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摘 要： 从菠菜（Spinacia oleracea L.）基因组数据库中筛选鉴定了与菠菜叶酸合成转运，及与C1代谢相关的25个基因，并对其编码的蛋白做进化树和保守域分析，发现叶酸蛋白在进化上表现出保守型和复杂性。用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析了叶酸含量不同的菠菜的叶酸相关基因表达量，发现在转录水平上只有少数叶酸基因表达量与菠菜叶酸含量有关。
关键词： 菠菜（Spinacia oleracea L.）; 叶酸; 基因表达
中图分类号： S636.1; Q563+.8 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2020）06-0637-13
Abstract： In this paper，25 genes related to spinach’s（Spinacia oleracea L.） folate synthesis and transport，and to C1 metabolism were identified in the spinach genome database.The evolutionary tree and conserved domain analysis of the encoded protein showed that the folate protein showed conservative type and complexity in evolution.Using the technology of quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） to analyze the expression of folate-related genes in spinach with different folate content，it was found that only a few folate gene expression levels were related to the content of spinach folate at the transcription level.
Key words： spinach（Spinacia oleracea L.）; folate; gene expression
0 引 言
葉酸是水溶性B族维生素，在生物体内主要作为一碳单位的供体和受体，参与DNA合成、氨基酸代谢，以及各类化合物的甲基化过程。植物缺乏叶酸，则叶绿素、木质素等物质不能合成，光呼吸和氮代谢将受阻[1-3]。叶酸还在种子萌发、幼苗形成，以及植物开花等过程中发挥重要作用[4-5]。叶酸同时是人体自身不能合成但必不可缺的营养素，缺乏叶酸会导致巨幼红细胞性贫血和神经管畸形，还会导致体内同型半胱氨酸量降低[6-7]。针对植物叶酸积累规律的研究，对充分发挥叶酸在植物生长发育过程中的作用，增加作物产量和品质，提高叶酸在可食部位的积累水平，开发高叶酸作物新品种具有重要意义。
植物叶酸合成途径与细菌类似，叶酸的合成包括对氨基苯甲酸（pABA）的合成、蝶呤的合成，及叶酸的组装、加尾与转化三部分，分别定位在细胞质、质体和线粒体上[8]。叶酸合成会受到酶、基因等水平的反馈调控，合成后的代谢还涉及体内运转、降解与回补。单谷氨酸尾形式的四氢叶酸（THF）是唯一酶活性形式[9]，它既可以在亚细胞中合成各种形式的叶酸衍生物，也可以作为C1受体参与丝氨酸和甘氨酸的转化过程，接受C1基团后合成5，10-亚甲基四氢叶酸（5，10-CH2-THF）[10]。叶酸聚谷氨酸盐（THF-Glun）进入细胞质后有可能被光降解，降解产物可以在酶的作用下重新加入叶酸合成途径，蝶呤醛还原酶（PTAR）和γ-谷氨酸水解酶（GGH）是参与该途径的重要酶[8-11]。
过表达叶酸合成途径限速酶可以提高植物叶酸含量。编码三磷酸鸟苷（GTP）环化水解酶的基因（GCHI）在番茄、生菜、玉米中过表达，能将番茄果实、水稻胚乳，和生菜、玉米胚乳中的叶酸含量分别提高4，8.5和2倍[12-14]。共表达蝶呤合成分支的GCHI和pABA合成分支的氨基脱氧胆酸合成酶（ADCS）两个基因，能使水稻胚乳中的叶酸含量提高15～100倍[15]，是迄今为止利用转基因技术提高植物中叶酸含量最成功的例子。将GCHI与ADCS单表达后的转基因番茄进行杂交，也能够提高番茄果实叶酸含量达25倍，显著高于GCHI和ADCS单基因表达的番茄中叶酸的含量[16]。过表达两个叶酸组装过程中编码关键酶的基因二氢叶酸合成酶与叶酰聚谷氨酸合成酶双功能酶（DHFS/FPGS），二氢蝶呤合成酶（DHPS），发现转基因拟南芥中的叶酸含量分别较对照提高了20.6%～29.4%和19.0%～42.6%[17]。此外，叶酸主要以多尾形式存在，抑制GGH的活性，可使叶酸谷氨酸尾的平均长度增加，并且使叶酸的含量提高30%[18]。但大量研究发现：上述基因在不同植物中过表达对其叶酸含量的提高效果差异很大，说明植物叶酸合成代谢调控机制复杂，需要针对特定植物开展叶酸合成代谢机制的研究。
