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摘要SSR（simple sequence repeat ）分子标记是以聚合酶链式反应（PCR）技术为基础的共显性分子标记，也称为微卫星标记（microsatellite markers），其具有多态性高、通用性好、易检测且操作简单等优点，已被较多应用于苹果的品种鉴定、遗传多样性分析以及遗传图谱构建和基因定位等方面。就以上方面对苹果中SSR分子标记的应用进行概述并提出SSR分子标记在未来苹果中的研究重点和方向。
关键词苹果；SSR；品种鉴定；遗传多样性；遗传连锁图谱
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）21-06942-04
Application Status of SSR Molecular Markers in Apple
JI Xiaofan，XIE Yinfeng et al （School of Forest Resource and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing，Jiangsu 210037）
Abstract SSR （simple sequence repeat） is a codominant marker based on the polymerase chain reaction technique（PCR），also known as microsatellite markers. It has high polymorphism，good commonality，easy detection and simple operation etc，have been more applied in apple variety identification，genetic diversity analysis，genetic map construction and gene location. In this paper，the above aspects are summarized and the research emphasis and direction of application of SSR molecular markers in apple for the future are put forward.
Key words Apple； Simple Sequence Repeat； Variety identification； Genetic diversity； Genetic map construction
基金项目江苏省农业自主创新资金项目[CX12（2043）]； 江苏省科技支撑计划项目（BE2012442）； 江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）。
作者简介季晓钒（1989- ），女，江苏镇江人，硕士研究生，研究方向：植物生理学。*通讯作者，教授，从事植物生理生化方面的研究。
收稿日期20140623蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus）植物在全球分布较为广泛，原生于北半球的温带地区，后在欧洲、亚洲及北美洲均有发现。全世界苹果属植物约有35个种，我国原产27个种，其中野生种21个，栽培种6个[1]。苹果属种质资源丰富、种类多、分布广[2]。
前人对苹果的品质性状[3-4]、抗病性[5-6]、砧木的选育[7]以及遗传方面[8]已经进行了大量的研究。研究方法除外观形态方面的调查整理外，主要采用DNA分子技术。DNA分子技术主要分为两类：一类是以Southern杂交为核心的分子标记技术——RFLP，但其存在操作繁琐、信息含量低的缺点[9]；另一类是基于PCR的DNA分子技术，主要有RAPD、AFLP、ISSR及SSR分子标记技术。其中RAPD分子技术虽然可以检测多个基因位点，但不能识别杂合子位点[10]，且试验重复性差[11]；而AFLP分子技术虽然相比于RFLP和RAPD 2种分子技术具有高的稳定性，但对基因组纯度和反应条件要求较高[12]；ISSR分子标记采用随机引物，而SSR分子标记利用特异性引物进行标记。SSR分子标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，与其他分子标记相比，SSR分子标记具有分布广泛、数量丰富、稳定性好、多态性高等优点[13]，可鉴别出纯杂合子的共显性等遗传特征[14]。因此SSR标记已被广泛应用于苹果的品种鉴定、亲缘关系和遗传多样性、遗传图谱和系谱构建以及基因标记等方面的研究。
1SSR分子标记概述
