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摘要：本文就尿中砷的原子荧光光谱测定法方法学性能验证进行了如下论述。
关键词：尿中砷 原子荧光光谱测定法 方法学性能验证
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0035-03
根据《医疗机构临床试验室管理方法》（2006年6月1日起施行）和《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO 15189：2007）的相关规定，任何新的检验设备和检测方法在正式使用于临床检验工作之前，都需要对该仪器、方法进行系统评估证实其可给出满意结果，验证的性能指标包括正确度、精密度、线性范围，特异性，稳定性，抗干扰性，参考范围等。根据实际工作开展的可行性，本部分拟对尿中砷的原子荧光光谱测定法的正确度、精密度进行方法学性能验证，对线性范围、携带污染率进行评价。
有关砷中毒国内外都有相关报道。印度东部部分地区及孟加拉国是受砷危害最严重的地区，超过5亿人口处于慢性砷中毒的威胁之中[1]。英国[2]有13598份癌症登记归属于职业病范畴，例如：间皮瘤，鼻咽癌，肺癌，非黑瘤皮肤癌，膀胱癌，食管癌，软组织肉瘤，胃癌等这些疾病，而这些疾病都与砷中毒有关。人类在生产生活过程中通过消化道、呼吸、皮肤接触等途径长期暴露于过量砷时会引起砷中毒。服用含砷药物和饮用含砷水与皮肤色素沉着、角化和皮肤癌等相关。砷危害健康的问题受到全世界的关注，国际癌症研究机构（IARC）确认砷是致癌物质。
目前，中国地方性砷中毒病区分为饮水型和燃煤污染型两种类型，其中饮水型砷中毒病区可分为浅层地下水高砷区、深层地下水高砷区和泉水高砷区。从地理分布来看，浅层地下水高砷区主要分布在黄河流域（内蒙古、山西、宁夏、青海）、淮河流域（安徽、江苏）和长江流域（湖北）一些省（区）的部分地区，还有吉林西部平原地区；深层地下水高砷区主要分布在新疆、青海；泉水高砷区主要分布在甘肃、云南和四川的山区，因此在全国饮水型地方性砷中毒的监测中，云南省被列为监测省份之一。慢性砷中毒事件在许多国家都有报道，主要分为职业性中毒和非职业性中毒。非职业性砷中毒主要是通过摄入被砷污染的水和食物引起。职业性砷中毒患者主要是从事有色金属及高砷煤矿开采等行业的作业工人，其中毒多是通过呼吸道和皮肤等途径染砷引起。于光前[3]等对山西、内蒙古、吉林、江苏、安徽、湖北、云南、甘肃、青海、宁夏等11个省进行了调查，陆续发现有地方性砷中毒的流行。
砷中毒患者人群主要表现为不同程度的皮肤色素脱失、色素沉着以及掌趾部角化等症状。砷中毒的致病机制仍未明确，研究表明砷可通过多种途径导致细胞或基因的损伤，如砷可干扰DNA甲基化、抑制DNA修复、导致DNA损伤、致染色体畸变、诱导细胞增生、改变信号转导模式、氧化应激等。铅中毒的机制目前亦尚未完全阐明。铅对全身各系统和器官均有毒性作用，主要表现为严重的中枢神经系统病变如癫痫样发作，运动过度，攻击性行为，语言功能发育迟滞以至丧失等，重症病例可有失明和偏瘫；近年来有学者发现铅中毒还可导致视网膜病变；对造血系统的影响多导致贫血，溶血；腹绞痛常是消化系统最突出的症状之一；对泌尿系统的毒性作用主要是损伤肾近曲小管。
急性砷摄入后血砷立即升高，但其生物半衰期仅1-2天，故血砷检测的临床应用受到很大限制。尿砷在摄入砷后4-12小时即见升高，停止摄入2周还可测出峰值的35%，故为较好的砷近期摄入指标，临床最为常用。尿砷检测结果若超过正常值上限，即可考虑有过量砷摄入可能；急性砷中毒时，尿砷含量常超过正常值上限的数倍。程晓天等[4]学者的研究中选择山西省砷中毒病区村和非砷中毒病区村，采集水样和儿童尿样，分析砷含量，结果两个砷中毒病区村水砷和儿童尿砷含量均远大于非病区村，具有极显著性差异（P<0.01）。说明尿砷检测对地方性砷中毒的研究工作具有实际意义。
1 材料及方法
1.1 材料。
1.1.1 仪器及容器。
（1）原子荧光光度计（科创海光AFS-3100）购自北京科创海光仪器有限公司。
（2）微波消解仪（Multiwave 3000）购自奥地利安东帕公司。
（3）带盖聚乙烯塑料试管，10mL。
1.1.2 试剂。
（1）砷标准液（GBW08611）购自中国计量科学研究院。
（2）浓盐酸（36%～38%）优级纯。
