【摘 要】
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目的 利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区(DENV-1～4EDⅢ),获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ.方法 PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因,构建至pPIC9K毕赤酵母表达质
【机 构】
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南方医科大学珠江医院医学检验中心,生物芯片上海国家工程研究中心
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目的 利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区(DENV-1～4EDⅢ),获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ.方法 PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因,构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒.酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,涂板后经G418梯度浓度筛选,获得多株抗G418 4.0 mg/ml的高拷贝菌株,扩大培养后,利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白,表达上清用Ni-NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定.结果 成功构建pPIC9K-DENV-1～4 EDⅢ重组质粒,高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白,纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳,相对分子质量约为12×103,与实际相符.免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合.结论 成功通过毕赤酵母高效分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白,这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究.
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