SSR标记由Moore等于1991年创立，是现今流行的分子标记技术之一。SSR（simple sequence repeat）即简单序列重复，通常又称为微卫星（microsatellite）[15]，主要是以1～4个核苷酸为基本单位的串联重复序列，其长度在150 bp左右。根据串联重复序列的来源，SSR分子标记主要分为由功能基因组成的（如rRNA和组蛋白基因）的基因组SSR（genomic SSR，gSSR）和利用转录组序列开发的转录组SSR 2种。EST（expressed sequence tags）即表达序列标签，是指从cDNA文库中随机挑选单克隆进行测序所获得的序列片段[16]。利用转录组序列开发的SSR标记具有操作更简易和成本低等优点[17]，因其与功能基因关系密切，所以在近缘种群内具有很高的通用性。近年来随着新一代测序技术的发展，可以快速大量的得到转录组数据使得ESTSSR分子标记迅速发展，对转录组SSR分子标记的利用目前已成为很多学者研究植物遗传方面的重要方法[18-20]。
SSR标记作为第二代分子标记，已广泛应用于园艺植物和林木上[19-22]。在园艺植物葡萄中，THOMAS等[23]发现微卫星序列为鉴别欧亚种葡萄品种（Vitis vinifera L.）提供了有价值信息，SSR位点还可转移到葡萄属不同种的研究，同时发现SSR标记为共显性遗传，适合用来构建遗传图谱和遗传关系的研究[24]。马丽丽等[21]以SSR分子标记对16份柑橘属及近缘材料进行DNA扩增分析，发现早花柠檬与枸橼的遗传相似系数最高，为此类植物的分类提供了更多的线索。在林木上，张毅等[25]利用ESTSSR标记对茶树的DNA上进行扩增分析从而鉴别出不同品种。在杨树新杂种的SSR分析和鉴定方面，刘春英等[26]选用3对引物构建5个杨树品种的指纹图谱，且每个品种在此图谱中都有自身独特的片段。研究表明，利用SSR分子标记技术对植物遗传多样性和亲缘关系进行分析，可选出更优质的品种进行育种进而带来更多的经济价值[27]。 2苹果中SSR分子标记的应用
2.1品种鉴定苹果作为世界上重要果树之一，其栽培历史悠久，由于种间杂交、无性繁殖以及各自栽培品种的混交所导致外观个体表型差异小，同名异物和同物异名现象普遍存在。解决这些问题需要进行品种鉴定，目前品种鉴定的方法主要是有：①大田鉴定法：即将叶、花、果实等组织器官的颜色、形态等作为观测指标进行品种区分[28]；②生化标记：主要包括蛋白质电泳和同工酶电泳等方法进行品种鉴别；③DNA分析，如SSR分子标记。大田鉴定法主要是通过人工观测，需要大量的经验，具有一定的局限性，而应用同工酶鉴定品种真实性和纯度时往往有组织或器官特异性。利用SSR分子标记在DNA分子水平上的品种鉴定，具有更高的准确性和效率，目前SSR分子标记成为苹果品种鉴定的主要方法之一。
早在1997年，GUILFORD等[29]首次开发了苹果的14个SSR引物，并用其中3个引物鉴别出21个苹果栽培品种，仅用引物（23g4）就区分出了21个品种中的40%。王爱德等[2]用GD142和ch02b01 2对引物区分了25个苹果品种。高源等[30]利用SSR技术对59份苹果属材料进行基因组多态性分析，得出遗传多样性指数为0.615 6，并仅用3对引物（CH02a04、CH02g04和CH01f03b）即区分开全部供试材料。此后，高华等[31]利用SSR分子标记对苹果栽培品种进行鉴定，用3对引物（Hi01c11、Hi03d06和GD162）将供试的40个苹果栽培品种进行鉴定分类。李荷蓉等[32]利用ESTSSR引物可以把22个苹果品种区分开，聚类分析后在遗传相似系数为0.84处，可以将全部苹果品种分为8个组。FORONI等[33]对在亚速尔群岛采得的200个苹果栽培品种进行微卫星分析，发现这些样品具有高度变异性，并最终鉴别出60个异名同物和32个同名异物。由此可见，对于苹果品种鉴定和区分同名异物等方面，SSR标记是一项可靠高效的分子技术。
砧木是嫁接繁殖时承受接穗的植株，也是果树嫁接苗的基础，很多学者就苹果砧木也进行了大量DNA层面的分析。2010年金万梅等[7]利用SSR分子标记对3个不同研究所所保存的28份SH系苹果砧木进行鉴定，发现许多同名异物、异名同物等，如昌平的SH18与昌平的SH38（98.4%）。2013年马荣群等[34]应用SSR标记鉴定无融合生殖苹果砧木杂种实生苗，并建立了SSR体系且可快速、准确、高效地鉴定早期无融合生殖苹果砧木F1代有性杂种，检出率达100%。巴巧瑞等[35]采用SSR和SPAP 2种分子标记技术，分析了苹果（Malus domestica Borkh.）重要栽培品种的亲缘关系，结果表明，苹果品种被分为六大类，大多数品种符合传统遗传图谱，但也有无血缘关系的聚为一类，该研究为苹果杂交育种亲本及组合的选配提供了参考。由此可见，SSR标记不仅可以进行苹果的品种鉴定，还为种质资源的保存和收集提供了依据。VAN TREUREN等[36]也认为对苹果的基因型进行微卫星标记分析是种质资源管理和品种鉴的一项有效工具。
2.2遗传多样性分析遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，蕴藏在各种生物的基因组中。对物种进行遗传多样性研究的前提是进行遗传多样性分析，确定其遗传距离，进而弄清其亲缘关系。系统化的遗传多样性分析研究对于物种种质资源收集、保存及选育方面具有重要意义。SSR标记具有数量丰富、信息量大、多态性高等优点，不论物种是否为同一基因型还是亲缘关系较近的品种，其试验操作简易、结果稳定可靠，对于苹果资源而言，多数利用此方法进行遗传多样性的研究。