菠菜（Spinacia oleracea L.）是重要的世界性叶用蔬菜，是公认的叶酸含量较高的蔬菜（http：//www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/search/）。提高菠菜中的叶酸含量，可以在摄食较少的情况下，保证足量叶酸的摄取。此外，菠菜生育期短，适宜的温度下可种植8～10茬，实现全年供应，因此研究菠菜叶酸积累规律具有重要意义。目前关于菠菜叶酸积累规律的研究很少。WATANABE等[19]通过在水培菠菜中添加苯丙氨酸，促进了蝶呤合成路径和pABA合成路径的流量，从而提高菠菜中的叶酸含量，表明通过调节叶酸的合成与代谢路径可以实现菠菜中叶酸含量的提高。本研究拟通过同源序列比对和生物信息学分析，鉴定菠菜叶酸合成代谢相关基因，并分析其表达量与叶酸总量的关系，为揭示菠菜叶酸合成代谢机制，以及通过遗传改造途径提高菠菜叶酸含量，奠定初步基础。 1 材料与方法
1.1 基因序列获取与生物信息学分析
从拟南芥（Arabidopsis thaliana）、甜菜（Beta vulgaris）、番茄（Solanum lycopersicum）、烟草（Nicotiana tabacum）基因组数据库中获得叶酸合成代谢相关基因序列，在菠菜基因组数据库（http：//www.spinachbase.org/）进行BLAST分析得到菠菜叶酸合成代谢相关同源基因序列。通过SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/），PROSITE（https：//prosite.expasy.org/）对获得的蛋白质序列进行保守结构域预测和分析。用MEGA 7.0（neighbor-joining，bootstrap n=1 000）绘制进化树。
1.2 材料培养与叶酸含量测定
在对本课题组存有的菠菜种质资源叶酸含量筛选的基础上，选择“日本大叶”（潍坊格瑞种子有限公司）、“沪菠2号”（上海师范大学）、“澳绿”（广州南蔬农业科技有限公司）3个叶酸含量差异较大的菠菜材料，用作基因表达研究。将菠菜种子播种于以泥炭和珍珠岩混合比例（体积比）为1∶1的基质穴盘中，置于上海师范大学植物种质资源开发中心人工气候室中育苗，光照时长为：10 h光照，14 h黑暗;光照强度为5 200 lx;湿度约为68%。待幼苗长至两叶一心期，选取大小长势一致的幼苗小心洗去根部土壤后放入营养液（1/2 Hoagland，微量元素使用Arnon配方）中水培，水培液每隔3 d更换一次，控制pH值为6.8左右，待菠菜生长30 d后，采样，取叶片液氮速冻。一部分样品于冻干机中冻干，研磨成粉，一部分样品存入-80 ℃冰箱备提RNA。
采用荧光分光光度法测定菠菜中的叶酸总含量。取菠菜叶片冻干粉各0.02 g于5 mL棕色离心管中与1 mL物质的量浓度为0.1 mol?L-1，pH值为6.8的磷酸缓冲液（含质量分数为1%的L-抗坏血酸和体积分数为0.2%的2-巯基乙醇）混匀后先沸水浴后冰浴，再加入600 μL木瓜蛋白酶溶液，37 ℃摇床孵育1 h，取出，以100 ℃水浴终止酶活性后，离心取上清液，在上清液中加入80 μL大鼠血清后用磷酸缓冲液补充体积至2 mL，孵育2 h，最后取出先沸水浴再冰浴，离心后取上清液，上清液最终经灭菌的滤孔直径为0.45 μm的滤膜筛滤后备测，提取全程在弱光环境中进行。测定前在15 mL离心管中加入400 μL叶酸提取液和100 μL 20%（体积分数）冰乙酸溶液混匀，随后用4%（质量分数）高锰酸钾溶液和3%（体积分数）过氧化氢溶液分别滴定混合液，最后用超纯水定容至10 mL。用荧光分光光度计（安捷伦，Cary Eclipse）于激发波长（Ex）为370 nm，发射波长（Em）为400～600 nm处扫描测荧光强度。预试验结果表明：扣除空白实验背景值后，该方法的叶酸回收率为85%～90%。
1.3 实时荧光定量法测定基因表达量
使用TRIzol法提取菠菜样品中的总RNA。使用TaKaRa PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒将提取的RNA反转录成互补DNA（cDNA），最后使用TaKaRa TB Green TM Premix Ex Taq TM（Tli RNaseH Plus）试剂盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR仪器上进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。以菠菜18S为内参，以2-ΔCt法计算基因相对表达量。设计qRT-PCR引物序列（表1），熔解温度（Tm）控制在57～61 ℃。
2 结 果
2.1 菠菜叶酸合成代谢相关基因确定
根据同源搜索获得25个菠菜叶酸合成代谢相关基因（表2），其中11个基因与C1代谢途径有关，14个基因与叶酸合成转运有关。丝氨酸羟甲基转移酶基因（SHMT1）编码两个蛋白SHMT1a和SHMT1b，5-甲基四氢叶酸环化酶基因（5FCL）也编码两个同源蛋白5-甲酰四氢叶酸环化连接酶（5FCL）和5FCLL。GCSH，GCSL，GCSP，GCST是组成甘氨酸脱羧酶复合物（GDC）的4种蛋白。
2.2 保守结构域分析
对菠菜（S.oleracea，So）、拟南芥（A.thaliala，At）、番茄（S.lycopersicum，Sl）、烟草（N.tabacum，Nt）和甜菜（B.vulgaris，Bv）的叶酸合成代谢相关蛋白进行保守域结构分析，由表3～4可知：从结构域数量看，菠菜相关基因的结构域和其他物种总体相似，偶尔有个别结构域在某一个物种中存在或丢失，如GTAse 2在甜菜中不存在，PIKKc_ATR，FAT，UME，FATC只在烟草中出现;从结构域种类来看，除了个别蛋白如MTHR与烟草差异较大外，菠菜与其他植物叶酸相关蛋白结构域种类基本一致;从结构域长度来看，大部分结构域在不同物种间氨基酸数量相同，如二氢叶酸还原酶蛋白（DHFR）的2个结构域在5个物种中长度都相同;少部分结构域长度不同，如菠菜ADCS蛋白的GATsae 1结构域由164个氨基酸组成，与甜菜、烟草、番茄均不相同;又如5FCL蛋白，在菠菜中只有一个由207个氨基酸组成的5-FTHF_cyc-lig，而拟南芥和甜菜中则有2个5-FTHF_cyc-lig。
