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摘要 [目的]优化黄菠萝离体培养再生体系。[方法]以黄菠萝带腋芽的嫩茎为外植体，采用正交设计研究其离体培养再生体系。[结果] 诱导黄菠萝的最佳初代培养基是MS+1.5 mg/L 6.BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L蔗糖，继代培养的最佳培养基组合是MS+1.0 mg/L 6.BA +0.1 mg/L NAA，最佳生根培养基组合是1/2MS+0.4 mg/LNAA +30 g/L蔗糖。[结论]以黄菠萝带腋芽的嫩茎为外植体，采用正交设计研究其离体培养和植株再生技术方法是可行的。
关键词 黄菠萝；组织培养；再生体系；正交设计
中图分类号 S604+.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-310-03
Abstract [Objective] To optimize Phellodendron amurense Rupr. in vitro culture regeneration system. [Method] By using axillary bud.bearing young stem of Phellodendron amurense as explants， the orthogonal experimental design was employed to study the in vitro culture and regeneration condition. [Result] The optimum primary medium was MS +1.5 mg/L 6.BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L sucrose， the best growth regulatory substance combination of medium for subculture was MS+1.0 mg/L 6.BA +0.1 mg/L NAA， and the best rooting medium was 1/2MS +0.4 mg/LNAA + 30 g/L sucrose. [Conclusion] Taking axillary bud-bearing young stem of Phellodendron amurense as explants， adopting orthogonal design to study its in vitro culture and plants regeneration technique is feasible.
Key words Phellodendron amurense Rupr.； Tissue culture； Regeneration system； Orthogonal design
黄菠萝（Phellodendron amurense Rupr.），属芸香科黄檗属落叶阔叶乔木，是国家级重点保护植物。目前对黄菠萝的研究较少，一般偏重于采种[1]、育苗[2]、嫩枝扦插[3]、药用价值[4]方面的研究。近年来，黄菠萝资源日益减少，甚至在某些地区濒临灭绝。黄菠萝组织培养方面已有报道，如郭勇[5]用黄菠萝茎段诱导愈伤组织和不定芽进而再生植株，愈伤组织诱导率为82%，由于经过愈伤组织分化阶段，体细胞变异的可能性较大，在快速繁殖中一般不采用这种方式。丛生芽增殖方式是指茎尖或腋芽在适宜的培养基上诱导，不断发生腋芽，再从芽的叶腋内长出小芽，腋芽不断形成又不断萌动，形成丛生苗，然后转入生根培养基，诱导生根成苗，扩大繁殖。由于在其增殖过程中，无需经过愈伤组织而可以再生，直接从芽到芽，是其无性系后代最能保持原品种特性的一种繁殖方式。这种增殖方式在数量、质量和经济等方面都优于其他传统的繁殖方式，因此，是林木快繁中运用最为广泛的一种繁殖方式。建立黄菠萝的组织培养体系，不仅可以迅速地获得大量优质的造林苗木，还可以为以后用作生物技术和基因工程方法对植物进行遗传改良。为此，笔者以带腋芽的茎段为外植体，以丛生芽增殖方式形成幼苗，采用正交设计方法研究影响黄菠萝离体再生的主要因素，建立高效离体再生的组培体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
黄菠萝采自吉林省露水河林业局的天然近熟群体林，于2月份取成年树一年生的无病虫害枝条，带回实验室置于水中培养，取带腋芽的茎段为外植体，将其新萌发的幼嫩枝条采下后先在流水下反复冲洗0.5～1.0 h，再用饱和中性洗衣粉液洗涤枝条，流水彻底冲洗，滤纸吸干表面水分，转移到灭菌的超净工作台上，用70%～75%乙醇表面消毒15 s，将外植体在0.1% HgCl2溶液中消毒8 min后，接种在初代培养基上，每瓶接种1个外植体，每处理接种30瓶。
1.2 试验设计 采用正交设计，不同培养阶段各种因素水平见表1，每组试验重复3次。在正交试验中，初代培养统计外植体的诱导率，继代培养统计试管苗的高净增量，生根培养统计试管苗的生根数。
1.3 培养条件 所有培养基pH为 5.8，在121 ℃条件下高压灭菌15 min。培养温度为（22±2） ℃，光周期为14 h/d，光照强度为50～70 μmol/（m2·s）。