高华等[31]利用12对SSR引物对40个苹果栽培品种进行遗传多样性分析，聚类分析后发现40个苹果品种的遗传多样性较高，其相似系数为0.705～0.982，在相似系数0.862处被分为五大类群，这与品种的系谱来源基本吻合。ZHANG等[37]以29个苹果样品为研究对象，包含12个来自于我国7个地方的苹果种、4个地方品种及13引进栽培品种。利用19个分别存在于17个苹果的不同基因组连锁群上的SSR标记进行遗传多样性分析，结果表明一些品种具有16个独特的等位基因，其中10个在野生品种中也被发现，证明了我国野生苹果种具有较高的遗传多样性。利用SSR标记不仅能对栽培变种进行遗传多样性分析鉴定，还对种系或品种间的亲缘关系进行了验证，从而将通过对亲本的选择将野生型优良基因转移到栽培种中，为杂交选育提供了选择依据。
秦伟等[38]以SSR标记对21份新疆地区的苹果种质资源进行了亲缘关系分析，聚类分析结果显示，若以遗传相似系数0.63为阈值，可将这21份地方资源聚类成3组，且地方品种和野生品种交叉分布说明了地方品种可能是由野生品种直接驯化而来，或是长期杂交或遗传变异造成的。高源等[39]利用在SSR扩增产物检测过程中的一种分析技术体系TPM 13SSR，对25份苹果种质资源的地方品种进行了遗传多样性研究，得到其遗传多样性、多态性信息含量和位点杂合度等多个信息，并利用UPGMA法聚类分析将25个苹果品种分为二大类，揭示其与地理起源和亲缘关系相关。随后JIN等[40]利用SSR分子标记对41个苹果砧木进行了遗传多样性分析，将41个苹果砧木分为5个组，结果表明育种可以在这五大组的种质资源中选择具有根茎表型的品种。通过遗传关系的分析，进而评价不同品种间的异质性且进行优势种群的选择。
安徽农业科学2014年PATZAK等[41]通过对捷克苹果品种进行遗传多样性和遗传关系评估分析，将捷克苹果品种分为3个主要群组，微卫星是进行遗传资源评价的高效便捷的方法。FU等[42]使用10个简单的SSR标记对15个同型小种的苹果属进行了基因组多态性和遗传关系分析，得出遗传相似系数为0.53～0.88。表明这一物种具有较高的遗传多态性。2013年董研等[8]利用12个连锁群的17对SSR引物对新疆巩留、新源、霍城、托里4个居群下的12个新疆野苹果天然群体进行群体等位基因和基因型差异分析，得出XY1、HC2群体的基因多样性较高，巩留居群与新源居群的遗传关系最近。宋尚伟等[43]开发了苹果ESTSSR引物并筛选出16对ESTSSR引物对苹果品种资源的亲缘关系进行研究并聚类成树状图，在相似性系数0.65处可将118个供试材料分为五大组。FARROKHI等[44]通过对伊朗苹果栽培品种和地方品种进行遗传多样性的评估，在16个SSR位点生成45个等位基因，多态性信息含量（PIC）0.18～0.76，其平均值为0.49。根据Jaccard'相似系数和UPGMA聚类法将苹果基因型分为2组。又一次证实SSR标记是一个在苹果育种程序中能进行精确遗传多样性研究的可靠DNA标记。在苹果遗传多样性研究方面，SSR标记可以准确地对苹果不同品系进行遗传多样性评估，通过聚类分析能够反映出品种的品种特性、地域特性和亲缘关系。 2.3遗传连锁图谱的构建及QTL定位建立遗传连锁图谱是基因组研究中的一个重要环节。随着分子标记特别是SSR分子标记的迅速发展，使得构建各类物种的遗传连锁图相对较易。SSR分子标记不仅简化了遗传多样性分析的过程，还利于不同作图群体间的标记转换。其作为高效的构建遗传连锁图的工具，已经广泛应用于苹果的遗传多样性分析和图谱构建方面[45]。在构建遗传连锁图后，进行标记找到基因组中的功能基因和数量性状位点（quantitative trait loci，QTL）并进行连锁分析来确定该功能基因及QTL的位置。这为基因定位和克隆、品种间标记间转换等奠定了基础。基因标记是基因定位克隆以及分子辅助选育的前提，其目的是筛选与目的基因紧密连锁的遗传标记。
1998年，MAILEPEARD等[46]用苹果品种“Prima”דFiesta”的152株F1群体为材料，利用RFLP、RAPD、AFLP和SSR等多种标记手段构建了双亲的遗传连锁图。选择合适的引物是构建苹果分子指纹图谱的重要前提[47]。LIEBHARD等[48]利用129个SSR以及其他分子标记构建了苹果的遗传图谱，这些SSR标记分别分布在17条连锁群上，这为苹果的品种鉴定、种质资源保存以及基因定位奠定了基础。此后SILFVERBERG等[49]开发了148个微卫星标记并在“Fiesta”דDiscovery”品种的连锁图上定位。其中117个来自于基因组库，31个是从EST序列中开发得到。MORIYA等[50]利用新开发的ESTSSR标记构建了苹果砧木品种“JM7”和苹果属三叶海棠“Sanashi 63”的对齐式基因连锁图。其中89个同源重叠群上的ESTSSR标记经过图谱分析识别被定位到相同的连锁群上，其余48个ESTSSR标记对应到重叠群上定位于不同的连锁群上。2012年，王立新等[51]利用匀位于苹果17对染色体上的35对多态性高、重复性好的引物对40个苹果栽培品种进行图谱构建。刘遵春等[52]在研究新疆野苹果分离群体方面发现“红富士”和新疆红肉苹果的遗传差异较大，并证实选取该群体作为构建新疆野苹果遗传连锁图镨的作图群体是合适的。目前利用分子标记在构建苹果遗传图谱方面也已经取得了一定的成功。未来利用遗传图谱可以更有效地对苹果抗病性及性状进行遗传分析与基因定位。
