【摘 要】
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[摘要] 目的 探讨cAMP-PKA信号通路在来曲唑影响子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2表达中的作用。 方法 cAMP-PKA信号通路抑制剂H-89（10 μmol/L）处理原代培养的人子宫肌瘤细胞30 min后，来曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）处理24、48和72 h。采用实时定量PCR和Western blot分别检测MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的
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[摘要] 目的 探讨cAMP-PKA信号通路在来曲唑影响子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2表达中的作用。 方法 cAMP-PKA信号通路抑制剂H-89（10 μmol/L）处理原代培养的人子宫肌瘤细胞30 min后，来曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）处理24、48和72 h。采用实时定量PCR和Western blot分别检测MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表达。 结果 来曲唑以浓度和时间依赖的方式下调了人子宫肌瘤细胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表达，上调了TIMP-2 mRNA和蛋白的表达（P均全文查看链接
1.2.4 Western blot 处理时间结束后，收集各实验组细胞，加入500 μL蛋白裂解液裂解细胞30 min，提取各组细胞的总蛋白。BAC法按试剂盒说明进行操作，测定裂解液蛋白质的浓度。取50 μg蛋白样本加入2×SDS加样缓冲液中，煮沸，充分变性蛋白质。6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h而分离蛋白，电泳电压为80 mV。将分离的蛋白转膜至聚偏氟乙稀膜上，然后采用丽春红染色法观察蛋白转移效果，并确定蛋白分子量标准的位置。用5%脱脂牛奶在室温下孵育膜2 h，将非特异性抗原封闭。分别加入兔抗人MMP-2（1：150）、TIMP-2（1：150）和β-actin（1：200）的抗体，4℃下过夜。用TBST洗膜3次，每次洗5 min。加入羊抗兔二抗，二抗用辣根过氧化物酶标记，4℃下孵育膜4 h，然后用TBST冲洗3次。按照试剂盒说明书的指导，采用蛋白质印迹检测试剂盒将蛋白质条带显示于X光片上，采用凝胶图像分析系统扫描胶片并对结果进行半定量分析。
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在我们的研究中，结果显示来曲唑以浓度和时间依赖的方式下调了人子宫肌瘤细胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表达，却上调了人子宫肌瘤细胞中TIMP-2 mRNA和蛋白的表达。这些结果表明来曲唑减小肌瘤体积，改善子宫肌瘤患者的临床症状可能与来曲唑下调子宫肌瘤细胞中MMP-2的表达和上调子宫肌瘤细胞中TIMP-2的表达有关。MMP-2和TIMP-2表达的调控涉及到多条信号通路，如cAMP-PKA途径、Ras途径和MAPK途径等[13]，我们的结果显示cAMP-PKA信号通路抑制剂H-89部分取消了来曲唑诱导的人子宫肌瘤细胞中MMP-2表达的下调和TIMP-2表达。这些结果表明来曲唑影响MMP-2和TIMP-2的表达可能涉及到cAMP-PKA信号通路。
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