1.4 数据处理 对数据进行方差分析和多重比较，统计分析用SPSS完成。
2 结果与分析
2.1 初代最佳培养基的筛选
由表2可知，诱导黄菠萝的最佳初代培养基为MS+6.BA 1.5 mg/L+NAA 0.06 mg/L+蔗糖20 g/L，即最佳工艺组合是A2B3A3D2。方差分析结果表明，A、B、C、D 4个因素差异极显著。此外，4种基本培养基对茎段的诱导能力依次为MS>1/2MS>WPM>B5，它们之间差异均达到显著水平，且MS与其他3种达到极显著水平。从长势情况来看，MS培养基上茎段诱导的不定芽，叶片伸展，叶色鲜绿，节效果最好。 2.2 继代最佳培养基的筛选
方差分析结果表明，6.BA各水平间差异极显著，NAA各水平间差异显著，IBA各水平间差异不显著。各个因素的主次依次是A、B、C，表明在继代培养中细胞分裂素起的作用最大，2种生长素NAA比IBA的效果好。由于IBA各水平差异不显著，因此只对6.BA和NAA各水平间进行多重比较。由表3可知，2个因素均为第二个水平效果最好，由于IBA差异不显著，在2种生长素中只选择NAA，继代培养最佳激素组合为A2B2，即6.BA 1.0 mg/L，NAA 0.1 mg/L。
2.3 生根最佳培养基的筛选
方差分析结果表明，基本培养基各水平间差异极显著，6.BA各水平间差异不显著，NAA各水平间差异极显著，蔗糖各水平间差异极显著。各个因素的主次依次是A、C、D、B。由于6.BA差异不显著，因此只对其他3个因素的各水平间进行多重比较（表4）。由表4可知，生根培养的最佳组合为A1C2D3，即培养基为1/2MS，NAA浓度为0.4 mg/L，蔗糖浓度为30 g/L。
3 结论与讨论
培养基中含有外植体生长所需要的营养物质，是组织培养中外植体赖以生存和发展的基础。在初代培养中4种基本培养基对茎段诱导率的大小为MS>1/2MS>WPM>B5，它们之间差异均达到显著水平，且MS与其他3种达到极显著水平，从长势情况来看，MS培养基上茎段诱导的不定芽，叶片伸展，叶色鲜绿，节效果最好。而在生根培养阶段则需要低浓度的盐，4种基本培养基对根诱导率的大小为1/2MS>MS>WPM>B5。另外在组织培养的各个阶段，基本培养基都是最重要的因素，因此选择合适的培养基是组织培养成功与否的关键因素。
该研究使用的细胞分裂素是结构比较稳定的人工合成的6.BA。研究发现，在初代培养中， 6.BA的4个水平中分出了2个等级，尽管2、3水平上差异不显著，从方差分析的角度两者皆可选，但考虑3水平的平均值略高于2水平，所以选择了3水平的浓度，即6.BA选择1.5 mg/L。而在继代培养中对6.BA共设置了3个梯度，结果表明各水平间差异极显著，其中以1.0 mg/L最好。在生根培养中对6.BA共设计4个梯度，结果表明，4个水平下的6.BA差异不显著，因而在生根培养中6.BA的影响不大。综合来看，在初代培养中需要高浓度的细胞分裂素，在继代培养中6.BA的浓度有所降低，而在生根培养中6.BA的作用很小，甚至可以不加。
该研究所使用的生长素是NAA。研究发现，在初代培养中，4个因素中NAA的作用最小，但4个水平差异显著，3、4水平之间差异不显著，但只有3水平与其他2个水平差异极显著，而4水平与其他2个水平差异则不显著，因而选择3水平的0.06 mg/L作为NAA的最优浓度。在继代培养中NAA的作用明显优于IBA，IBA的作用不显著，与他人的结果不一致，可能是所设的浓度不理想所致。而NAA的浓度以0.1 mg/L为最佳。在生根培养中， NAA在4个因素中也比较重要，4个水平差异极显著，其中以0.4 mg/L诱导的根数最多。综合来看，在这3个培养阶段，NAA的浓度变化较大，且浓度逐渐升高。
糖是培养基中不可缺少的碳源，该试验选用的糖源是蔗糖，在不同培养阶段用量也不完全相同。在初代培养中，蔗糖含量对诱导率产生显著和极显著的影响，4个水平分出了2个等级，在2个较好的水平中，只有2水平下的结果与其他2个水平的结果差异极显著，因此2水平下的20 g/L蔗糖为最佳浓度。在生根培养中，4个蔗糖浓度水平下的生根数差异显著或极显著，比较而言3水平下的蔗糖浓度最好，即30 g/L。综合来看，在初代培养中蔗糖需求量不大，而在生根培养中则需要较高浓度的蔗糖。
正交设计是多因素分析的有力工具， 可以从许多因素中选出主要影响因素及最佳水平， 用较少的试验次数获得较多的信息[6]。正交设计可以精简试验次数、克服在培养基配方设计上的盲目性、提高工作效率和试验的可靠性[7]。近年来正交设计等统计方法应用于许多植物的离体培养[8-10]，并取得良好的试验效果，但在黄菠萝组织培养中尚未见该方法的报道。该试验采用正交设计的方法，仅用较少的试验组合，通过统计学分析， 明确了黄菠萝初代、继代、生根培养各阶段的主要因素，同时优化筛选了最佳培养基，简化了研究方案，加快了研究进程。成功应用正交设计法的关键是参试因子和试验水平范围的正确选择。该试验中大多数参试因子产生的效应存在明显差异，筛选出来的培养基中各因子的水平基本在试验水平范围之内，能大体反映全部组合的试验效果，因此该试验对参试因子和试验水平范围的选择是较适宜的。该研究未考虑因子间的交互作用，需要在以后的研究和实践中进一步完善。
参考文献
[1]张泉，朱成仁.黄菠萝采种及育苗技术的研究[J].林业勘察设计，2005（3）：44-47.
