【摘 要】
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目的 利用siRNA靶向沉默永生化人角质形成细胞(HaCaT细胞)KRT9R163W表达,共聚焦显微镜观察转染前后细胞骨架结构变化,探讨KRT9R163W突变在表皮松解性掌跖角化症的发病机制中的作用.方法 ①构建KRT9野生型及KRT9R163W突变型质粒转染入HaCaT细胞过表达.②设计针对KRT9R163W基因的特异性野生型及突变型siRNA,利用脂质体转染HaCaT细胞,并设立阴性对照组、阳性对照组及空白对照组.③通过荧光定量聚合酶链反应(qPCR)及Western印迹检测HaCaT细胞KRT9基因
【机 构】
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830001乌鲁木齐,新疆维吾尔自治区人民医院·新疆皮肤病研究重点实验室(XJYS1707)
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目的 利用siRNA靶向沉默永生化人角质形成细胞(HaCaT细胞)KRT9R163W表达,共聚焦显微镜观察转染前后细胞骨架结构变化,探讨KRT9R163W突变在表皮松解性掌跖角化症的发病机制中的作用.方法 ①构建KRT9野生型及KRT9R163W突变型质粒转染入HaCaT细胞过表达.②设计针对KRT9R163W基因的特异性野生型及突变型siRNA,利用脂质体转染HaCaT细胞,并设立阴性对照组、阳性对照组及空白对照组.③通过荧光定量聚合酶链反应(qPCR)及Western印迹检测HaCaT细胞KRT9基因mRNA及蛋白水平表达.④共聚焦显微镜观察siRNA转染前后细胞骨架结构变化.结果 ①KRT9R163WsiRNA转染HaCaT细胞48 h后,细胞的KRT9基因mRNA表达水平明显降低(0.242±0.051,P＜0.05);转染72 h后,靶向siRNA对蛋白表达有统计学差异(0.289±0.036,P＜0.01).②KRT9R163W高表达时,细胞骨架结构为错综复杂的网状结构,且部分细胞骨架结构消失.③siRNA特异性沉默KRT9R163W基因后,细胞骨架结构恢复正常的束状排列.结论 KRT9R163W高表达可影响细胞的正常细胞结构,通过siRNA技术进一步验证KRT9R163W为表皮松解性掌跖角化症的致病突变基因,为表皮松解性掌跖角化症发病机制研究及靶点治疗提供新的理论基础.
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