2.3 进化树分析
使用MEGA 7.0的Neighbor-joining算法对菠菜（S.oleracea）、拟南芥（A.thalian）、甜菜（B.vulgaris）、番茄（S.lycopersicum）和烟草（N.tabacum）的叶酸相关蛋白构建进化树（图1）。菠菜叶酸合成转运相关蛋白中，除DHFR，DHFS和GCHI 3个蛋白外，其他蛋白都与甜菜具有極高的相似性，可信度大于90%，说明菠菜的叶酸合成相关蛋白在进化上与甜菜更接近，这与菠菜和甜菜同属苋科是相符的。GCHI在菠菜中的进化表现出相对原始的状态，而DHFS则与烟草有更高的相似性。 如图2所示：大部分菠菜C1代谢相关蛋白与甜菜同源性更高，可信度大于90%，少数蛋白如So10-FDF与At10-FDF蛋白同源性最高，而SoGCSP和SoFTHS单独进化为一支，其他菠菜C1蛋白尽管与供试物种间没有特别高的同源性，但也表现出70%以上的可信度。此外，同一蛋白的进化显示出复杂性，虽然5FCL，5FCLL和SHMT1a，SHMT1b是分别由基因5FCL和SHMT1编码的两组蛋白，但5FCL，SHMT1a与其同源蛋白5FCLL，SHMT1b相比，都显得更原始，在进化树上表现为单独一支，而另外两个蛋白则与甜菜蛋白同源性更高。
2.4 菠菜品种间叶酸合成代谢相关基因表达谱
供试的3个菠菜品种的叶片叶酸含量差异显著，“澳绿”叶酸质量分数最低，仅为32.32 μg?g-1 DW（干重）;“沪菠2号”质量分数最高，为97.05 μg?g-1 DW，两者之间的差值达64.73 μg?g-1 DW;“日本大叶”叶酸质量分数介于两者之间，为77.10 μg?g-1 DW。
qRT-PCR分析了3个菠菜品种中叶酸合成转运相关基因的表达量（图3），结果显示：GCHI的相对基因表达量高低与叶酸含量高低变化趋一致，而ADCS和GGH则呈现相反的规律性。在叶酸含量最高的“沪菠2号”中，NUDT，DRTS/DHFS，FPGS，HPPK/DHPS，PTAR 5个基因的表达量相比另外2个品种显著降低。叶酸含量居中的“日本大叶”的ADCL，DHNA和DHFR基因表达量要显著高于含量最高的“沪菠2号”，这与其他基因表达量的结果都有所不同。
参与C1代谢的叶酸基因中，GCSP，MTHR，10-FDF与SHMT1b的基因表达量在叶酸含量最低的“澳绿”中最高;而DHC，GCST，MS，SHMT1b在叶酸含量居中的“日本大叶”中表现出较高的表达量。相对来说，参与C1代谢的基因表达量与叶酸含量之间没有表现出明显的规律性（图4）。
3 讨 论
通过生物信息學分析找到了25个菠菜叶酸合成代谢途径相关基因，包括：参与对pABA合成的ADCL，ADCS，参与蝶呤合成的GCHI，NUDT，DHNA，与叶酸组装加尾有关的DRTS/DHFR，DHFS，HPPK/DHPS，参与叶酸聚谷氨酰化与胞内转运补救途径的FPGS，GGH，PTAR，还有与C1代谢相关的DHC，FTHS，GCSH，GCSL，GCSP，GCST，MS，MTHFR，PURU，SHMT3，以及SHMT1等。
与拟南芥和番茄相比，菠菜叶酸合成代谢相关基因数目存在明显的基因丢失现象。拟南芥中AtFPGS有3个同工型，分别定位于线粒体、细胞质和叶绿体[4]，番茄基因组中定位到在质体和线粒体中有2个SlFPGS的同工型[20]，而菠菜只定位到1个FPGS。同样地，菠菜中分别只定位到1个DHFR，DHNA和ADCL，而拟南芥中DHFR和DHNA有3个同工型，番茄中ADCL有2个胞质同工型[20]。猜测这些基因在菠菜中只在固定的细胞器中执行功能，与其他植物的多细胞器同时行使功能的情况不同。
通过比对不同物种同源蛋白的结构域种类和长度，可以了解菠菜叶酸相关蛋白的酶活性和进化保守程度。结果显示：菠菜叶酸相关蛋白结构域和相比较的4种植物的蛋白结构域种类基本保持一致，除NtADCS1，BvPTAR，BvFTHS，NtMTHR3这4个蛋白外，其他参与叶酸合成转运与C1代谢的相关蛋白保守结构域在不同植物中的结构域类型是相同的。同时也发现：只有参与合成转运的蛋白ADCL，FPGS及参与C1代谢的叶酸蛋白5FCLL，GCSH，GCST在不同物种中的氨基酸数量保持一致，而其他蛋白结构域在不同植物中长度有所差异，其中多以拟南芥的某个蛋白结构域多一个或少一个氨基酸的情况出现，如DHC的THF_DHG_CYH_C比其他植物同类结构域多一个氨基酸。此外，即使是同源蛋白如5FCL与5FCLL，它们的保守结构域都是5-FTHF_cyc-lig，但是5FCL的结构域氨基酸数量在不同植物中完全不同，而5FCLL则完全相同。最后，单独比较菠菜叶酸相关蛋白的结构域可知，处在同一个循环中的蛋白可以拥有执行相同功能的结构域，如都参与DNA循环的FTHS和10-FDF，它们的结构域分别是PLN02331和Formyl_trans_N，两者虽然名称不同，但是都与10-甲酰基四氢叶酸还原成四氢叶酸的过程有关;Mur_ligase_M在与叶酸合成有关的FPGS和DHFS两个蛋白中都存在，虽然结构域长度不同，但是它们的功能都是将谷氨酸盐分别连接至叶酰聚谷氨酸盐或单谷氨酸中，与玉米中的结果一致[21]。结合进化树分析，菠菜叶酸合成转运蛋白除DHFR，DHFS和GCHI外，其他蛋白都显示出与甜菜进化的高度相似性;菠菜叶酸C1代谢蛋白则展示出更复杂的进化程度，即使是同源蛋白5FCL与5FCLL也会进化出不同方向，5FCLL表现得更原始。总的来说，虽然菠菜叶酸相关蛋白在进化上出现复杂性且功能也变得多样化，但是在进化上是非常保守的，且与同属于苋科的甜菜表现出高度同源性。