[2] 龙作义，苑国，周敬伟.温室效应对塑料大棚黄菠萝育苗的影响[J].牡丹江师范学院学报，2005（2）：17-20.
[3] 于树成，张淑华，闫红霞，等.黑龙江省主要阔叶树种绿枝扦插效果初步分析[J].林业勘察设计，2003（1）：25-28.
[4] 李霞，阎秀峰，刘剑锋.氮素形态对黄檗幼苗三种生物碱含量的影响[J].生态学报，2005，25（9）：2159-2164.
[5] 郭勇，石大兴，孙雁霞，等.黄檗的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2005，41（6）：792.
[6] 李春喜，姜丽娜，邵云，等.生物统计学[M].北京：科学出版社，2005：177-183.
[7] 王建华，王义， 孙国伟， 等.人参组织培养的多因子正交试验研究[J].吉林农业大学学报，2006，28（6）：648-651.
[8] 张菊红，谢妤，汪承刚，等.正交设计在欧洲菘蓝组织培养中的应用[J].湖北大学学报，2006，28（2）：183-186.
[9] 宋莉英，谭诤，高峰.苦瓜愈伤组织诱导的多因子正交试验研究[J]. 西南师范大学学报，2004，29（3）：462-465.
[10] 李成慧，蔡斌，单丽丽，等.应用正交设计法探讨蝴蝶兰叶片类原球茎的诱导[J].扬州大学学报，2004，25（2）：76-78.
关键词 黄菠萝；组织培养；再生体系；正交设计
中图分类号 S604+.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-310-03
Abstract [Objective] To optimize Phellodendron amurense Rupr. in vitro culture regeneration system. [Method] By using axillary bud.bearing young stem of Phellodendron amurense as explants， the orthogonal experimental design was employed to study the in vitro culture and regeneration condition. [Result] The optimum primary medium was MS +1.5 mg/L 6.BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L sucrose， the best growth regulatory substance combination of medium for subculture was MS+1.0 mg/L 6.BA +0.1 mg/L NAA， and the best rooting medium was 1/2MS +0.4 mg/LNAA + 30 g/L sucrose. [Conclusion] Taking axillary bud-bearing young stem of Phellodendron amurense as explants， adopting orthogonal design to study its in vitro culture and plants regeneration technique is feasible.
