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【摘要】目的：探究黄芪总黄酮提取的最优工艺参数。方法：基于单因素试验，以黄芪总黄酮提取率为评价指标，通过L9（34）正交试验法对影响黄芪总黄酮提取率的4个因素（乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间）进行考察，优选黄芪总黄酮提取工艺参数。结果：黄芪总黄酮提取的最优工艺参数为乙醇浓度90%、水浴温度80 ℃、料液比1∶12和提取时间2 h，在此条件下，黄芪总黄酮提取率为0.286%。结论：该提取工艺表现出操作简单、重复性稳定的特点，以期为黄芪资源的合理开发利用提供科学依据。
【关键词】黄芪;总黄酮;正交试验;提取工艺
【中图分类号】R285【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）9-0030-04
Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Radix Astragali by Orthogonal Design
LIANG Taishuai1ZHAO Xiaoqiong2FENG Mei1
1.College of Pharmacy， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2. Department of Environmental and Safety Engineering， Taiyuan Institute of Technology， Taiyuan 030008， China
Abstract：Objective Study on the optimal process parameters for extracting total flavonoids from radix Astragalus. Methods Based on the single factor test， with extraction rate of total flavonoids as indicators and ethanol concentration， water bath temperature， solid-liquid ratio，extraction time as investigated factors， orthogonal array design L9（34） experiments were projected to optimize the extraction process of total flavonoids from radix Astragalus. Results The results showed that the extraction rate of total flavonoids from radix Astragalustragalus was 0.286% with the optimal parameters that the solid-fulid ratio， ethanol concentration， water bath temperature and extracting time were 1∶12 g/mL， 90%， 80 ℃ and 2h. Conclusion The extraction process is feasible and stable which provide a scientific basis for the rational development and utilization of astragalus resources.
Key：words：Radix Astragali;Total Flavonoids; OrthogonalTest; Extraction Process
黃芪是山西的一种重要道地药材，始载于《神农本草经》，味甘、性温，具有补气固表、排脓降压、提高机体免疫力等功效，素有“十药八芪”之称[1]。黄酮类化合物是黄芪发挥功效的主要物质基础和有效部位，可作为抗氧化剂在清除活性氧自由基、抗菌消炎、延缓衰老、抗过敏等方面有着显著的药理活性，并已在临床防治老年高血压、冠心病和视网膜出血等疾病方面有着广泛的应用[2-3]。因此，优化黄芪总黄酮的提取工艺对其药理学作用的深入探究意义重大。本研究分别对乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间4个因素进行单因素试验，确定四因素三水平，设计L9（34）正交试验，考察黄芪总黄酮提取的最优工艺参数，以期为黄芪资源的合理开发以及临床应用提供科学依据。
1材料与方法
1.1试药蒙古黄芪药材饮片（山西浑源万生黄芪开发有限公司）;芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100080-201610）;95%乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等试剂均为分析纯。
1.2仪器电热鼓风干燥箱（GZX-9070MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;中药材粉碎机（FW177，天津市泰斯特仪器有限公司）;万分之一天平（BSA224S-CW，赛多利斯科学仪器北京有限公司）;数显恒温水浴锅（HH-2，国华电器有限公司）;循环水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ），上海予申仪器有限公司];紫外可见分光光度计（UV-1200，上海美谱达仪器有限公司）;低速大容量多管离心机（LXJ-IIB，上海安亭科学仪器厂）。
1.3方法
1.3.1芦丁标准曲线的制作芦丁标准曲线的制作参照张浩等[3]的方法，稍作改进：准确称取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品25 mg于100 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，得到质量浓度为0.25 mg/mL的芦丁标准液。分别准确吸取芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于7只10 mL容量瓶中，然后分别添加3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL的蒸馏水;再向各瓶内添加5%的NaNO2溶液 0.3 mL，混匀并静置6 min;继续添加10%的Al（NO3）2溶液 0.3 mL，混匀并静置6 min;再添加4%的NaOH溶液4 mL，最后用70%的乙醇定容至10 mL，混匀并静置12 min，依次在510 nm处测定各瓶内反应液的吸光值，以吸光值Y和芦丁质量浓度X分别作为纵坐标和横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y=0.6804X-0.0012，相关系数R2=0.9998。 1.3.2精密度试验准确吸取芦丁标准液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”项下方法测定吸光值，重复测定6次，计算出RSD为0.481%，表明精密度良好。
