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文章编号：10081542（2014）02014905doi：10.7535/hbkd.2014yx02007
摘要：为了便于检测和纯化转染到非肌肉细胞的生肌因子MyoD，同时为能够与转染的其他生肌因子的表达量进行比较，将MyoD编码区克隆在真核表达载体pcDNA3.1（+）HAHis。测序表明克隆的MyoD序列正确，并与标签序列构成一个开放阅读框；Western blot显示在起始密码子前添加kozak序列GCCGCCACC，可使融合蛋白能够以较高水平表达；生肌转化实验表明，融合蛋白MyoDHA能够有效激活靶基因的表达。
关键词：表达载体；标签；MyoD
中图分类号：Q753 文献标志码：A
Abstract：In order to conveniently detect and purify the myogenic factor MyoD exoexpressed in the nonmuscle cells， and to compare with the expression level of other myogenic factors cotransfected with MyoD， the coding sequence （CDS） of MyoD was cloned and inserted into pcDNA3.1（+）HAHis， an eukarytic expression vector. Sequencing result confirms that the insert is correct and forms the same ORF with the HA and its sequences. Furthermore， Western blot shows that the fusion protein MyoDHA expresses with a high level for the addition of kozak sequence GCCGCCACC，and myogenic conversion demonstrates the fusion protein MyoDHA can activate the target genes effectively.
Key words： expression vector； tag； MyoD
生肌作用（myogenesis）是指多能干细胞经过定向和分化，成为肌细胞，肌细胞之间相互融合为肌管，形成肌纤维的过程。整个过程由生肌因子特异地控制肌特异基因的转录而实现，鉴于此，生肌作用长期以来一直被用做研究真核生物基因表达调控的模式过程[14]。
哺乳动物中生肌调节因子有4种：MyoD，Myf5，MRF4和Myogenin，前3个因子均负责把多能干细胞定向为单能的成肌细胞，Myogenin则是在终末分化阶段发挥作用[1，510]。这4种生肌因子是转录调控因子[1113]。分子水平研究表明，MyoD单独作用便可激活早期肌特异基因。晚期肌特异基因要转录，需先由MyoD结合其调控区域，再由Myogenin替换MyoD；由于这样的一个前馈回路，使得这些基因的表达较晚[14]，在这一过程中Myogenin促进晚期基因的染色质重塑[15]。
为了进一步探讨MyoD和Myogenin在调控基因表达时的作用及彼此的关系，我们需要在成纤维细胞中表达带有标签的MyoD融合蛋白。一方面这样的蛋白易于检测和纯化，另一方面当跟其他含有同样标签的生肌因子共转染时，有助于衡量不同生肌因子的表达量，而这有助于研究生肌因子作用于靶基因时的相互关系。为准确表达这样的MyoD融合蛋白，本实验选取含有标签HA和His的pcDNA3.1（+）作为目的载体，用以克隆小鼠MyoD的编码区域。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
小鼠的成肌细胞C2C12、成纤维细胞C3H10T1/2和真核表达载体pcDNA3.1（+）HAHis（本室保存）；感受态细菌Trans1T1、高保真Taq（全式金生物技术有限公司提供）；逆转录酶MMLV、转染试剂Lipo 2000和TRIZOL（Invitrogen公司提供）；限制内切酶BamH I和Xho I（宝生物公司提供）；热敏磷酸酶（NEB公司提供）；T4 DNA连接酶（5 U/μL）、普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根公司提供）；抗actin抗体和抗HA抗体（中杉公司提供）；氨苄青霉素（索莱宝公司提供）；扩增MyoD编码区域的引物上游5’GCTGGATCCAGGGCCGCCACCATGGAGCTTCTATCGCCGCCACT 3’，下游5’CGATCTCGAGAAGCACCTG