ALSTON等[53]认为采用与目标性状紧密连锁的分子标记有针对性地对特定基因进行辅助选择，可以不受生态条件及植物生长年限的制约，简便迅速地进行杂种后代的早期选择。2006年，姚玉新等[54]采用分离群体分组分析（BSA）法，用SSR引物筛选出遗传距离为8.89 cm的苹果酸度基因，并标记SDY085。2013年王雷存等[55]利用SSR技术并结合集群分类分析法获得了与果实酸性状紧密连锁的距离为3.24和2.31 cm的分子标记CH03d12104和CH03d12118 2个位点，分析表明Ma1与Ma2对果实含酸量有控制作用，Ma对ma表现为完全显性。李爽等[56]将抗早期落叶病基因定位到了遗传连锁图谱中的第10个连锁群上后，能够将抗病基因等有特定功能的基因定位到遗传连锁图中，这为抗病育种提供了理论依据。
近年来，在国外对基因标记和定位方面也作了相应的研究，2012年，FERNNDEZFERNNDEZ等[57]将苹果属的142个全基因组序列支架中的282.4 Mbp的序列均定位到“M.27”דM.116”杂交的图谱中。这可被用来识别对那些农艺性状负责的基因，如控制矮化和水分利用效率的基因。2007年，KENIS等[58]发现数量性状位点（QTL）的一个主要集群位于“Telamon”上的Co基因区域，并确认了Co基因对树木形态具有重要影响。2013年，BALDO等[59]发现了Co基因（柱形基因）与SSR标记Co04R12共分离，且被确定在SSR标记Co04R11和Co04R13之间0.56 cm距离的区域，对应到“Golden delicious”（金冠）苹果基因组序列的393 kb范围上，这为Co基因的克隆奠定了基础。通过基因定位找出苹果资源的抗病性、农艺性状、品质性状和基因之间的关系，为未来所需要的品质性状进行进一步的转基因工程。
随着新一代的测序技术的发展，使得高质量的苹果基因组序列图的绘制成为可能，VELASCO等[60]以栽培品种金冠（Golden Delicious）苹果为材料，借助于新一代测序平台构建了苹果基因组的物理图谱，共产生122146 contigs，1629 scaffolds，总contigs长度达603.9 Mb，约占估计苹果基因组的81.3%。该研究表明苹果亚科植物发生过一次相对较新的全基因组复制，由祖先的9个染色体转变为17个染色体，进行植物分类学后发现栽培苹果的祖先为新疆野苹果（M.sieversii）。同时研究还发现与果实发育相关的基因家族存在大量的基因复制现象。此项研究也为今后SSR分子标记在苹果中研究的进一步拓展和延伸提供了基础。
3展望
随着近年来SSR分子标记技术的成熟，现今已被广泛应用于苹果品种鉴定、苹果种内亲缘关系和遗传多样性分析、遗传连锁图的构建以及基因定位克隆等方面。但目前利用SSR分子标记对苹果的抗性基因标记定位的研究尚有不足，对控制苹果重要农艺性状的数量性状基因研究也较少，苹果的全基因组序列图也有待进一步精细绘制。因此，笔者认为后续研究需在以下方面进一步深入和拓展：①目前公布的苹果基因组序列图仅为草图，虽然为研究苹果起源和寻找某些与重要性状相关的基因提供了依据，但还需对苹果基因组图进行进一步的精细绘制，进行更多的数量性状的连锁分析其定位，从而寻找出与重要农艺性状连锁紧密的分子标记，通过优良基因型的选择从而提高苹果选育质量，缩短选育时间；②通过中间杂交、突变体筛选，利用基因定位和克隆寻找出我国苹果资源的抗性和品质基因之间关系以及对杂交优势的预测；③通过对苹果的遗传连锁图谱的补充和完善，为具有经济价值和研究价值的苹果品质性状进行基因定位和转基因工程的发展奠定基础；④对苹果野生型品种和优良的栽培品种建立指纹图谱以丰富苹果的指纹图谱库，从而更好地为苹果的品种鉴定、育种和生产提供参考；⑤加强SSR标记在无融合生殖苹果砧木杂交后代中检测非母本类型（有性杂种）方面的应用研究，提高无融合生殖砧木杂交育种效率。随着分子技术的不断发展和完善，以及SSR分子标记技术在苹果中的不断运用，苹果资源的研究体系和范围将迎来更好的未来。 参考文献
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Abstract SSR （simple sequence repeat） is a codominant marker based on the polymerase chain reaction technique（PCR），also known as microsatellite markers. It has high polymorphism，good commonality，easy detection and simple operation etc，have been more applied in apple variety identification，genetic diversity analysis，genetic map construction and gene location. In this paper，the above aspects are summarized and the research emphasis and direction of application of SSR molecular markers in apple for the future are put forward.