1.3.3稳定性试验供试品溶液制备[4]：将黄芪药材于60℃烘干至恒重，粉碎后过50目筛。精确称取黄芪粉末5 g于圆底烧瓶中，加入10倍量90%乙醇，70 ℃水浴下回流提取2次，每次2 h，趁热减压抽滤2次，合并滤液，5000 r/min离心5 min，上清液即为供试品溶液。
准确吸取供试品溶液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”项下方法分别于0、15、30、45、60、90、120 min测定吸光值，计算出RSD为1.176%，表明供试品溶液在2 h内稳定。
1.3.4 重复性试验精确称取黄芪粉末共6份，按照“1.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，各取1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”项下方法测定吸光值，计算出RSD为0.912%，表明此方法重复性较好。
1.3.5加样回收试验准确称取已知含量（5.198 mg/g）的黄芪粉末6份，各约2.5 g，按照“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，再分别精确加入适量芦丁标准液，混匀后按照“1.3.1”项下方法进行测定，计算出平均回收率为99.81%，RSD为0.805%。结果见表1。
1.3.6单因素试验根据参考文献和预试验结果分别设计以下单因素试验组合：①乙醇浓度为50%、60%、70%、80%和90%，水浴温度为70 ℃，料液比为1∶10，提取时间为2 h;②水浴温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，乙醇浓度为90%，料液比为1∶10，提取时间为2 h;③料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14，乙醇浓度为90%，水浴温度为70 ℃，提取时间为2 h;④提取时间为1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，乙醇浓度为90%，水浴温度为70 ℃，料液比为1∶10，分别考察以上各试验条件对黄芪总黄酮提取率的影响。
1.3.7 正交试验设计依据“1.3.3”项单因素试验结果，以黄芪总黄酮提取率为考量指标，设计L9（34）正交试验，选定的正交试验因素水平见表2。
1.4数据分析分别采用SPSS 18.0和Origin9.0软件进行正交试验数据分析检验和绘图。计算公式为[5]：
总黄酮提取率=（C×V）/（M×1000）×100
式中：C表示由标准曲线得到提取液中总黄酮的质量浓度（mg/mL），V表示滤液体积（mL），M表示黄芪粉末质量（g），×1000表示g与mg的单位转换。
2结果与分析
2.1单因素试验图1显示，随着乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间的增加，黄芪总黄酮的提取率均呈先升高后降低的趋势，且分别在乙醇浓度为80%、水浴温度为90 ℃、料液比为1∶10和提取时间为2.5 h时，总黄酮提取率达到最大值。因此，选择乙醇浓度70%、80%和90%，水浴温度为80 ℃、90 ℃和100 ℃，料液比为1∶8、1∶10和1∶12，提取时间为2 h、2.5 h和3 h进行正交试验。
2.2正交试验由表3中R值（极差）可知，对黄芪总黄酮提取率影响的主次因素依次为料液比、乙醇浓度、水浴温度和提取时间。从表中K1、K2、K3的大小分析得出，黄芪总黄酮的最优提取工艺参数为A3B1C3D1，即乙醇浓度为90%、水浴温度为80℃、料液比为1∶12、提取时间为2 h。此外，从表4方差分析结果可知，乙醇浓度（P<0.001）、水浴温度（P<0.01）、料液比（P<0.001）和提取时间（P<0.05）均显著影响黄芪总黄酮的提取率。
2.3验证试验为验证组合A3B1C3D1为最优提取方案，在此条件下，平行试验3次，试验结果见表5，可以看出，在此最优提取条件下，黄芪总黄酮的平均提取率为0.286%，均高于单因素试验和正交试验结果，验证了正交试验设计优化结果的准确性，表明该提取工艺参数A3B1C3D1（即乙醇浓度为90%、水浴温度为80℃、料液比为1∶12、提取时间为2 h）合理可行，为黄芪总黄酮最优提取方案。
3讨论
相比于微波辅助萃取法、超声波提取法、超临界CO2萃取法等，黄酮类物质的乙醇回流提取法操作简便、效率较高、溶剂可回收、运行成本低，能够同时兼顾提取效率和工业化生产[4，6]。本试验选择乙醇回流提取法进行黄芪总黄酮提取，通过单因素试验和正交试验相结合的方法研究乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间4个因素对黄芪总黄酮提取率的影响，并通过直观分析和方差分析综合考察，确定黄芪总黄酮提取的最优工艺参数[6]。单因素试验结果发现，黄芪总黄酮提取率均随乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间的增加呈先升高后降低趋势，表明影响总黄酮提取率的4个因素在选定范围内均存在显著最佳值，当各影响因素设定水平高于最佳值时，较高浓度的乙醇溶液使药材中的低极性杂质易于渗出[5]，造成类黄酮提取效率降低，高温可破坏类黄酮类化合物的分子结构[4]，而料液比和提取时间的增加又导致生产成本以及提取周期提高[7];反之，当各影响因素设定水平低于最佳值时，导致黄酮类物质的渗透、溶解和扩散效率降低[8]，浸提物提取不充分。
试验研究结果表明，对黄芪总黄酮提取率影响的主次因素依次为料液比>乙醇浓度>水浴温度>提取时间，同时总黄酮的最优提取工艺参数为A3B1C3D1，即乙醇浓度为90%、水浴温度为80℃、料液比为1∶12、提取时间为2 h，该提取条件下，黄芪总黄酮提取率为0.286%。此方法操作简便、稳定合理，可作为黄芪总黄酮的最优提取工艺参数。
参考文献
[1]秦雪梅， 李震宇， 孙海峰， 等. 我国黄芪药材资源现状与分析[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（19）：3234-3238.