为了研究菠菜叶酸含量与叶酸相关基因表达量间的关系，对已测得叶酸含量的3个菠菜品种进行qRT-PCR，结果显示：SoGCHI基因表达量与菠菜叶酸含量高低变化呈正相关性，即在叶酸含量较高的“沪菠2号”中基因表达量较高。在黄豆中转入拟南芥AtGCHI[22]，在生菜[14]、番茄[23]中转入哺乳动物的GCHI基因都使植物叶酸含量上升了2～3倍，这些实验证明：过表达外源GCHI使得植物叶酸含量升高，已知SoGCHI是蝶呤路径合成第一步的限速酶，推测GCHI参与开启了叶酸合成的第一步，其可能受下游产物和基因的调控较少，当过表达GCHI时，植物叶酸含量升高。相反，SoADCS，SoGGH随着叶酸含量升高基因表达量呈下降趋势。ADCS是合成pABA路径的第一步限速酶，它会受到下游THF、二氢叶酸（DHF）和二氢蝶呤（DHP）的反馈抑制[24]，在水稻中过表达AtADCS，发现水稻籽粒中pABA大量积累，但叶酸含量降低为原来的1/10[15]，但是在小麦、玉米中共表达ADCS和GCHI可以使叶酸含量分别上升5.6倍和4.2倍[25]，甚至在水稻中共表达该组基因后叶酸含量比对照组高出100倍[15]，说明在植物中单纯过表达ADCS无法提高叶酸的含量，这也解释了为什么叶酸含量低的“澳绿”ADCS基因表达量比含量最高的“沪菠2号”ADCS表达量高。 GGH催化氨基苯甲酰基聚谷氨酸（pABA-Glun）脫谷氨酰化成pABA-Glu，成为合成pABA的前体物质，同时GGH使THF-Glun转化成THF，重新进入细胞质参加叶酸合成循环[8]。SoGGH在叶酸含量相对较低的“澳绿”和“日本大叶”中大量表达，与叶酸含量变化趋势相反，说明此时大量叶酸的谷氨酸尾被脱下而重新变为游离态，这与在拟南芥和番茄中3倍过表达GGH使叶酸含量下降[18]的实验结果一致，GGH的高表达让植物中以储存形式存在的叶酸转变为THF，使得可检测到的叶酸变少。
叶酸在线粒体中被合成后可以在线粒体和叶绿体中被甲基化，并以叶酸衍生物的形式参加C1循环。5-甲酰基四氢叶酸（5-CHO-THF）是一种稳定的氧化形式叶酸，不能被植物直接利用，5-甲酰四氢叶酸环化连接酶（5FCL）将5-CHO-THF转化为5，10-次甲基四氢叶酸（5，10=CH-THF），从而参与植物C1循环。结果发现：So5FCL，So5FCLL的相对基因表达量与叶酸含量呈相反的变化趋势，与在拟南芥中的研究结果类似，at5fcl突变体中5-CHO-THF含量显著增加，而用Zm5FCL回补at5fcl突变体后，突变体叶片中5-CHO-THF含量降低，恢复到野生型水平[26-27]。So5FCLL可能也具有类似的生物学功能，后续需要进一步分析叶酸各个组分的含量，尤其是5-CHO-THF含量，明确So5FCLL与菠菜5-CHO-THF含量及叶酸总量的关系。
除上述基因外，大部分基因表达量与叶酸总含量的关系还不清楚，可能与基因转录水平、蛋白水平的修饰有关，也可能与上下游产物及转录因子等参与的调控有关，后续还需要明确菠菜叶酸各组分含量并利用更多的分子生物学手段开展菠菜叶酸积累途径的研究。
4 结 论
菠菜叶酸合成代谢路径中的蛋白既保持了某些功能与邻近物种的一致性，又进化出适应于自己合成代谢的功能，体现了进化的多样性和复杂性。除SoGCHI，SoADCS和SoGGH外，大部分叶酸合成代谢途径相关基因的表达量与菠菜叶酸总含量没有明显的规律性，可能与代谢途径的反馈调控等有关，还需要通过其他实验进一步验证。
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（責任编辑：顾浩然，冯珍珍）
关键词： 菠菜（Spinacia oleracea L.）; 叶酸; 基因表达
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Abstract： In this paper，25 genes related to spinach’s（Spinacia oleracea L.） folate synthesis and transport，and to C1 metabolism were identified in the spinach genome database.The evolutionary tree and conserved domain analysis of the encoded protein showed that the folate protein showed conservative type and complexity in evolution.Using the technology of quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） to analyze the expression of folate-related genes in spinach with different folate content，it was found that only a few folate gene expression levels were related to the content of spinach folate at the transcription level.