Key words Apple； Simple Sequence Repeat； Variety identification； Genetic diversity； Genetic map construction
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作者简介季晓钒（1989- ），女，江苏镇江人，硕士研究生，研究方向：植物生理学。*通讯作者，教授，从事植物生理生化方面的研究。
收稿日期20140623蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus）植物在全球分布较为广泛，原生于北半球的温带地区，后在欧洲、亚洲及北美洲均有发现。全世界苹果属植物约有35个种，我国原产27个种，其中野生种21个，栽培种6个[1]。苹果属种质资源丰富、种类多、分布广[2]。
前人对苹果的品质性状[3-4]、抗病性[5-6]、砧木的选育[7]以及遗传方面[8]已经进行了大量的研究。研究方法除外观形态方面的调查整理外，主要采用DNA分子技术。DNA分子技术主要分为两类：一类是以Southern杂交为核心的分子标记技术——RFLP，但其存在操作繁琐、信息含量低的缺点[9]；另一类是基于PCR的DNA分子技术，主要有RAPD、AFLP、ISSR及SSR分子标记技术。其中RAPD分子技术虽然可以检测多个基因位点，但不能识别杂合子位点[10]，且试验重复性差[11]；而AFLP分子技术虽然相比于RFLP和RAPD 2种分子技术具有高的稳定性，但对基因组纯度和反应条件要求较高[12]；ISSR分子标记采用随机引物，而SSR分子标记利用特异性引物进行标记。SSR分子标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，与其他分子标记相比，SSR分子标记具有分布广泛、数量丰富、稳定性好、多态性高等优点[13]，可鉴别出纯杂合子的共显性等遗传特征[14]。因此SSR标记已被广泛应用于苹果的品种鉴定、亲缘关系和遗传多样性、遗传图谱和系谱构建以及基因标记等方面的研究。
1SSR分子标记概述
SSR标记由Moore等于1991年创立，是现今流行的分子标记技术之一。SSR（simple sequence repeat）即简单序列重复，通常又称为微卫星（microsatellite）[15]，主要是以1～4个核苷酸为基本单位的串联重复序列，其长度在150 bp左右。根据串联重复序列的来源，SSR分子标记主要分为由功能基因组成的（如rRNA和组蛋白基因）的基因组SSR（genomic SSR，gSSR）和利用转录组序列开发的转录组SSR 2种。EST（expressed sequence tags）即表达序列标签，是指从cDNA文库中随机挑选单克隆进行测序所获得的序列片段[16]。利用转录组序列开发的SSR标记具有操作更简易和成本低等优点[17]，因其与功能基因关系密切，所以在近缘种群内具有很高的通用性。近年来随着新一代测序技术的发展，可以快速大量的得到转录组数据使得ESTSSR分子标记迅速发展，对转录组SSR分子标记的利用目前已成为很多学者研究植物遗传方面的重要方法[18-20]。
SSR标记作为第二代分子标记，已广泛应用于园艺植物和林木上[19-22]。在园艺植物葡萄中，THOMAS等[23]发现微卫星序列为鉴别欧亚种葡萄品种（Vitis vinifera L.）提供了有价值信息，SSR位点还可转移到葡萄属不同种的研究，同时发现SSR标记为共显性遗传，适合用来构建遗传图谱和遗传关系的研究[24]。马丽丽等[21]以SSR分子标记对16份柑橘属及近缘材料进行DNA扩增分析，发现早花柠檬与枸橼的遗传相似系数最高，为此类植物的分类提供了更多的线索。在林木上，张毅等[25]利用ESTSSR标记对茶树的DNA上进行扩增分析从而鉴别出不同品种。在杨树新杂种的SSR分析和鉴定方面，刘春英等[26]选用3对引物构建5个杨树品种的指纹图谱，且每个品种在此图谱中都有自身独特的片段。研究表明，利用SSR分子标记技术对植物遗传多样性和亲缘关系进行分析，可选出更优质的品种进行育种进而带来更多的经济价值[27]。 2苹果中SSR分子标记的应用