Key words Phellodendron amurense Rupr.； Tissue culture； Regeneration system； Orthogonal design
黄菠萝（Phellodendron amurense Rupr.），属芸香科黄檗属落叶阔叶乔木，是国家级重点保护植物。目前对黄菠萝的研究较少，一般偏重于采种[1]、育苗[2]、嫩枝扦插[3]、药用价值[4]方面的研究。近年来，黄菠萝资源日益减少，甚至在某些地区濒临灭绝。黄菠萝组织培养方面已有报道，如郭勇[5]用黄菠萝茎段诱导愈伤组织和不定芽进而再生植株，愈伤组织诱导率为82%，由于经过愈伤组织分化阶段，体细胞变异的可能性较大，在快速繁殖中一般不采用这种方式。丛生芽增殖方式是指茎尖或腋芽在适宜的培养基上诱导，不断发生腋芽，再从芽的叶腋内长出小芽，腋芽不断形成又不断萌动，形成丛生苗，然后转入生根培养基，诱导生根成苗，扩大繁殖。由于在其增殖过程中，无需经过愈伤组织而可以再生，直接从芽到芽，是其无性系后代最能保持原品种特性的一种繁殖方式。这种增殖方式在数量、质量和经济等方面都优于其他传统的繁殖方式，因此，是林木快繁中运用最为广泛的一种繁殖方式。建立黄菠萝的组织培养体系，不仅可以迅速地获得大量优质的造林苗木，还可以为以后用作生物技术和基因工程方法对植物进行遗传改良。为此，笔者以带腋芽的茎段为外植体，以丛生芽增殖方式形成幼苗，采用正交设计方法研究影响黄菠萝离体再生的主要因素，建立高效离体再生的组培体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
黄菠萝采自吉林省露水河林业局的天然近熟群体林，于2月份取成年树一年生的无病虫害枝条，带回实验室置于水中培养，取带腋芽的茎段为外植体，将其新萌发的幼嫩枝条采下后先在流水下反复冲洗0.5～1.0 h，再用饱和中性洗衣粉液洗涤枝条，流水彻底冲洗，滤纸吸干表面水分，转移到灭菌的超净工作台上，用70%～75%乙醇表面消毒15 s，将外植体在0.1% HgCl2溶液中消毒8 min后，接种在初代培养基上，每瓶接种1个外植体，每处理接种30瓶。
1.2 试验设计 采用正交设计，不同培养阶段各种因素水平见表1，每组试验重复3次。在正交试验中，初代培养统计外植体的诱导率，继代培养统计试管苗的高净增量，生根培养统计试管苗的生根数。
1.3 培养条件 所有培养基pH为 5.8，在121 ℃条件下高压灭菌15 min。培养温度为（22±2） ℃，光周期为14 h/d，光照强度为50～70 μmol/（m2·s）。
1.4 数据处理 对数据进行方差分析和多重比较，统计分析用SPSS完成。
2 结果与分析
2.1 初代最佳培养基的筛选
由表2可知，诱导黄菠萝的最佳初代培养基为MS+6.BA 1.5 mg/L+NAA 0.06 mg/L+蔗糖20 g/L，即最佳工艺组合是A2B3A3D2。方差分析结果表明，A、B、C、D 4个因素差异极显著。此外，4种基本培养基对茎段的诱导能力依次为MS>1/2MS>WPM>B5，它们之间差异均达到显著水平，且MS与其他3种达到极显著水平。从长势情况来看，MS培养基上茎段诱导的不定芽，叶片伸展，叶色鲜绿，节效果最好。 2.2 继代最佳培养基的筛选
方差分析结果表明，6.BA各水平间差异极显著，NAA各水平间差异显著，IBA各水平间差异不显著。各个因素的主次依次是A、B、C，表明在继代培养中细胞分裂素起的作用最大，2种生长素NAA比IBA的效果好。由于IBA各水平差异不显著，因此只对6.BA和NAA各水平间进行多重比较。由表3可知，2个因素均为第二个水平效果最好，由于IBA差异不显著，在2种生长素中只选择NAA，继代培养最佳激素组合为A2B2，即6.BA 1.0 mg/L，NAA 0.1 mg/L。
2.3 生根最佳培养基的筛选
方差分析结果表明，基本培养基各水平间差异极显著，6.BA各水平间差异不显著，NAA各水平间差异极显著，蔗糖各水平间差异极显著。各个因素的主次依次是A、C、D、B。由于6.BA差异不显著，因此只对其他3个因素的各水平间进行多重比较（表4）。由表4可知，生根培养的最佳组合为A1C2D3，即培养基为1/2MS，NAA浓度为0.4 mg/L，蔗糖浓度为30 g/L。
3 结论与讨论
培养基中含有外植体生长所需要的营养物质，是组织培养中外植体赖以生存和发展的基础。在初代培养中4种基本培养基对茎段诱导率的大小为MS>1/2MS>WPM>B5，它们之间差异均达到显著水平，且MS与其他3种达到极显著水平，从长势情况来看，MS培养基上茎段诱导的不定芽，叶片伸展，叶色鲜绿，节效果最好。而在生根培养阶段则需要低浓度的盐，4种基本培养基对根诱导率的大小为1/2MS>MS>WPM>B5。另外在组织培养的各个阶段，基本培养基都是最重要的因素，因此选择合适的培养基是组织培养成功与否的关键因素。