ATAAATCG 3’（粗体为保护碱基，粗体下划线为酶切位点，粗斜体为Kozak序列）；检测基因表达的RTPCR引物序列如下：GAPDH上游5’ CAGCCTCGTCCCGTAGACA 3’，下游5’CGCTCCTGGAAGATGGTGAT 3’，Cdh15上游5’GGACCTTCGGGACAACAT 3’，下游5’CAGCCTCCAAGCCATCAC 3’，Myogenin上游5’GAAGCGCAGGCTCAAGAAAGT 3’，下游5’ GATTGTGGGCGTCTGTAGGGT 3’，MCK上游5’CATAAGACCGACCTCAACCACG 3’，下游5’AACCTCCTTCATATTGCCTCCCT 3’，引物和逆转录引物oligo dT由北京六合华大公司合成。
细胞液体基本培养基由粉末状的DMEM培养基（GIBCO公司提供）配制；完全培养基为基本培养基添加体积分数10%胎牛血清（Hyclone），分化培养基为基本培养基添加体积分数2%马血清（Hyclone）。 基因PCR扩增仪（BioRad公司提供）。
1.2 实验方法
成肌细胞C2C12和成纤维细胞C3H10T1/2细胞均以完全培养基培养，C2C12至80%的汇合率，换分化培养基培养24 h后提取RNA。10T1/2细胞转染前24 h铺板，转染后24 h分化，分化后48 h提取RNA。
利用oligo dT作为引物进行逆转录，产物稀释5倍作为高保真PCR模版，体系见表1。
扩增程序如下： 1）94 ℃预变性3 min，2）94 ℃变性30 s，3）55 ℃退火30 s，4）72 ℃延伸1 min，重复步骤2）—4），30次，5）72 ℃再延伸10 min。
酶切反应酶量不超过总酶切体系的1/10（体积比），37 ℃水浴，过夜。连接体系中的插入片段与目的载体的物质的量比为7∶1，连接体系为15 μL，DNA质量共200 ng，14～16 ℃，过夜。
切胶回收的样品以1.0%琼脂糖电泳估测浓度，上样量为3 μL。
蛋白质印迹法（Western blot）以12%的分离胶分离提取的蛋白，抗actin抗体按1∶10 000稀释，抗HA抗体按1∶5 000稀释。
2 结果与讨论
2.1 pcDNA3.1（+）MyoDHAHis的构建
首先以PCR方法扩增MyoD的编码区域，PCR产物经buffer转换后，以BamH I和Xho I双酶切。酶切产物以琼脂糖电泳分离，切胶回收目的片段。以10%的琼脂糖电泳估测回收片段的大小和浓度，结果如图1 a）所示。由图1 a）可见，目的条带（第2泳道）位于Marker （DL2 000）分子（第1泳道）的1 000 bp条带附近，长度吻合预期，粗略估测质量浓度为65 ng/μL。
同时，以BamH I和Xho I双酶切pcDNA3.1（+）HAHis空载体。尽管是双酶切，但空载体上BamH I和Xho I之间相距约20个碱基左右，双酶切时可能由于存在空间位阻，影响酶切效果，而酶切不充分所形成的单酶切产物与充分酶切的正确产物相差很小，无法通过琼脂糖电泳分辨。这样，切胶回收的产物中就会混有单酶切产物，而这种线性载体在连接时极易自身环化，给转化子筛选带来极大干扰。所以，对酶切产物进行Buffer转换，再使用碱性磷酸酶处理，去除其5’磷酸[16]。产物以琼脂糖电泳分离，切胶回收线性空载体。电泳估测回收的载体的大小和浓度，结果见图1 b），目的条带（第2泳道）位于Marker （DL15 000）分子5 000 bp条带稍微靠上，长度跟预期的5.5 kb吻合；估测质量浓度为30 ng/μL。
使用回收的MyoD和pcDNA3.1（+）HAHis构建连接体系，具体如下。
1.2Buffer1.5T4连接酶1.0去离子水0.3 将完成连接的体系转化感受态细菌，以氨苄青霉素选择性LB固体培养基平板筛选，挑取3个转化子，小提质粒。提取的质粒以BamH I和Xho I双酶切，产物以1.0%（质量分数）的琼脂糖电泳分离鉴定，结果如图1 c）。第2，4和6泳道是未酶切的质粒，下面的条带为超螺旋形式，上面条带为环状形式。第3，5和7泳道是双酶切产物，生成的片段大小与预期的载体和MyoD大小一致，表明3个质粒均为重组子，所以MyoD已成功克隆至pcDNA3.1（+）HAHis。3个质粒中没有自身环化的载体，说明空载体双酶切后磷酸化步骤十分必要。由于MyoD序列是采用PCR方法得到的，为防止在扩增时引入错误，选取第一个重组子测序。测序结果表明序列正确。而且，酶切位点正确；起始密码子前的Kozak序列正确；阅读框架正确，这是因为下游引物上对应MyoD编码区终止密码子的3个核苷酸被Xho I位点中的CTC取代，所以插入的MyoD编码序列没有终止密码子，跟编码HA和His的序列构成一个开放阅读框。
2.2 pcDNA3.1（+）MyoDHAHis编码产物的检测
尽管序列测定表明克隆的MyoD正确，但能否编码出正确蛋白产物还需鉴定。
