平的重要指标。国家政府目前已将“提高出生人口素质、减少出生缺陷、优生促进工程”作为近期的人口国策。国内由于社会经济水平和医疗水平的制约，串联质谱的技术与国外相比还不是非常完善和成熟。但是近年国内很多发达地区已陆续开展了串联质谱技术应用于IEM的实验诊断，使我们的技术愈加成熟与完善，串联质谱检测已经成为筛查和诊断IEM的常规手段。
本文研究结果显示，东莞地区IEM检出率是4.23%（51/120 6），在病种分类中主要以氨基酸代谢异常及脂肪酸代谢异常为主，临床症状包括喂养困难、脑功能障碍、黄疸、心功能不全及相关畸形等。本研究就阳性率及病种分类均与邻近的惠州钟婉秀报道的4.07%（11/270）及主要病种为氨基酸代谢异常的结果接近，可能的原因是东莞市与惠州市外来人口众多，分别占总人口数量的77%及27%，人群比较混杂，所以发病率与其他地区也有所差别。本研究存在的问题是阳性病例偏少，且未能对所检测的患儿进行纵向的追踪观察。目前国内各地如广东广州、陕西西安、广西南宁、山东潍坊及福建泉州等地区报道的结果显示其检出率相差甚远，阳性率从1.0%～10.3%，而其病种构成比例则比较相近，以氨基酸及脂肪酸代谢异常为主，但临床症状表现复杂，且与其病种构成并无直接联系。综上IEM检出率相差甚远显示出其发病率有很强的地域性，是否因地区、民族不同造成检出率的差异尚需进一步研究。由于各地报道的结果中存在所检测的样本数及样本筛选标准不尽相同，普遍存在检测标本量及检出的病例过少的问题，造成各地区统计的阳性率可比性不高，这也是各地相关医疗工作者在统计实验数据时应该关注的实际问题。
目前国内不少地区已在逐步开展串联质谱技术在IEM中的应用，随着串联质谱技术不断成熟及经济实力不断发展，相信IEM的治疗会全面普及和标准化，让IEM患儿得到早期诊断和及时治疗，从而避免或减轻疾病的危害。
[关键词]串联质谱；遗传代谢病；筛查；东莞地区
[中图分类号]R722.1
[文献标识码]B
[文章编号]2095-0616（2016）03-167-04
遗传代谢病，又称先天性代谢异常（inbornerrors of metabolism，IEM），是指由于基因突变引起机体各类的缺陷或功能异常，使机体生化代谢发生改变，从而出现一系列相对应的机体生理变化和临床症状。近年来，随着人民生活水平的提高和医
[基金项目]广东省东莞市科技计划项目（2012105150130266）。学科技的日益发展，很多非遗传因素造成的疾病得到了控制，而遗传因素在疾病构成中则日益突出。因此，解决先天性遗传代谢病高危患儿的问题不容忽视。传统的IEM检测方法（如Guthrie细菌抑制法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附试验等）都属于“一种试验检测一种疾病”。自1990年Millington等首次将串联质谱技术应用于新生儿遗传病筛查以来，经过20多年的发展，串联质谱已经发展成为IEM筛查诊断中最理想的朝阳技术。利用高灵敏性、高特异性和快速检测的串联质谱技术，能在2min内通过同时测定同一生物样品中多种目标代谢物，实现一次实验即可检测出包括因氨基酸、有机酸代谢紊乱、脂肪酸氧化缺陷而导致的数十种遗传代谢性疾病。将串联质谱技术应用于遗传代谢病的筛查，有助于IEM的早期诊断和治疗。本研究应用串联质谱技术对东莞市2011年9月～2014年12月的1206例IEM高危患儿进行了筛查，现报道如下。
1.资料与方法
1.1一般资料
2011年9月～2014年12月来东莞市妇幼保健院进行IEM检查的疑似患儿共1206例，其中男829例，女377例，年龄为1d～12岁，中位年龄2.5岁。疑似IEM患儿具体表现为早产儿黄疸、心功能不全、脑功能障碍、肝内胆汁淤积、反复呕吐、高乳酸、低血糖、智障、脑瘫及器官功能损伤等。
1.2研究方法
1.2.1标本采集标本采集采用干血滴滤纸片法，采血部位可以是指端、足跟及耳垂。具体方法为：将患儿血标本滴于采血纸片形成一个或数个均匀血斑，自然风干后上机检测。
1.2.2标本保存标本如不能及时检测应密封_于20°C冰箱中待检。
1.2.3仪器
采用美国生物应用系统公司（Applied Biosysterms）的APl3200串联质谱仪。
1.2.4试剂、材料盐酸正丁醇（3mol/L）由正丁醇和乙酰氯按9：1配制。氮气纯度为99.999%。96孔聚丙烯板，96孔过滤板（滤膜孔径0.45um）。甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等纯度均为高效液相色谱级。以上试剂及材料均购自德国Merck Millipore公司。