2.1品种鉴定苹果作为世界上重要果树之一，其栽培历史悠久，由于种间杂交、无性繁殖以及各自栽培品种的混交所导致外观个体表型差异小，同名异物和同物异名现象普遍存在。解决这些问题需要进行品种鉴定，目前品种鉴定的方法主要是有：①大田鉴定法：即将叶、花、果实等组织器官的颜色、形态等作为观测指标进行品种区分[28]；②生化标记：主要包括蛋白质电泳和同工酶电泳等方法进行品种鉴别；③DNA分析，如SSR分子标记。大田鉴定法主要是通过人工观测，需要大量的经验，具有一定的局限性，而应用同工酶鉴定品种真实性和纯度时往往有组织或器官特异性。利用SSR分子标记在DNA分子水平上的品种鉴定，具有更高的准确性和效率，目前SSR分子标记成为苹果品种鉴定的主要方法之一。
早在1997年，GUILFORD等[29]首次开发了苹果的14个SSR引物，并用其中3个引物鉴别出21个苹果栽培品种，仅用引物（23g4）就区分出了21个品种中的40%。王爱德等[2]用GD142和ch02b01 2对引物区分了25个苹果品种。高源等[30]利用SSR技术对59份苹果属材料进行基因组多态性分析，得出遗传多样性指数为0.615 6，并仅用3对引物（CH02a04、CH02g04和CH01f03b）即区分开全部供试材料。此后，高华等[31]利用SSR分子标记对苹果栽培品种进行鉴定，用3对引物（Hi01c11、Hi03d06和GD162）将供试的40个苹果栽培品种进行鉴定分类。李荷蓉等[32]利用ESTSSR引物可以把22个苹果品种区分开，聚类分析后在遗传相似系数为0.84处，可以将全部苹果品种分为8个组。FORONI等[33]对在亚速尔群岛采得的200个苹果栽培品种进行微卫星分析，发现这些样品具有高度变异性，并最终鉴别出60个异名同物和32个同名异物。由此可见，对于苹果品种鉴定和区分同名异物等方面，SSR标记是一项可靠高效的分子技术。
砧木是嫁接繁殖时承受接穗的植株，也是果树嫁接苗的基础，很多学者就苹果砧木也进行了大量DNA层面的分析。2010年金万梅等[7]利用SSR分子标记对3个不同研究所所保存的28份SH系苹果砧木进行鉴定，发现许多同名异物、异名同物等，如昌平的SH18与昌平的SH38（98.4%）。2013年马荣群等[34]应用SSR标记鉴定无融合生殖苹果砧木杂种实生苗，并建立了SSR体系且可快速、准确、高效地鉴定早期无融合生殖苹果砧木F1代有性杂种，检出率达100%。巴巧瑞等[35]采用SSR和SPAP 2种分子标记技术，分析了苹果（Malus domestica Borkh.）重要栽培品种的亲缘关系，结果表明，苹果品种被分为六大类，大多数品种符合传统遗传图谱，但也有无血缘关系的聚为一类，该研究为苹果杂交育种亲本及组合的选配提供了参考。由此可见，SSR标记不仅可以进行苹果的品种鉴定，还为种质资源的保存和收集提供了依据。VAN TREUREN等[36]也认为对苹果的基因型进行微卫星标记分析是种质资源管理和品种鉴的一项有效工具。
2.2遗传多样性分析遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，蕴藏在各种生物的基因组中。对物种进行遗传多样性研究的前提是进行遗传多样性分析，确定其遗传距离，进而弄清其亲缘关系。系统化的遗传多样性分析研究对于物种种质资源收集、保存及选育方面具有重要意义。SSR标记具有数量丰富、信息量大、多态性高等优点，不论物种是否为同一基因型还是亲缘关系较近的品种，其试验操作简易、结果稳定可靠，对于苹果资源而言，多数利用此方法进行遗传多样性的研究。
高华等[31]利用12对SSR引物对40个苹果栽培品种进行遗传多样性分析，聚类分析后发现40个苹果品种的遗传多样性较高，其相似系数为0.705～0.982，在相似系数0.862处被分为五大类群，这与品种的系谱来源基本吻合。ZHANG等[37]以29个苹果样品为研究对象，包含12个来自于我国7个地方的苹果种、4个地方品种及13引进栽培品种。利用19个分别存在于17个苹果的不同基因组连锁群上的SSR标记进行遗传多样性分析，结果表明一些品种具有16个独特的等位基因，其中10个在野生品种中也被发现，证明了我国野生苹果种具有较高的遗传多样性。利用SSR标记不仅能对栽培变种进行遗传多样性分析鉴定，还对种系或品种间的亲缘关系进行了验证，从而将通过对亲本的选择将野生型优良基因转移到栽培种中，为杂交选育提供了选择依据。
