建立一种非病毒的T细胞基因转导方法，为CAR-T细胞免疫治疗提供基因修饰策略。
方法将CD19CAR表达框(1 470 bp)克隆入PiggyBac转座子载体PB513B-1的XbaⅠ和EcoRⅠ位点，构建靶向CD19的PiggyBac转座子载体(pb19CAR)；将转座子和转座酶双质粒，经电穿孔仪(1×20 ms 830 V/840 V/850 V)和核转仪(U014/T023)转导原代T细胞，优化转导程序，比较两种转导装置的效率及细胞存活率；用靶抗原CD19蛋白(5 μg/ml)和CD3/CD28 mAb(5 μg/ml)两种包被平板激活、白细胞介素(IL)-2(500 U/ml)和混合细胞因子IL-7(10 ng/ml)/IL-15(10 ng/ml)/IL-21(20 ng/ml)两种扩增方法，比较激活、扩增、CD19CAR表达和细胞表型。
结果转座子载体(pb19CAR)经XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切和基因测序确认构建成功。经流式细胞术及细胞活力计数仪检测，电穿孔仪转导效率及细胞活率均高于核转仪[(51.0±2.3)%比(36.5±1.8)%(P＝0.000)，(75.0±3.8)%比(60.0±3.0)%(P＝0.000)]；电穿孔后培养扩增12 d流式细胞术检测CD19CAR表达显示靶抗原CD19蛋白组明显高于CD3/CD28 mAb组[(70.0±3.5)%比(54.0±2.7)%(P＝0.000)]、细胞表型分析显示混合细胞因子组比IL-2组有更高比例的Tscm/Tscm-like(25.00±1.25)%比(12.20±0.60)%(P＝0.000)、Tcm细胞(10.20±0.51)%比(3.00±0.15)%(P＝0.000)。
结论pb19CAR/转座酶双质粒电穿孔具有较高的转导效率和细胞活率；靶抗原CD19蛋白刺激可优势扩增CAR-T细胞；混合细胞因子支持具有中央记忆和干细胞记忆表型的CAR-T细胞生长。