为此，我们使用构建的载体转染成纤维细胞10T1/2，提取蛋白，Western blot检测是否含有HA标签的蛋白表达，结果见图2。
由图2可见，10T1/2细胞（第1泳道）没有内源性的目的蛋白MyoDHA表达，而转染了pcDNA3.1（+）MyoDHAHis的细胞有效表达目的蛋白MyoDHA（第2泳道）有效表达，这表明MyoD翻译时通读，翻译出了下游的HA标签序列，实现了构建含有HA标签的融合蛋白的目的。而且，鉴于kozak序列对于翻译的重要性[17]，我们在克隆的序列起始密码子ATG之前添加了GCCGCCACC，由图2可见，目的蛋白表达水平较高。另一次独立的实验（文中未列出）表明，即使把ATG之前的27个碱基一起克隆，若不添加GCCGCCACC，目的蛋白仍不能有效表达。所以，这段人工的Kozak序列的使用对于克隆基因的表达十分重要，是保证翻译水平的可行方法。
3 结 语
本实验构建了能使目的蛋白MyoD易于检测、纯化，也易于跟其他共转染的生肌因子进行量的比较的真核表达载体pcDNA3.1（+）MyoDHAHis。结果显示，扩增的序列正确，而且跟HA和His的序列构成一个开放阅读框。Western blot表明构建的载体能够正确表达融合蛋白MyoDHA。转染实验显示，融合蛋白可以有效激活肌特异基因的表达。同时，实验也表明，空载体双酶切后的去磷酸化步骤对于提高重组子筛选的成功率很有必要；克隆目的片段时，起始密码子ATG前添加的GCCGCCACC有效地保证了目的蛋白的翻译水平。
参考文献/References：
[1] DAVIS R L， WEINTRAUB H， LASSAR A B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts[J]. Cell， 1987， 51（6）： 9871000. [2] BERGSTROM D A， PENN B H， STRAND A， et al. Promoterspecific regulation of MyoD binding and signal transduction cooperate to pattern gene expression[J]. Molecular Cell， 2002， 9（3）： 587600.
[3] MAGENTA A， CENCIARELLI C， de SANTA F， et al. MyoD stimulates RB promoter activity via the CREB/p300 nuclear transduction pathway[J]. Molecular and Cellular Biology， 2003， 23（8）： 28932906.
[4] ANDRS V， WALSH K. Myogenin expression， cell cycle withdrawal， and phenotypic differentiation are temporally separable events that precede cell fusion upon myogenesis[J]. Journal of Cell Biology， 1996， 132（4）： 657666.
[5] EDMONDSON D G， OLSON E N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program[J]. Genes & Development， 1989， 3（5）： 628640.
[6] WRIGHT W E， SASSOON D A， LIN V K. Myogenin， a factor regulating myogenesis， has a domain homologous to MyoD[J]. Cell， 1989， 56（4）： 607617.
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[8] KASSARDUCHOSSOY L， GAYRAUDMOREL B， GOMS D， et al. Mrf4 determines skeletal muscle identity in Myf5：Myod doublemutant mice[J]. Nature， 2004， 431（77）： 466471.
[9] KABLAR B， KRASTEL K， YING C， et al. MyoD and Myf5 differentially regulate the development of limb versus trunk skeletal muscle[J]. Development， 1997， 124（23）： 47294738.