Key words： spinach（Spinacia oleracea L.）; folate; gene expression
0 引 言
葉酸是水溶性B族维生素，在生物体内主要作为一碳单位的供体和受体，参与DNA合成、氨基酸代谢，以及各类化合物的甲基化过程。植物缺乏叶酸，则叶绿素、木质素等物质不能合成，光呼吸和氮代谢将受阻[1-3]。叶酸还在种子萌发、幼苗形成，以及植物开花等过程中发挥重要作用[4-5]。叶酸同时是人体自身不能合成但必不可缺的营养素，缺乏叶酸会导致巨幼红细胞性贫血和神经管畸形，还会导致体内同型半胱氨酸量降低[6-7]。针对植物叶酸积累规律的研究，对充分发挥叶酸在植物生长发育过程中的作用，增加作物产量和品质，提高叶酸在可食部位的积累水平，开发高叶酸作物新品种具有重要意义。
植物叶酸合成途径与细菌类似，叶酸的合成包括对氨基苯甲酸（pABA）的合成、蝶呤的合成，及叶酸的组装、加尾与转化三部分，分别定位在细胞质、质体和线粒体上[8]。叶酸合成会受到酶、基因等水平的反馈调控，合成后的代谢还涉及体内运转、降解与回补。单谷氨酸尾形式的四氢叶酸（THF）是唯一酶活性形式[9]，它既可以在亚细胞中合成各种形式的叶酸衍生物，也可以作为C1受体参与丝氨酸和甘氨酸的转化过程，接受C1基团后合成5，10-亚甲基四氢叶酸（5，10-CH2-THF）[10]。叶酸聚谷氨酸盐（THF-Glun）进入细胞质后有可能被光降解，降解产物可以在酶的作用下重新加入叶酸合成途径，蝶呤醛还原酶（PTAR）和γ-谷氨酸水解酶（GGH）是参与该途径的重要酶[8-11]。
过表达叶酸合成途径限速酶可以提高植物叶酸含量。编码三磷酸鸟苷（GTP）环化水解酶的基因（GCHI）在番茄、生菜、玉米中过表达，能将番茄果实、水稻胚乳，和生菜、玉米胚乳中的叶酸含量分别提高4，8.5和2倍[12-14]。共表达蝶呤合成分支的GCHI和pABA合成分支的氨基脱氧胆酸合成酶（ADCS）两个基因，能使水稻胚乳中的叶酸含量提高15～100倍[15]，是迄今为止利用转基因技术提高植物中叶酸含量最成功的例子。将GCHI与ADCS单表达后的转基因番茄进行杂交，也能够提高番茄果实叶酸含量达25倍，显著高于GCHI和ADCS单基因表达的番茄中叶酸的含量[16]。过表达两个叶酸组装过程中编码关键酶的基因二氢叶酸合成酶与叶酰聚谷氨酸合成酶双功能酶（DHFS/FPGS），二氢蝶呤合成酶（DHPS），发现转基因拟南芥中的叶酸含量分别较对照提高了20.6%～29.4%和19.0%～42.6%[17]。此外，叶酸主要以多尾形式存在，抑制GGH的活性，可使叶酸谷氨酸尾的平均长度增加，并且使叶酸的含量提高30%[18]。但大量研究发现：上述基因在不同植物中过表达对其叶酸含量的提高效果差异很大，说明植物叶酸合成代谢调控机制复杂，需要针对特定植物开展叶酸合成代谢机制的研究。
菠菜（Spinacia oleracea L.）是重要的世界性叶用蔬菜，是公认的叶酸含量较高的蔬菜（http：//www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/search/）。提高菠菜中的叶酸含量，可以在摄食较少的情况下，保证足量叶酸的摄取。此外，菠菜生育期短，适宜的温度下可种植8～10茬，实现全年供应，因此研究菠菜叶酸积累规律具有重要意义。目前关于菠菜叶酸积累规律的研究很少。WATANABE等[19]通过在水培菠菜中添加苯丙氨酸，促进了蝶呤合成路径和pABA合成路径的流量，从而提高菠菜中的叶酸含量，表明通过调节叶酸的合成与代谢路径可以实现菠菜中叶酸含量的提高。本研究拟通过同源序列比对和生物信息学分析，鉴定菠菜叶酸合成代谢相关基因，并分析其表达量与叶酸总量的关系，为揭示菠菜叶酸合成代谢机制，以及通过遗传改造途径提高菠菜叶酸含量，奠定初步基础。 1 材料与方法
1.1 基因序列获取与生物信息学分析
从拟南芥（Arabidopsis thaliana）、甜菜（Beta vulgaris）、番茄（Solanum lycopersicum）、烟草（Nicotiana tabacum）基因组数据库中获得叶酸合成代谢相关基因序列，在菠菜基因组数据库（http：//www.spinachbase.org/）进行BLAST分析得到菠菜叶酸合成代谢相关同源基因序列。通过SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/），PROSITE（https：//prosite.expasy.org/）对获得的蛋白质序列进行保守结构域预测和分析。用MEGA 7.0（neighbor-joining，bootstrap n=1 000）绘制进化树。