秦伟等[38]以SSR标记对21份新疆地区的苹果种质资源进行了亲缘关系分析，聚类分析结果显示，若以遗传相似系数0.63为阈值，可将这21份地方资源聚类成3组，且地方品种和野生品种交叉分布说明了地方品种可能是由野生品种直接驯化而来，或是长期杂交或遗传变异造成的。高源等[39]利用在SSR扩增产物检测过程中的一种分析技术体系TPM 13SSR，对25份苹果种质资源的地方品种进行了遗传多样性研究，得到其遗传多样性、多态性信息含量和位点杂合度等多个信息，并利用UPGMA法聚类分析将25个苹果品种分为二大类，揭示其与地理起源和亲缘关系相关。随后JIN等[40]利用SSR分子标记对41个苹果砧木进行了遗传多样性分析，将41个苹果砧木分为5个组，结果表明育种可以在这五大组的种质资源中选择具有根茎表型的品种。通过遗传关系的分析，进而评价不同品种间的异质性且进行优势种群的选择。
安徽农业科学2014年PATZAK等[41]通过对捷克苹果品种进行遗传多样性和遗传关系评估分析，将捷克苹果品种分为3个主要群组，微卫星是进行遗传资源评价的高效便捷的方法。FU等[42]使用10个简单的SSR标记对15个同型小种的苹果属进行了基因组多态性和遗传关系分析，得出遗传相似系数为0.53～0.88。表明这一物种具有较高的遗传多态性。2013年董研等[8]利用12个连锁群的17对SSR引物对新疆巩留、新源、霍城、托里4个居群下的12个新疆野苹果天然群体进行群体等位基因和基因型差异分析，得出XY1、HC2群体的基因多样性较高，巩留居群与新源居群的遗传关系最近。宋尚伟等[43]开发了苹果ESTSSR引物并筛选出16对ESTSSR引物对苹果品种资源的亲缘关系进行研究并聚类成树状图，在相似性系数0.65处可将118个供试材料分为五大组。FARROKHI等[44]通过对伊朗苹果栽培品种和地方品种进行遗传多样性的评估，在16个SSR位点生成45个等位基因，多态性信息含量（PIC）0.18～0.76，其平均值为0.49。根据Jaccard'相似系数和UPGMA聚类法将苹果基因型分为2组。又一次证实SSR标记是一个在苹果育种程序中能进行精确遗传多样性研究的可靠DNA标记。在苹果遗传多样性研究方面，SSR标记可以准确地对苹果不同品系进行遗传多样性评估，通过聚类分析能够反映出品种的品种特性、地域特性和亲缘关系。 2.3遗传连锁图谱的构建及QTL定位建立遗传连锁图谱是基因组研究中的一个重要环节。随着分子标记特别是SSR分子标记的迅速发展，使得构建各类物种的遗传连锁图相对较易。SSR分子标记不仅简化了遗传多样性分析的过程，还利于不同作图群体间的标记转换。其作为高效的构建遗传连锁图的工具，已经广泛应用于苹果的遗传多样性分析和图谱构建方面[45]。在构建遗传连锁图后，进行标记找到基因组中的功能基因和数量性状位点（quantitative trait loci，QTL）并进行连锁分析来确定该功能基因及QTL的位置。这为基因定位和克隆、品种间标记间转换等奠定了基础。基因标记是基因定位克隆以及分子辅助选育的前提，其目的是筛选与目的基因紧密连锁的遗传标记。
1998年，MAILEPEARD等[46]用苹果品种“Prima”דFiesta”的152株F1群体为材料，利用RFLP、RAPD、AFLP和SSR等多种标记手段构建了双亲的遗传连锁图。选择合适的引物是构建苹果分子指纹图谱的重要前提[47]。LIEBHARD等[48]利用129个SSR以及其他分子标记构建了苹果的遗传图谱，这些SSR标记分别分布在17条连锁群上，这为苹果的品种鉴定、种质资源保存以及基因定位奠定了基础。此后SILFVERBERG等[49]开发了148个微卫星标记并在“Fiesta”דDiscovery”品种的连锁图上定位。其中117个来自于基因组库，31个是从EST序列中开发得到。MORIYA等[50]利用新开发的ESTSSR标记构建了苹果砧木品种“JM7”和苹果属三叶海棠“Sanashi 63”的对齐式基因连锁图。其中89个同源重叠群上的ESTSSR标记经过图谱分析识别被定位到相同的连锁群上，其余48个ESTSSR标记对应到重叠群上定位于不同的连锁群上。2012年，王立新等[51]利用匀位于苹果17对染色体上的35对多态性高、重复性好的引物对40个苹果栽培品种进行图谱构建。刘遵春等[52]在研究新疆野苹果分离群体方面发现“红富士”和新疆红肉苹果的遗传差异较大，并证实选取该群体作为构建新疆野苹果遗传连锁图镨的作图群体是合适的。目前利用分子标记在构建苹果遗传图谱方面也已经取得了一定的成功。未来利用遗传图谱可以更有效地对苹果抗病性及性状进行遗传分析与基因定位。