[10] KITZMANN M， CARNAC G， VANDROMME M， et al. The muscle regulatory factors MyoD and Myf5 undergo distinct cell cyclespecific expression in muscle cells[J]. Journal of Cell Biology， 1998， 142（6）： 14471459.
[11] TAPSCOTT S J. The circuitry of a master switch： MyoD and the regulation of skeletal muscle gene transcription[J]. Development， 2005， 132（12）： 26852695.
[12] BLAIS A， TSIKITIS M， ACOSTAALVEAR D， et al. An initial blueprint for myogenic differentiation[J]. Genes & Development， 2005， 19（5）： 553569.
[13] GERBER A N， KLESERT T R， BERGSTROM D A， et al. Two domains of MyoD mediate transcriptional activation of genes in repressive chromatin： A mechanism for lineage determination in myogenesis[J]. Genes & Development， 1997， 11（4）： 436450.
[14] PENN B H， BERGSTROM D A， DILWORTH F J， et al. A MyoDgenerated feedforward circuit temporally patterns gene expression during skeletal muscle differentiation[J]. Genes & Development， 2004， 18（19）： 23482353.
[15] DU Chao， JIN Yaqiong， QI Junjuan， et al. Effects of myogenin on expression of late muscle genes through MyoDdependent chromatin remodeling ability of myogenin[J]. Molecules and Cells， 2012， 34（2）： 133142.
[16] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔 D W.分子克隆实验指南[M]. 第3版. 黄培堂，等译.北京：科学出版社， 2002.
SAMBROOK J， RUSSALL D W. Molecular Cloning： A Laboratory Mannual[M].3rd ed. Translated by HUANG Peitang，et al.Beijing： Science Press， 2002.
[17] KOZAK M. How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA？ [J]. Cell，1978，15（4）：11091123.
摘要：为了便于检测和纯化转染到非肌肉细胞的生肌因子MyoD，同时为能够与转染的其他生肌因子的表达量进行比较，将MyoD编码区克隆在真核表达载体pcDNA3.1（+）HAHis。测序表明克隆的MyoD序列正确，并与标签序列构成一个开放阅读框；Western blot显示在起始密码子前添加kozak序列GCCGCCACC，可使融合蛋白能够以较高水平表达；生肌转化实验表明，融合蛋白MyoDHA能够有效激活靶基因的表达。
关键词：表达载体；标签；MyoD
中图分类号：Q753 文献标志码：A
Abstract：In order to conveniently detect and purify the myogenic factor MyoD exoexpressed in the nonmuscle cells， and to compare with the expression level of other myogenic factors cotransfected with MyoD， the coding sequence （CDS） of MyoD was cloned and inserted into pcDNA3.1（+）HAHis， an eukarytic expression vector. Sequencing result confirms that the insert is correct and forms the same ORF with the HA and its sequences. Furthermore， Western blot shows that the fusion protein MyoDHA expresses with a high level for the addition of kozak sequence GCCGCCACC，and myogenic conversion demonstrates the fusion protein MyoDHA can activate the target genes effectively.