该研究使用的细胞分裂素是结构比较稳定的人工合成的6.BA。研究发现，在初代培养中， 6.BA的4个水平中分出了2个等级，尽管2、3水平上差异不显著，从方差分析的角度两者皆可选，但考虑3水平的平均值略高于2水平，所以选择了3水平的浓度，即6.BA选择1.5 mg/L。而在继代培养中对6.BA共设置了3个梯度，结果表明各水平间差异极显著，其中以1.0 mg/L最好。在生根培养中对6.BA共设计4个梯度，结果表明，4个水平下的6.BA差异不显著，因而在生根培养中6.BA的影响不大。综合来看，在初代培养中需要高浓度的细胞分裂素，在继代培养中6.BA的浓度有所降低，而在生根培养中6.BA的作用很小，甚至可以不加。
该研究所使用的生长素是NAA。研究发现，在初代培养中，4个因素中NAA的作用最小，但4个水平差异显著，3、4水平之间差异不显著，但只有3水平与其他2个水平差异极显著，而4水平与其他2个水平差异则不显著，因而选择3水平的0.06 mg/L作为NAA的最优浓度。在继代培养中NAA的作用明显优于IBA，IBA的作用不显著，与他人的结果不一致，可能是所设的浓度不理想所致。而NAA的浓度以0.1 mg/L为最佳。在生根培养中， NAA在4个因素中也比较重要，4个水平差异极显著，其中以0.4 mg/L诱导的根数最多。综合来看，在这3个培养阶段，NAA的浓度变化较大，且浓度逐渐升高。
糖是培养基中不可缺少的碳源，该试验选用的糖源是蔗糖，在不同培养阶段用量也不完全相同。在初代培养中，蔗糖含量对诱导率产生显著和极显著的影响，4个水平分出了2个等级，在2个较好的水平中，只有2水平下的结果与其他2个水平的结果差异极显著，因此2水平下的20 g/L蔗糖为最佳浓度。在生根培养中，4个蔗糖浓度水平下的生根数差异显著或极显著，比较而言3水平下的蔗糖浓度最好，即30 g/L。综合来看，在初代培养中蔗糖需求量不大，而在生根培养中则需要较高浓度的蔗糖。
正交设计是多因素分析的有力工具， 可以从许多因素中选出主要影响因素及最佳水平， 用较少的试验次数获得较多的信息[6]。正交设计可以精简试验次数、克服在培养基配方设计上的盲目性、提高工作效率和试验的可靠性[7]。近年来正交设计等统计方法应用于许多植物的离体培养[8-10]，并取得良好的试验效果，但在黄菠萝组织培养中尚未见该方法的报道。该试验采用正交设计的方法，仅用较少的试验组合，通过统计学分析， 明确了黄菠萝初代、继代、生根培养各阶段的主要因素，同时优化筛选了最佳培养基，简化了研究方案，加快了研究进程。成功应用正交设计法的关键是参试因子和试验水平范围的正确选择。该试验中大多数参试因子产生的效应存在明显差异，筛选出来的培养基中各因子的水平基本在试验水平范围之内，能大体反映全部组合的试验效果，因此该试验对参试因子和试验水平范围的选择是较适宜的。该研究未考虑因子间的交互作用，需要在以后的研究和实践中进一步完善。
参考文献
[1]张泉，朱成仁.黄菠萝采种及育苗技术的研究[J].林业勘察设计，2005（3）：44-47.
[2] 龙作义，苑国，周敬伟.温室效应对塑料大棚黄菠萝育苗的影响[J].牡丹江师范学院学报，2005（2）：17-20.
[3] 于树成，张淑华，闫红霞，等.黑龙江省主要阔叶树种绿枝扦插效果初步分析[J].林业勘察设计，2003（1）：25-28.
[4] 李霞，阎秀峰，刘剑锋.氮素形态对黄檗幼苗三种生物碱含量的影响[J].生态学报，2005，25（9）：2159-2164.
[5] 郭勇，石大兴，孙雁霞，等.黄檗的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2005，41（6）：792.
[6] 李春喜，姜丽娜，邵云，等.生物统计学[M].北京：科学出版社，2005：177-183.
[7] 王建华，王义， 孙国伟， 等.人参组织培养的多因子正交试验研究[J].吉林农业大学学报，2006，28（6）：648-651.
[8] 张菊红，谢妤，汪承刚，等.正交设计在欧洲菘蓝组织培养中的应用[J].湖北大学学报，2006，28（2）：183-186.
[9] 宋莉英，谭诤，高峰.苦瓜愈伤组织诱导的多因子正交试验研究[J]. 西南师范大学学报，2004，29（3）：462-465.
[10] 李成慧，蔡斌，单丽丽，等.应用正交设计法探讨蝴蝶兰叶片类原球茎的诱导[J].扬州大学学报，2004，25（2）：76-78.