[2]赵琦， 张军武. 正交试验法优选黄芪中总黄酮提取工艺[J]. 云南中医学院学报， 2012， 35（1）：27-29.
[3]张浩， 郝立华， 刘贵巧， 等. 正交实验优化酸枣黄酮类物质提取工艺及其体外抗氧化作用[J]. 北方园艺， 2018（3）：130-138.
[4]吕凤娇， 谢晓兰. 黄芪总黄酮乙醇提取工艺研究[J]. 安徽农业科学， 2012， 40（33）：16380-16382.
[5]李慧靜， 张庆庆， 陈建翔， 等. 超声波提取黄芪中总黄酮工艺研究[J]. 安徽工程大学学报， 2012，27（4）：12-15.
[6]许丹妮， 杨海玲， 黄欢， 等. 正交实验优化回流法提取五桠果叶木姜子叶总黄酮工艺研究[J]. 亚太传统医药， 2018，14（2）：56-58.
[7]帕塔尔·尼牙孜， 邱远金，王婷婷，等. 正交实验优化新疆沙棘果渣总黄酮的提取工艺[J]. 西北药学杂志， 2016，31（2）：119-121.
[8]谢蓝华， 杜冰， 叶琼娟， 等. 正交试验优化酶法提取黄芪总黄酮工艺[J]. 包装与食品机械， 2013， 31（3）：7-12.
【关键词】黄芪;总黄酮;正交试验;提取工艺
【中图分类号】R285【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）9-0030-04
Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Radix Astragali by Orthogonal Design
LIANG Taishuai1ZHAO Xiaoqiong2FENG Mei1
1.College of Pharmacy， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2. Department of Environmental and Safety Engineering， Taiyuan Institute of Technology， Taiyuan 030008， China
Abstract：Objective Study on the optimal process parameters for extracting total flavonoids from radix Astragalus. Methods Based on the single factor test， with extraction rate of total flavonoids as indicators and ethanol concentration， water bath temperature， solid-liquid ratio，extraction time as investigated factors， orthogonal array design L9（34） experiments were projected to optimize the extraction process of total flavonoids from radix Astragalus. Results The results showed that the extraction rate of total flavonoids from radix Astragalustragalus was 0.286% with the optimal parameters that the solid-fulid ratio， ethanol concentration， water bath temperature and extracting time were 1∶12 g/mL， 90%， 80 ℃ and 2h. Conclusion The extraction process is feasible and stable which provide a scientific basis for the rational development and utilization of astragalus resources.