（3）5%盐酸溶液：475mL去离子水中加入25mL浓HCl。
（4）2%硼氢化钾溶液：将2.5gNaOH溶解在300mL去离子水中，再加10gKBH4进行充分溶解，用容量瓶定容至500mL。
（5）5%硫脲+5%抗坏血酸溶液：5g硫脲和5g抗坏血酸溶于80mL去离子水中，用容量瓶定容至100mL。
（6）标准系列的配制：（见表1）。
1.2 检测方法。本研究采用的是原子荧光光谱法检测尿砷。其具体检测原理为：尿样中加入硝酸破坏其中的有机物，再加入硫脲-抗坏血酸溶液将5价砷还原成3价砷，在硼氢化钾作用下生成砷的氢化物，在氩氢焰中分解为单质态砷，吸收由高性能空心阴极灯发射的193.7nm的光后，发射出原子荧光，测定荧光强度，以峰面积进行定量。
在计算砷浓度的过程中引入了浓度校正系数k，按式（1）计算尿样换算成标准比重（1.020）下的浓度校正系数k。按式（2）计算尿中砷的浓度。
k=1.020-1.000实测比重-1.000……（1）
X=c*k*d……（2）
式中：X——尿中砷的浓度，μg/l；
c——由标准曲线查得的稀释尿样中砷的浓度，μg/l；
d——尿样稀释倍数。 1.2.1 样品处理：
（1）尿样的采集：尿样收集在带盖样品杯中（注意防止采样过程的污染），取少量尿液测定比重后，弃去。剩余的尿液按100mL尿加1mL的硝酸，低温（4℃）保存，一周内分析完毕。
（2）尿样的处理：将尿样从冰箱中取出，室温平衡10分钟，上下颠倒混匀。取2.0mL尿样于样品消解罐中，加入3mL硝酸，微波消化5min，冷却卸压后取出样品罐将消化液分次转移到10mL比色管中，同时加入0.5mL盐酸和2.5mL抗坏血酸-硫脲混合液，并定容至10mL，室温反应30min。
（3）样品空白的处理：取2.0mL去离子水按样品同样处理，作为样品空白。
1.2.2 上机测定。将处理好的样本依次上机测定。
2 方法学性能验证方法及结果
2.1 精密度验证。对四个浓度的标本做批内、批间精密度验证，测试数据见表2。通过计算分别得到批内CV分别为1.5%和1.4%，批间CV分别为1.5%和0.9%，均在尿砷检测指南中给出的原子荧光光谱法测尿砷的CV范围0.87-1.75%内。结果显示见表3。
2.6 数据处理。所有数据以均数X、标准差S以及变异系数CV表示，线性回归分析。使用Spss11.7软件和Excel电子表格处理。
3 讨论
有关砷急性中毒目前尚无国家诊断标准，主要根据砷化合物口服或较大量急性接触史以及出现的典型临床症状做出诊断。而关于砷慢性中毒，我国已颁布《职业性慢性砷中毒诊断标准》（GBZ83-2002），根据较长时间密切接触砷化合物的职业史，结合皮炎、皮肤过度角化、皮肤色素沉着及消化系统、神经系统为主的临床表现，参考发砷、尿砷等实验室检查结果，综合分析后做出诊断。在《职业性慢性铅中毒诊断标准》（GBZ37-2002）和《职业性慢性砷中毒诊断标准》（GBZ83-2002）中都有规定尿铅，尿砷检测是诊断和治疗中重要的检测项目。
尿砷含量相关检测有多种方法，其中比较常见的有：氢化物发生-原子荧光分析（HG—AFS）法[4]，原子分光光谱法，电感耦合等离子体质谱（ICP—MS）法[5]，氢化物发生-电感耦合等离子体发射光谱（HG—ICP—OES）法[6]。程晓天等[4]的研究发现，氢化物发生-原子荧光分析法（HG-AFS）较我国的砷检测标准方法二乙基二硫代氨基甲酸银（DDC-Ag）法（WS/T28-1996）和氢化物发生原子吸收法的灵敏度和准确度高，且具有取样量少，节约试剂，节约时间，减少污染的优点，是比较常用的砷检测方法。
本部分对原子荧光光谱法测尿砷的方法学性能验证中的精密度，回收率两项指标均在尿砷检测指南中给出的范围内，同时还对该方法的检测范围及最低检出限进行了评价。符合《医疗机构临床试验室管理方法》和《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO 15189：2007）的相关规定。因此可以应用于临床检测工作中。
在原子荧光光谱法测尿砷中，比较繁琐的步骤是对尿液标本的处理，这一步骤比较费时，占用了大量的时间，降低了检测效率，以至于延迟了尿砷检测报告发放的时间。我们寄希望于今后检验技术的更新，在尿标本的处理方面有大的突破，这样可以减少处理时间，提高工作效率，最终以缩短检验报告发放的时间，从而更快速地将检测结果送到临床。