Key words： expression vector； tag； MyoD
生肌作用（myogenesis）是指多能干细胞经过定向和分化，成为肌细胞，肌细胞之间相互融合为肌管，形成肌纤维的过程。整个过程由生肌因子特异地控制肌特异基因的转录而实现，鉴于此，生肌作用长期以来一直被用做研究真核生物基因表达调控的模式过程[14]。
哺乳动物中生肌调节因子有4种：MyoD，Myf5，MRF4和Myogenin，前3个因子均负责把多能干细胞定向为单能的成肌细胞，Myogenin则是在终末分化阶段发挥作用[1，510]。这4种生肌因子是转录调控因子[1113]。分子水平研究表明，MyoD单独作用便可激活早期肌特异基因。晚期肌特异基因要转录，需先由MyoD结合其调控区域，再由Myogenin替换MyoD；由于这样的一个前馈回路，使得这些基因的表达较晚[14]，在这一过程中Myogenin促进晚期基因的染色质重塑[15]。
为了进一步探讨MyoD和Myogenin在调控基因表达时的作用及彼此的关系，我们需要在成纤维细胞中表达带有标签的MyoD融合蛋白。一方面这样的蛋白易于检测和纯化，另一方面当跟其他含有同样标签的生肌因子共转染时，有助于衡量不同生肌因子的表达量，而这有助于研究生肌因子作用于靶基因时的相互关系。为准确表达这样的MyoD融合蛋白，本实验选取含有标签HA和His的pcDNA3.1（+）作为目的载体，用以克隆小鼠MyoD的编码区域。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
小鼠的成肌细胞C2C12、成纤维细胞C3H10T1/2和真核表达载体pcDNA3.1（+）HAHis（本室保存）；感受态细菌Trans1T1、高保真Taq（全式金生物技术有限公司提供）；逆转录酶MMLV、转染试剂Lipo 2000和TRIZOL（Invitrogen公司提供）；限制内切酶BamH I和Xho I（宝生物公司提供）；热敏磷酸酶（NEB公司提供）；T4 DNA连接酶（5 U/μL）、普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根公司提供）；抗actin抗体和抗HA抗体（中杉公司提供）；氨苄青霉素（索莱宝公司提供）；扩增MyoD编码区域的引物上游5’GCTGGATCCAGGGCCGCCACCATGGAGCTTCTATCGCCGCCACT 3’，下游5’CGATCTCGAGAAGCACCTG ATAAATCG 3’（粗体为保护碱基，粗体下划线为酶切位点，粗斜体为Kozak序列）；检测基因表达的RTPCR引物序列如下：GAPDH上游5’ CAGCCTCGTCCCGTAGACA 3’，下游5’CGCTCCTGGAAGATGGTGAT 3’，Cdh15上游5’GGACCTTCGGGACAACAT 3’，下游5’CAGCCTCCAAGCCATCAC 3’，Myogenin上游5’GAAGCGCAGGCTCAAGAAAGT 3’，下游5’ GATTGTGGGCGTCTGTAGGGT 3’，MCK上游5’CATAAGACCGACCTCAACCACG 3’，下游5’AACCTCCTTCATATTGCCTCCCT 3’，引物和逆转录引物oligo dT由北京六合华大公司合成。
细胞液体基本培养基由粉末状的DMEM培养基（GIBCO公司提供）配制；完全培养基为基本培养基添加体积分数10%胎牛血清（Hyclone），分化培养基为基本培养基添加体积分数2%马血清（Hyclone）。 基因PCR扩增仪（BioRad公司提供）。
1.2 实验方法
成肌细胞C2C12和成纤维细胞C3H10T1/2细胞均以完全培养基培养，C2C12至80%的汇合率，换分化培养基培养24 h后提取RNA。10T1/2细胞转染前24 h铺板，转染后24 h分化，分化后48 h提取RNA。
利用oligo dT作为引物进行逆转录，产物稀释5倍作为高保真PCR模版，体系见表1。
扩增程序如下： 1）94 ℃预变性3 min，2）94 ℃变性30 s，3）55 ℃退火30 s，4）72 ℃延伸1 min，重复步骤2）—4），30次，5）72 ℃再延伸10 min。
酶切反应酶量不超过总酶切体系的1/10（体积比），37 ℃水浴，过夜。连接体系中的插入片段与目的载体的物质的量比为7∶1，连接体系为15 μL，DNA质量共200 ng，14～16 ℃，过夜。
切胶回收的样品以1.0%琼脂糖电泳估测浓度，上样量为3 μL。