Key：words：Radix Astragali;Total Flavonoids; OrthogonalTest; Extraction Process
黃芪是山西的一种重要道地药材，始载于《神农本草经》，味甘、性温，具有补气固表、排脓降压、提高机体免疫力等功效，素有“十药八芪”之称[1]。黄酮类化合物是黄芪发挥功效的主要物质基础和有效部位，可作为抗氧化剂在清除活性氧自由基、抗菌消炎、延缓衰老、抗过敏等方面有着显著的药理活性，并已在临床防治老年高血压、冠心病和视网膜出血等疾病方面有着广泛的应用[2-3]。因此，优化黄芪总黄酮的提取工艺对其药理学作用的深入探究意义重大。本研究分别对乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间4个因素进行单因素试验，确定四因素三水平，设计L9（34）正交试验，考察黄芪总黄酮提取的最优工艺参数，以期为黄芪资源的合理开发以及临床应用提供科学依据。
1材料与方法
1.1试药蒙古黄芪药材饮片（山西浑源万生黄芪开发有限公司）;芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100080-201610）;95%乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等试剂均为分析纯。
1.2仪器电热鼓风干燥箱（GZX-9070MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;中药材粉碎机（FW177，天津市泰斯特仪器有限公司）;万分之一天平（BSA224S-CW，赛多利斯科学仪器北京有限公司）;数显恒温水浴锅（HH-2，国华电器有限公司）;循环水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ），上海予申仪器有限公司];紫外可见分光光度计（UV-1200，上海美谱达仪器有限公司）;低速大容量多管离心机（LXJ-IIB，上海安亭科学仪器厂）。
1.3方法
1.3.1芦丁标准曲线的制作芦丁标准曲线的制作参照张浩等[3]的方法，稍作改进：准确称取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品25 mg于100 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，得到质量浓度为0.25 mg/mL的芦丁标准液。分别准确吸取芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于7只10 mL容量瓶中，然后分别添加3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL的蒸馏水;再向各瓶内添加5%的NaNO2溶液 0.3 mL，混匀并静置6 min;继续添加10%的Al（NO3）2溶液 0.3 mL，混匀并静置6 min;再添加4%的NaOH溶液4 mL，最后用70%的乙醇定容至10 mL，混匀并静置12 min，依次在510 nm处测定各瓶内反应液的吸光值，以吸光值Y和芦丁质量浓度X分别作为纵坐标和横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y=0.6804X-0.0012，相关系数R2=0.9998。 1.3.2精密度试验准确吸取芦丁标准液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”项下方法测定吸光值，重复测定6次，计算出RSD为0.481%，表明精密度良好。
1.3.3稳定性试验供试品溶液制备[4]：将黄芪药材于60℃烘干至恒重，粉碎后过50目筛。精确称取黄芪粉末5 g于圆底烧瓶中，加入10倍量90%乙醇，70 ℃水浴下回流提取2次，每次2 h，趁热减压抽滤2次，合并滤液，5000 r/min离心5 min，上清液即为供试品溶液。
准确吸取供试品溶液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”项下方法分别于0、15、30、45、60、90、120 min测定吸光值，计算出RSD为1.176%，表明供试品溶液在2 h内稳定。
1.3.4 重复性试验精确称取黄芪粉末共6份，按照“1.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，各取1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”项下方法测定吸光值，计算出RSD为0.912%，表明此方法重复性较好。
1.3.5加样回收试验准确称取已知含量（5.198 mg/g）的黄芪粉末6份，各约2.5 g，按照“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，再分别精确加入适量芦丁标准液，混匀后按照“1.3.1”项下方法进行测定，计算出平均回收率为99.81%，RSD为0.805%。结果见表1。