1.2 材料培养与叶酸含量测定
在对本课题组存有的菠菜种质资源叶酸含量筛选的基础上，选择“日本大叶”（潍坊格瑞种子有限公司）、“沪菠2号”（上海师范大学）、“澳绿”（广州南蔬农业科技有限公司）3个叶酸含量差异较大的菠菜材料，用作基因表达研究。将菠菜种子播种于以泥炭和珍珠岩混合比例（体积比）为1∶1的基质穴盘中，置于上海师范大学植物种质资源开发中心人工气候室中育苗，光照时长为：10 h光照，14 h黑暗;光照强度为5 200 lx;湿度约为68%。待幼苗长至两叶一心期，选取大小长势一致的幼苗小心洗去根部土壤后放入营养液（1/2 Hoagland，微量元素使用Arnon配方）中水培，水培液每隔3 d更换一次，控制pH值为6.8左右，待菠菜生长30 d后，采样，取叶片液氮速冻。一部分样品于冻干机中冻干，研磨成粉，一部分样品存入-80 ℃冰箱备提RNA。
采用荧光分光光度法测定菠菜中的叶酸总含量。取菠菜叶片冻干粉各0.02 g于5 mL棕色离心管中与1 mL物质的量浓度为0.1 mol?L-1，pH值为6.8的磷酸缓冲液（含质量分数为1%的L-抗坏血酸和体积分数为0.2%的2-巯基乙醇）混匀后先沸水浴后冰浴，再加入600 μL木瓜蛋白酶溶液，37 ℃摇床孵育1 h，取出，以100 ℃水浴终止酶活性后，离心取上清液，在上清液中加入80 μL大鼠血清后用磷酸缓冲液补充体积至2 mL，孵育2 h，最后取出先沸水浴再冰浴，离心后取上清液，上清液最终经灭菌的滤孔直径为0.45 μm的滤膜筛滤后备测，提取全程在弱光环境中进行。测定前在15 mL离心管中加入400 μL叶酸提取液和100 μL 20%（体积分数）冰乙酸溶液混匀，随后用4%（质量分数）高锰酸钾溶液和3%（体积分数）过氧化氢溶液分别滴定混合液，最后用超纯水定容至10 mL。用荧光分光光度计（安捷伦，Cary Eclipse）于激发波长（Ex）为370 nm，发射波长（Em）为400～600 nm处扫描测荧光强度。预试验结果表明：扣除空白实验背景值后，该方法的叶酸回收率为85%～90%。
1.3 实时荧光定量法测定基因表达量
使用TRIzol法提取菠菜样品中的总RNA。使用TaKaRa PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒将提取的RNA反转录成互补DNA（cDNA），最后使用TaKaRa TB Green TM Premix Ex Taq TM（Tli RNaseH Plus）试剂盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR仪器上进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。以菠菜18S为内参，以2-ΔCt法计算基因相对表达量。设计qRT-PCR引物序列（表1），熔解温度（Tm）控制在57～61 ℃。
2 结 果
2.1 菠菜叶酸合成代谢相关基因确定
根据同源搜索获得25个菠菜叶酸合成代谢相关基因（表2），其中11个基因与C1代谢途径有关，14个基因与叶酸合成转运有关。丝氨酸羟甲基转移酶基因（SHMT1）编码两个蛋白SHMT1a和SHMT1b，5-甲基四氢叶酸环化酶基因（5FCL）也编码两个同源蛋白5-甲酰四氢叶酸环化连接酶（5FCL）和5FCLL。GCSH，GCSL，GCSP，GCST是组成甘氨酸脱羧酶复合物（GDC）的4种蛋白。
2.2 保守结构域分析
对菠菜（S.oleracea，So）、拟南芥（A.thaliala，At）、番茄（S.lycopersicum，Sl）、烟草（N.tabacum，Nt）和甜菜（B.vulgaris，Bv）的叶酸合成代谢相关蛋白进行保守域结构分析，由表3～4可知：从结构域数量看，菠菜相关基因的结构域和其他物种总体相似，偶尔有个别结构域在某一个物种中存在或丢失，如GTAse 2在甜菜中不存在，PIKKc_ATR，FAT，UME，FATC只在烟草中出现;从结构域种类来看，除了个别蛋白如MTHR与烟草差异较大外，菠菜与其他植物叶酸相关蛋白结构域种类基本一致;从结构域长度来看，大部分结构域在不同物种间氨基酸数量相同，如二氢叶酸还原酶蛋白（DHFR）的2个结构域在5个物种中长度都相同;少部分结构域长度不同，如菠菜ADCS蛋白的GATsae 1结构域由164个氨基酸组成，与甜菜、烟草、番茄均不相同;又如5FCL蛋白，在菠菜中只有一个由207个氨基酸组成的5-FTHF_cyc-lig，而拟南芥和甜菜中则有2个5-FTHF_cyc-lig。