蛋白质印迹法（Western blot）以12%的分离胶分离提取的蛋白，抗actin抗体按1∶10 000稀释，抗HA抗体按1∶5 000稀释。
2 结果与讨论
2.1 pcDNA3.1（+）MyoDHAHis的构建
首先以PCR方法扩增MyoD的编码区域，PCR产物经buffer转换后，以BamH I和Xho I双酶切。酶切产物以琼脂糖电泳分离，切胶回收目的片段。以10%的琼脂糖电泳估测回收片段的大小和浓度，结果如图1 a）所示。由图1 a）可见，目的条带（第2泳道）位于Marker （DL2 000）分子（第1泳道）的1 000 bp条带附近，长度吻合预期，粗略估测质量浓度为65 ng/μL。
同时，以BamH I和Xho I双酶切pcDNA3.1（+）HAHis空载体。尽管是双酶切，但空载体上BamH I和Xho I之间相距约20个碱基左右，双酶切时可能由于存在空间位阻，影响酶切效果，而酶切不充分所形成的单酶切产物与充分酶切的正确产物相差很小，无法通过琼脂糖电泳分辨。这样，切胶回收的产物中就会混有单酶切产物，而这种线性载体在连接时极易自身环化，给转化子筛选带来极大干扰。所以，对酶切产物进行Buffer转换，再使用碱性磷酸酶处理，去除其5’磷酸[16]。产物以琼脂糖电泳分离，切胶回收线性空载体。电泳估测回收的载体的大小和浓度，结果见图1 b），目的条带（第2泳道）位于Marker （DL15 000）分子5 000 bp条带稍微靠上，长度跟预期的5.5 kb吻合；估测质量浓度为30 ng/μL。
使用回收的MyoD和pcDNA3.1（+）HAHis构建连接体系，具体如下。
1.2Buffer1.5T4连接酶1.0去离子水0.3 将完成连接的体系转化感受态细菌，以氨苄青霉素选择性LB固体培养基平板筛选，挑取3个转化子，小提质粒。提取的质粒以BamH I和Xho I双酶切，产物以1.0%（质量分数）的琼脂糖电泳分离鉴定，结果如图1 c）。第2，4和6泳道是未酶切的质粒，下面的条带为超螺旋形式，上面条带为环状形式。第3，5和7泳道是双酶切产物，生成的片段大小与预期的载体和MyoD大小一致，表明3个质粒均为重组子，所以MyoD已成功克隆至pcDNA3.1（+）HAHis。3个质粒中没有自身环化的载体，说明空载体双酶切后磷酸化步骤十分必要。由于MyoD序列是采用PCR方法得到的，为防止在扩增时引入错误，选取第一个重组子测序。测序结果表明序列正确。而且，酶切位点正确；起始密码子前的Kozak序列正确；阅读框架正确，这是因为下游引物上对应MyoD编码区终止密码子的3个核苷酸被Xho I位点中的CTC取代，所以插入的MyoD编码序列没有终止密码子，跟编码HA和His的序列构成一个开放阅读框。
2.2 pcDNA3.1（+）MyoDHAHis编码产物的检测
尽管序列测定表明克隆的MyoD正确，但能否编码出正确蛋白产物还需鉴定。
为此，我们使用构建的载体转染成纤维细胞10T1/2，提取蛋白，Western blot检测是否含有HA标签的蛋白表达，结果见图2。
由图2可见，10T1/2细胞（第1泳道）没有内源性的目的蛋白MyoDHA表达，而转染了pcDNA3.1（+）MyoDHAHis的细胞有效表达目的蛋白MyoDHA（第2泳道）有效表达，这表明MyoD翻译时通读，翻译出了下游的HA标签序列，实现了构建含有HA标签的融合蛋白的目的。而且，鉴于kozak序列对于翻译的重要性[17]，我们在克隆的序列起始密码子ATG之前添加了GCCGCCACC，由图2可见，目的蛋白表达水平较高。另一次独立的实验（文中未列出）表明，即使把ATG之前的27个碱基一起克隆，若不添加GCCGCCACC，目的蛋白仍不能有效表达。所以，这段人工的Kozak序列的使用对于克隆基因的表达十分重要，是保证翻译水平的可行方法。
3 结 语
本实验构建了能使目的蛋白MyoD易于检测、纯化，也易于跟其他共转染的生肌因子进行量的比较的真核表达载体pcDNA3.1（+）MyoDHAHis。结果显示，扩增的序列正确，而且跟HA和His的序列构成一个开放阅读框。Western blot表明构建的载体能够正确表达融合蛋白MyoDHA。转染实验显示，融合蛋白可以有效激活肌特异基因的表达。同时，实验也表明，空载体双酶切后的去磷酸化步骤对于提高重组子筛选的成功率很有必要；克隆目的片段时，起始密码子ATG前添加的GCCGCCACC有效地保证了目的蛋白的翻译水平。
参考文献/References：
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