1.3测足方法
1.3.1样品处理采用足跟或指端采血，滴于滤纸使之形成直径>lcm的血斑，用打孔器将血斑制成直径3mm的圆形滤纸血片，置于96孔过滤板中，每孔加入100uL含氨基酸和酰基肉碱同位素内标液的甲醇，室温放置20min，然后离心至另一个96孔聚丙烯板，50°C加热吹干，再加入60uL盐酸正丁醇（3mol/L），Teflon膜覆盖，置65℃恒温箱内15min，随后50℃加热吹干，再加入80%乙腈100uL溶解，铝膜覆盖，即可上样检测。
1.3.2资料分析数据分析采用美国生物应用系统公司分析软件Chemo View 2.0。根据已知浓度的同位素内标和各种丁酯化的氨基酸和酰基肉碱的离子峰强度，仪器可自动计算出所测样品中氨基酸和酰基肉碱的浓度，然后进行临床分析。
1.3.3质量控制
凡是第一次检钡IEM得儿童显示阳性异常，排除了人工误差和实验室误差之后，再用原血片重新检测一遍，如果2次IEM筛查的结果都超出了参考值范围，那该标本的IEM检测结果为阳性。本院新生儿疾病筛查中心参加了美国疾病控制中心专项质量保证和定期进行实验室间的实验比对。串联质谱仪操作人员、数据分析人员及诊疗人员曾多次到广州妇女儿童医疗中心进行专项培训进修，保证了串联质谱结果的准确性，保证了IEM疾病诊断分析的可信性，治疗的规范性。
2.结果
2.1检测阳性病例
检测疑似遗传代谢病高危患儿血片1206份，诊断遗传代谢病12种51例，检出率为4.23%。筛查出的遗传代谢病依次为：A，高瓜氨酸血症12例；B.Citrin缺陷病4例；c.丙酸血症4例；D.戊二酸血症2例；E.高精氨酸血症3例；F.脂肪酸代谢异常6例（其中已知浓度，中短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，肉碱棕榈酰转移酶-II缺乏症1例）；G.多种氨基酸代谢异常2例；H.尿素循环障碍2例；I.同型半胱氨酸尿症1例；J.高甲硫胺酸血症5例；K.苯丙酮尿症5例；L高苯丙氨酸血症5例。 2.2临床资料及临床表现
2.2.1发病年龄51例阳性病例中新生儿时期发病21例（41.18%），1～12月发病18例（35.29%），2～4岁发病8例（15.69%），>4岁发病4例（7.84%）。
2.2.2临床表现29例患儿脑功能障碍；14例早产儿黄疸、抽搐、昏迷；41例患儿喂养困难，出现反复呕吐或慢性迁延性腹泻的情况；5例患儿心力衰竭或心跳骤停（2例有易惊症状）；31例患儿肝脾肿大或肝硬变；26例患儿分别皮肤粗糙、干裂、脱皮且久治不愈以及伴有听力障碍或视神经萎缩、唇裂等器官发育畸形。见表1。3讨论
IEM的早期诊断对国民的健康保障重视程度息息相关，是衡量一个国家医学发展水平的重要指标。国家政府目前已将“提高出生人口素质、减少出生缺陷、优生促进工程”作为近期的人口国策。国内由于社会经济水平和医疗水平的制约，串联质谱的技术与国外相比还不是非常完善和成熟。但是近年国内很多发达地区已陆续开展了串联质谱技术应用于IEM的实验诊断，使我们的技术愈加成熟与完善，串联质谱检测已经成为筛查和诊断IEM的常规手段。
本文研究结果显示，东莞地区IEM检出率是4.23%（51/120 6），在病种分类中主要以氨基酸代谢异常及脂肪酸代谢异常为主，临床症状包括喂养困难、脑功能障碍、黄疸、心功能不全及相关畸形等。本研究就阳性率及病种分类均与邻近的惠州钟婉秀报道的4.07%（11/270）及主要病种为氨基酸代谢异常的结果接近，可能的原因是东莞市与惠州市外来人口众多，分别占总人口数量的77%及27%，人群比较混杂，所以发病率与其他地区也有所差别。本研究存在的问题是阳性病例偏少，且未能对所检测的患儿进行纵向的追踪观察。目前国内各地如广东广州、陕西西安、广西南宁、山东潍坊及福建泉州等地区报道的结果显示其检出率相差甚远，阳性率从1.0%～10.3%，而其病种构成比例则比较相近，以氨基酸及脂肪酸代谢异常为主，但临床症状表现复杂，且与其病种构成并无直接联系。综上IEM检出率相差甚远显示出其发病率有很强的地域性，是否因地区、民族不同造成检出率的差异尚需进一步研究。由于各地报道的结果中存在所检测的样本数及样本筛选标准不尽相同，普遍存在检测标本量及检出的病例过少的问题，造成各地区统计的阳性率可比性不高，这也是各地相关医疗工作者在统计实验数据时应该关注的实际问题。
目前国内不少地区已在逐步开展串联质谱技术在IEM中的应用，随着串联质谱技术不断成熟及经济实力不断发展，相信IEM的治疗会全面普及和标准化，让IEM患儿得到早期诊断和及时治疗，从而避免或减轻疾病的危害。