2.3 进化树分析
使用MEGA 7.0的Neighbor-joining算法对菠菜（S.oleracea）、拟南芥（A.thalian）、甜菜（B.vulgaris）、番茄（S.lycopersicum）和烟草（N.tabacum）的叶酸相关蛋白构建进化树（图1）。菠菜叶酸合成转运相关蛋白中，除DHFR，DHFS和GCHI 3个蛋白外，其他蛋白都与甜菜具有極高的相似性，可信度大于90%，说明菠菜的叶酸合成相关蛋白在进化上与甜菜更接近，这与菠菜和甜菜同属苋科是相符的。GCHI在菠菜中的进化表现出相对原始的状态，而DHFS则与烟草有更高的相似性。 如图2所示：大部分菠菜C1代谢相关蛋白与甜菜同源性更高，可信度大于90%，少数蛋白如So10-FDF与At10-FDF蛋白同源性最高，而SoGCSP和SoFTHS单独进化为一支，其他菠菜C1蛋白尽管与供试物种间没有特别高的同源性，但也表现出70%以上的可信度。此外，同一蛋白的进化显示出复杂性，虽然5FCL，5FCLL和SHMT1a，SHMT1b是分别由基因5FCL和SHMT1编码的两组蛋白，但5FCL，SHMT1a与其同源蛋白5FCLL，SHMT1b相比，都显得更原始，在进化树上表现为单独一支，而另外两个蛋白则与甜菜蛋白同源性更高。
2.4 菠菜品种间叶酸合成代谢相关基因表达谱
供试的3个菠菜品种的叶片叶酸含量差异显著，“澳绿”叶酸质量分数最低，仅为32.32 μg?g-1 DW（干重）;“沪菠2号”质量分数最高，为97.05 μg?g-1 DW，两者之间的差值达64.73 μg?g-1 DW;“日本大叶”叶酸质量分数介于两者之间，为77.10 μg?g-1 DW。
qRT-PCR分析了3个菠菜品种中叶酸合成转运相关基因的表达量（图3），结果显示：GCHI的相对基因表达量高低与叶酸含量高低变化趋一致，而ADCS和GGH则呈现相反的规律性。在叶酸含量最高的“沪菠2号”中，NUDT，DRTS/DHFS，FPGS，HPPK/DHPS，PTAR 5个基因的表达量相比另外2个品种显著降低。叶酸含量居中的“日本大叶”的ADCL，DHNA和DHFR基因表达量要显著高于含量最高的“沪菠2号”，这与其他基因表达量的结果都有所不同。
参与C1代谢的叶酸基因中，GCSP，MTHR，10-FDF与SHMT1b的基因表达量在叶酸含量最低的“澳绿”中最高;而DHC，GCST，MS，SHMT1b在叶酸含量居中的“日本大叶”中表现出较高的表达量。相对来说，参与C1代谢的基因表达量与叶酸含量之间没有表现出明显的规律性（图4）。
3 讨 论
通过生物信息學分析找到了25个菠菜叶酸合成代谢途径相关基因，包括：参与对pABA合成的ADCL，ADCS，参与蝶呤合成的GCHI，NUDT，DHNA，与叶酸组装加尾有关的DRTS/DHFR，DHFS，HPPK/DHPS，参与叶酸聚谷氨酰化与胞内转运补救途径的FPGS，GGH，PTAR，还有与C1代谢相关的DHC，FTHS，GCSH，GCSL，GCSP，GCST，MS，MTHFR，PURU，SHMT3，以及SHMT1等。
与拟南芥和番茄相比，菠菜叶酸合成代谢相关基因数目存在明显的基因丢失现象。拟南芥中AtFPGS有3个同工型，分别定位于线粒体、细胞质和叶绿体[4]，番茄基因组中定位到在质体和线粒体中有2个SlFPGS的同工型[20]，而菠菜只定位到1个FPGS。同样地，菠菜中分别只定位到1个DHFR，DHNA和ADCL，而拟南芥中DHFR和DHNA有3个同工型，番茄中ADCL有2个胞质同工型[20]。猜测这些基因在菠菜中只在固定的细胞器中执行功能，与其他植物的多细胞器同时行使功能的情况不同。
通过比对不同物种同源蛋白的结构域种类和长度，可以了解菠菜叶酸相关蛋白的酶活性和进化保守程度。结果显示：菠菜叶酸相关蛋白结构域和相比较的4种植物的蛋白结构域种类基本保持一致，除NtADCS1，BvPTAR，BvFTHS，NtMTHR3这4个蛋白外，其他参与叶酸合成转运与C1代谢的相关蛋白保守结构域在不同植物中的结构域类型是相同的。同时也发现：只有参与合成转运的蛋白ADCL，FPGS及参与C1代谢的叶酸蛋白5FCLL，GCSH，GCST在不同物种中的氨基酸数量保持一致，而其他蛋白结构域在不同植物中长度有所差异，其中多以拟南芥的某个蛋白结构域多一个或少一个氨基酸的情况出现，如DHC的THF_DHG_CYH_C比其他植物同类结构域多一个氨基酸。此外，即使是同源蛋白如5FCL与5FCLL，它们的保守结构域都是5-FTHF_cyc-lig，但是5FCL的结构域氨基酸数量在不同植物中完全不同，而5FCLL则完全相同。