ALSTON等[53]认为采用与目标性状紧密连锁的分子标记有针对性地对特定基因进行辅助选择，可以不受生态条件及植物生长年限的制约，简便迅速地进行杂种后代的早期选择。2006年，姚玉新等[54]采用分离群体分组分析（BSA）法，用SSR引物筛选出遗传距离为8.89 cm的苹果酸度基因，并标记SDY085。2013年王雷存等[55]利用SSR技术并结合集群分类分析法获得了与果实酸性状紧密连锁的距离为3.24和2.31 cm的分子标记CH03d12104和CH03d12118 2个位点，分析表明Ma1与Ma2对果实含酸量有控制作用，Ma对ma表现为完全显性。李爽等[56]将抗早期落叶病基因定位到了遗传连锁图谱中的第10个连锁群上后，能够将抗病基因等有特定功能的基因定位到遗传连锁图中，这为抗病育种提供了理论依据。
近年来，在国外对基因标记和定位方面也作了相应的研究，2012年，FERNNDEZFERNNDEZ等[57]将苹果属的142个全基因组序列支架中的282.4 Mbp的序列均定位到“M.27”דM.116”杂交的图谱中。这可被用来识别对那些农艺性状负责的基因，如控制矮化和水分利用效率的基因。2007年，KENIS等[58]发现数量性状位点（QTL）的一个主要集群位于“Telamon”上的Co基因区域，并确认了Co基因对树木形态具有重要影响。2013年，BALDO等[59]发现了Co基因（柱形基因）与SSR标记Co04R12共分离，且被确定在SSR标记Co04R11和Co04R13之间0.56 cm距离的区域，对应到“Golden delicious”（金冠）苹果基因组序列的393 kb范围上，这为Co基因的克隆奠定了基础。通过基因定位找出苹果资源的抗病性、农艺性状、品质性状和基因之间的关系，为未来所需要的品质性状进行进一步的转基因工程。
随着新一代的测序技术的发展，使得高质量的苹果基因组序列图的绘制成为可能，VELASCO等[60]以栽培品种金冠（Golden Delicious）苹果为材料，借助于新一代测序平台构建了苹果基因组的物理图谱，共产生122146 contigs，1629 scaffolds，总contigs长度达603.9 Mb，约占估计苹果基因组的81.3%。该研究表明苹果亚科植物发生过一次相对较新的全基因组复制，由祖先的9个染色体转变为17个染色体，进行植物分类学后发现栽培苹果的祖先为新疆野苹果（M.sieversii）。同时研究还发现与果实发育相关的基因家族存在大量的基因复制现象。此项研究也为今后SSR分子标记在苹果中研究的进一步拓展和延伸提供了基础。
3展望
随着近年来SSR分子标记技术的成熟，现今已被广泛应用于苹果品种鉴定、苹果种内亲缘关系和遗传多样性分析、遗传连锁图的构建以及基因定位克隆等方面。但目前利用SSR分子标记对苹果的抗性基因标记定位的研究尚有不足，对控制苹果重要农艺性状的数量性状基因研究也较少，苹果的全基因组序列图也有待进一步精细绘制。因此，笔者认为后续研究需在以下方面进一步深入和拓展：①目前公布的苹果基因组序列图仅为草图，虽然为研究苹果起源和寻找某些与重要性状相关的基因提供了依据，但还需对苹果基因组图进行进一步的精细绘制，进行更多的数量性状的连锁分析其定位，从而寻找出与重要农艺性状连锁紧密的分子标记，通过优良基因型的选择从而提高苹果选育质量，缩短选育时间；②通过中间杂交、突变体筛选，利用基因定位和克隆寻找出我国苹果资源的抗性和品质基因之间关系以及对杂交优势的预测；③通过对苹果的遗传连锁图谱的补充和完善，为具有经济价值和研究价值的苹果品质性状进行基因定位和转基因工程的发展奠定基础；④对苹果野生型品种和优良的栽培品种建立指纹图谱以丰富苹果的指纹图谱库，从而更好地为苹果的品种鉴定、育种和生产提供参考；⑤加强SSR标记在无融合生殖苹果砧木杂交后代中检测非母本类型（有性杂种）方面的应用研究，提高无融合生殖砧木杂交育种效率。随着分子技术的不断发展和完善，以及SSR分子标记技术在苹果中的不断运用，苹果资源的研究体系和范围将迎来更好的未来。 参考文献
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