【摘 要】
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目的 建立一种特异性强,灵敏度高,操作简便的呼吸道腺病毒榆测方法 ,为临床呼吸道腙病毒通用特异诊断试剂的研发奠定实验基础.方法 用生物信息学软件DNAMAN 5.2.2,Gene Runne
【机 构】
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哈尔滨医科大学公共卫生学院卫生微生物学教研室
【基金项目】
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黑龙江省自然科学基金;高等学校博士学科点专项科研项目;国家自然科学基金
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目的 建立一种特异性强,灵敏度高,操作简便的呼吸道腺病毒榆测方法 ,为临床呼吸道腙病毒通用特异诊断试剂的研发奠定实验基础.方法 用生物信息学软件DNAMAN 5.2.2,Gene Runner 3.05,BLAST对GenBank中已收录的10个型别人呼吸道腺病毒核酸伞序列进行比对分析,找出高度保守序列,设计5对腺病毒通用特异引物,同时确保PCR产物具有型别特异性.用NP-40裂解法制备模板,对引物的有效性,特异性及灵敏性进行验证,并应用于64例急性呼吸道感染患儿咽拭子标本的榆测,阳性标本的PCR产物直接测序鉴定血清型.将阳性标本接种HeLa细胞,光镜下观察细胞病变,电镜下观察病毒形态.结果 BLAST结果 表明,5对引物与其他病毒,细菌及人类基因组等无高度同源性,是腺病毒特异性引物.用5对引物扩增人3型腺病毒DNA,均出现阳性H的条带,但不能检测呼吸道合胞病毒柯萨奇病毒,验证了引物的有效性和腺病毒特异性.模板稀释,病毒稀释均可检测列10-5梯度,说明引物具有较高的灵敏性,同时验证了NP-40裂解法的稳定性.64例临床叫拭子标本中检测出2例阳性标本,阳性率为3.13%(2/64).阳性标本接种HeLa细胞,光镜下可见细胞变圆,聚集成葡萄串状,脱落等腺病毒所致细胞病变,电镜下可见细胞核内有典型的晶格状排列的腺病毒颗粒.PCR产物测序结果 表明,2株病毒均为B组腺病毒.结论 成功设计了腺病毒通用的,特异的,同时扩增产物又具有腺病毒型别特异性的引物.用该引物建立的PCR方法 检测呼吸道标本中的腺病毒DNA具有灵敏和特异的特点,适用丁临床常规诊断腺病毒感染.
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