最后，单独比较菠菜叶酸相关蛋白的结构域可知，处在同一个循环中的蛋白可以拥有执行相同功能的结构域，如都参与DNA循环的FTHS和10-FDF，它们的结构域分别是PLN02331和Formyl_trans_N，两者虽然名称不同，但是都与10-甲酰基四氢叶酸还原成四氢叶酸的过程有关;Mur_ligase_M在与叶酸合成有关的FPGS和DHFS两个蛋白中都存在，虽然结构域长度不同，但是它们的功能都是将谷氨酸盐分别连接至叶酰聚谷氨酸盐或单谷氨酸中，与玉米中的结果一致[21]。结合进化树分析，菠菜叶酸合成转运蛋白除DHFR，DHFS和GCHI外，其他蛋白都显示出与甜菜进化的高度相似性;菠菜叶酸C1代谢蛋白则展示出更复杂的进化程度，即使是同源蛋白5FCL与5FCLL也会进化出不同方向，5FCLL表现得更原始。总的来说，虽然菠菜叶酸相关蛋白在进化上出现复杂性且功能也变得多样化，但是在进化上是非常保守的，且与同属于苋科的甜菜表现出高度同源性。
为了研究菠菜叶酸含量与叶酸相关基因表达量间的关系，对已测得叶酸含量的3个菠菜品种进行qRT-PCR，结果显示：SoGCHI基因表达量与菠菜叶酸含量高低变化呈正相关性，即在叶酸含量较高的“沪菠2号”中基因表达量较高。在黄豆中转入拟南芥AtGCHI[22]，在生菜[14]、番茄[23]中转入哺乳动物的GCHI基因都使植物叶酸含量上升了2～3倍，这些实验证明：过表达外源GCHI使得植物叶酸含量升高，已知SoGCHI是蝶呤路径合成第一步的限速酶，推测GCHI参与开启了叶酸合成的第一步，其可能受下游产物和基因的调控较少，当过表达GCHI时，植物叶酸含量升高。相反，SoADCS，SoGGH随着叶酸含量升高基因表达量呈下降趋势。ADCS是合成pABA路径的第一步限速酶，它会受到下游THF、二氢叶酸（DHF）和二氢蝶呤（DHP）的反馈抑制[24]，在水稻中过表达AtADCS，发现水稻籽粒中pABA大量积累，但叶酸含量降低为原来的1/10[15]，但是在小麦、玉米中共表达ADCS和GCHI可以使叶酸含量分别上升5.6倍和4.2倍[25]，甚至在水稻中共表达该组基因后叶酸含量比对照组高出100倍[15]，说明在植物中单纯过表达ADCS无法提高叶酸的含量，这也解释了为什么叶酸含量低的“澳绿”ADCS基因表达量比含量最高的“沪菠2号”ADCS表达量高。 GGH催化氨基苯甲酰基聚谷氨酸（pABA-Glun）脫谷氨酰化成pABA-Glu，成为合成pABA的前体物质，同时GGH使THF-Glun转化成THF，重新进入细胞质参加叶酸合成循环[8]。SoGGH在叶酸含量相对较低的“澳绿”和“日本大叶”中大量表达，与叶酸含量变化趋势相反，说明此时大量叶酸的谷氨酸尾被脱下而重新变为游离态，这与在拟南芥和番茄中3倍过表达GGH使叶酸含量下降[18]的实验结果一致，GGH的高表达让植物中以储存形式存在的叶酸转变为THF，使得可检测到的叶酸变少。
叶酸在线粒体中被合成后可以在线粒体和叶绿体中被甲基化，并以叶酸衍生物的形式参加C1循环。5-甲酰基四氢叶酸（5-CHO-THF）是一种稳定的氧化形式叶酸，不能被植物直接利用，5-甲酰四氢叶酸环化连接酶（5FCL）将5-CHO-THF转化为5，10-次甲基四氢叶酸（5，10=CH-THF），从而参与植物C1循环。结果发现：So5FCL，So5FCLL的相对基因表达量与叶酸含量呈相反的变化趋势，与在拟南芥中的研究结果类似，at5fcl突变体中5-CHO-THF含量显著增加，而用Zm5FCL回补at5fcl突变体后，突变体叶片中5-CHO-THF含量降低，恢复到野生型水平[26-27]。So5FCLL可能也具有类似的生物学功能，后续需要进一步分析叶酸各个组分的含量，尤其是5-CHO-THF含量，明确So5FCLL与菠菜5-CHO-THF含量及叶酸总量的关系。
除上述基因外，大部分基因表达量与叶酸总含量的关系还不清楚，可能与基因转录水平、蛋白水平的修饰有关，也可能与上下游产物及转录因子等参与的调控有关，后续还需要明确菠菜叶酸各组分含量并利用更多的分子生物学手段开展菠菜叶酸积累途径的研究。
4 结 论
菠菜叶酸合成代谢路径中的蛋白既保持了某些功能与邻近物种的一致性，又进化出适应于自己合成代谢的功能，体现了进化的多样性和复杂性。除SoGCHI，SoADCS和SoGGH外，大部分叶酸合成代谢途径相关基因的表达量与菠菜叶酸总含量没有明显的规律性，可能与代谢途径的反馈调控等有关，还需要通过其他实验进一步验证。
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（責任编辑：顾浩然，冯珍珍）