1.3.6单因素试验根据参考文献和预试验结果分别设计以下单因素试验组合：①乙醇浓度为50%、60%、70%、80%和90%，水浴温度为70 ℃，料液比为1∶10，提取时间为2 h;②水浴温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，乙醇浓度为90%，料液比为1∶10，提取时间为2 h;③料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14，乙醇浓度为90%，水浴温度为70 ℃，提取时间为2 h;④提取时间为1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，乙醇浓度为90%，水浴温度为70 ℃，料液比为1∶10，分别考察以上各试验条件对黄芪总黄酮提取率的影响。
1.3.7 正交试验设计依据“1.3.3”项单因素试验结果，以黄芪总黄酮提取率为考量指标，设计L9（34）正交试验，选定的正交试验因素水平见表2。
1.4数据分析分别采用SPSS 18.0和Origin9.0软件进行正交试验数据分析检验和绘图。计算公式为[5]：
总黄酮提取率=（C×V）/（M×1000）×100
式中：C表示由标准曲线得到提取液中总黄酮的质量浓度（mg/mL），V表示滤液体积（mL），M表示黄芪粉末质量（g），×1000表示g与mg的单位转换。
2结果与分析
2.1单因素试验图1显示，随着乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间的增加，黄芪总黄酮的提取率均呈先升高后降低的趋势，且分别在乙醇浓度为80%、水浴温度为90 ℃、料液比为1∶10和提取时间为2.5 h时，总黄酮提取率达到最大值。因此，选择乙醇浓度70%、80%和90%，水浴温度为80 ℃、90 ℃和100 ℃，料液比为1∶8、1∶10和1∶12，提取时间为2 h、2.5 h和3 h进行正交试验。
2.2正交试验由表3中R值（极差）可知，对黄芪总黄酮提取率影响的主次因素依次为料液比、乙醇浓度、水浴温度和提取时间。从表中K1、K2、K3的大小分析得出，黄芪总黄酮的最优提取工艺参数为A3B1C3D1，即乙醇浓度为90%、水浴温度为80℃、料液比为1∶12、提取时间为2 h。此外，从表4方差分析结果可知，乙醇浓度（P<0.001）、水浴温度（P<0.01）、料液比（P<0.001）和提取时间（P<0.05）均显著影响黄芪总黄酮的提取率。
2.3验证试验为验证组合A3B1C3D1为最优提取方案，在此条件下，平行试验3次，试验结果见表5，可以看出，在此最优提取条件下，黄芪总黄酮的平均提取率为0.286%，均高于单因素试验和正交试验结果，验证了正交试验设计优化结果的准确性，表明该提取工艺参数A3B1C3D1（即乙醇浓度为90%、水浴温度为80℃、料液比为1∶12、提取时间为2 h）合理可行，为黄芪总黄酮最优提取方案。
3讨论
相比于微波辅助萃取法、超声波提取法、超临界CO2萃取法等，黄酮类物质的乙醇回流提取法操作简便、效率较高、溶剂可回收、运行成本低，能够同时兼顾提取效率和工业化生产[4，6]。本试验选择乙醇回流提取法进行黄芪总黄酮提取，通过单因素试验和正交试验相结合的方法研究乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间4个因素对黄芪总黄酮提取率的影响，并通过直观分析和方差分析综合考察，确定黄芪总黄酮提取的最优工艺参数[6]。单因素试验结果发现，黄芪总黄酮提取率均随乙醇浓度、水浴温度、料液比和提取时间的增加呈先升高后降低趋势，表明影响总黄酮提取率的4个因素在选定范围内均存在显著最佳值，当各影响因素设定水平高于最佳值时，较高浓度的乙醇溶液使药材中的低极性杂质易于渗出[5]，造成类黄酮提取效率降低，高温可破坏类黄酮类化合物的分子结构[4]，而料液比和提取时间的增加又导致生产成本以及提取周期提高[7];反之，当各影响因素设定水平低于最佳值时，导致黄酮类物质的渗透、溶解和扩散效率降低[8]，浸提物提取不充分。
试验研究结果表明，对黄芪总黄酮提取率影响的主次因素依次为料液比>乙醇浓度>水浴温度>提取时间，同时总黄酮的最优提取工艺参数为A3B1C3D1，即乙醇浓度为90%、水浴温度为80℃、料液比为1∶12、提取时间为2 h，该提取条件下，黄芪总黄酮提取率为0.286%。此方法操作简便、稳定合理，可作为黄芪总黄酮的最优提取工艺参数。
参考文献
[1]秦雪梅， 李震宇， 孙海峰， 等. 我国黄芪药材资源现状与分析[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（19）：3234-3238.
[2]赵琦， 张军武. 正交试验法优选黄芪中总黄酮提取工艺[J]. 云南中医学院学报， 2012， 35（1）：27-29.
[3]张浩， 郝立华， 刘贵巧， 等. 正交实验优化酸枣黄酮类物质提取工艺及其体外抗氧化作用[J]. 北方园艺， 2018（3）：130-138.
[4]吕凤娇， 谢晓兰. 黄芪总黄酮乙醇提取工艺研究[J]. 安徽农业科学， 2012， 40（33）：16380-16382.
[5]李慧靜， 张庆庆， 陈建翔， 等. 超声波提取黄芪中总黄酮工艺研究[J]. 安徽工程大学学报， 2012，27（4）：12-15.
[6]许丹妮， 杨海玲， 黄欢， 等. 正交实验优化回流法提取五桠果叶木姜子叶总黄酮工艺研究[J]. 亚太传统医药， 2018，14（2）：56-58.
[7]帕塔尔·尼牙孜， 邱远金，王婷婷，等. 正交实验优化新疆沙棘果渣总黄酮的提取工艺[J]. 西北药学杂志， 2016，31（2）：119-121.
[8]谢蓝华， 杜冰， 叶琼娟， 等. 正交试验优化酶法提取黄芪总黄酮工艺[J]. 包装与食品机械， 2013， 31（3）：7-12.