随着检验技术的不断更新，这就要求新方法的方法学性能验证工作的进行。在旧的尿砷检测国标法似乎已经不能满足现有的临床检验工作的背景下，希望在今后的研究工作中，有关部门进行研究并制定新的国标检测方法，这样可以更精准地指导各级检验部门进行尿砷的检测工作。
检验工作是为临床工作服务的，有了精准，快速的检验数据，临床医生得以及早地对潜在砷中毒的患者进行宣教，隔离，降低砷中毒的患病率。同时精准的检测数据还能指导临床医生对已患砷中毒的患者及时做出诊断和治疗，以减轻砷中毒给患者带来的危害。
参考文献
[1] Jones H， Visoottiviseth P， Bux MK. Case reports： arsenic pollution in Thailand， Bangladesh， and Hungary. Rev Environ Contam Toxicol. 2008，197（5）：163-87
[2] Rushton L， Hutchings SJ， Fortunato L. Occupational cancer burden in Great Britain. Br J Cancer. 2012 Jun 19，107 （1）：S3-7
[3] 于光前，陈志，赵丽军等.中国地方性砷中毒流行趋势分析.中国地方病学杂志.2010，29（1）：3-8
[4] 程晓天，温新平，王正辉等.HG—AFS法分析尿砷方法及应用研究.中国地方病学杂志，2007，26（2）：130-132
[5] 董明，张爱华，潘巧裕等.电感耦合等离子质谱法测定尿样中的铅、镉、砷、汞、铊第十六届全国卫生检验新技术学术研讨会暨展览会会刊.2008年10月26日：25-29
[6] 赵磊，肖婷婷，张爱华.HG—ICP—OES检测尿中总砷含量的方法探讨黔南民族医专学报.2009，1（6）：9-13
关键词：尿中砷 原子荧光光谱测定法 方法学性能验证
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0035-03
根据《医疗机构临床试验室管理方法》（2006年6月1日起施行）和《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO 15189：2007）的相关规定，任何新的检验设备和检测方法在正式使用于临床检验工作之前，都需要对该仪器、方法进行系统评估证实其可给出满意结果，验证的性能指标包括正确度、精密度、线性范围，特异性，稳定性，抗干扰性，参考范围等。根据实际工作开展的可行性，本部分拟对尿中砷的原子荧光光谱测定法的正确度、精密度进行方法学性能验证，对线性范围、携带污染率进行评价。
有关砷中毒国内外都有相关报道。印度东部部分地区及孟加拉国是受砷危害最严重的地区，超过5亿人口处于慢性砷中毒的威胁之中[1]。英国[2]有13598份癌症登记归属于职业病范畴，例如：间皮瘤，鼻咽癌，肺癌，非黑瘤皮肤癌，膀胱癌，食管癌，软组织肉瘤，胃癌等这些疾病，而这些疾病都与砷中毒有关。人类在生产生活过程中通过消化道、呼吸、皮肤接触等途径长期暴露于过量砷时会引起砷中毒。服用含砷药物和饮用含砷水与皮肤色素沉着、角化和皮肤癌等相关。砷危害健康的问题受到全世界的关注，国际癌症研究机构（IARC）确认砷是致癌物质。
目前，中国地方性砷中毒病区分为饮水型和燃煤污染型两种类型，其中饮水型砷中毒病区可分为浅层地下水高砷区、深层地下水高砷区和泉水高砷区。从地理分布来看，浅层地下水高砷区主要分布在黄河流域（内蒙古、山西、宁夏、青海）、淮河流域（安徽、江苏）和长江流域（湖北）一些省（区）的部分地区，还有吉林西部平原地区；深层地下水高砷区主要分布在新疆、青海；泉水高砷区主要分布在甘肃、云南和四川的山区，因此在全国饮水型地方性砷中毒的监测中，云南省被列为监测省份之一。慢性砷中毒事件在许多国家都有报道，主要分为职业性中毒和非职业性中毒。非职业性砷中毒主要是通过摄入被砷污染的水和食物引起。职业性砷中毒患者主要是从事有色金属及高砷煤矿开采等行业的作业工人，其中毒多是通过呼吸道和皮肤等途径染砷引起。于光前[3]等对山西、内蒙古、吉林、江苏、安徽、湖北、云南、甘肃、青海、宁夏等11个省进行了调查，陆续发现有地方性砷中毒的流行。
砷中毒患者人群主要表现为不同程度的皮肤色素脱失、色素沉着以及掌趾部角化等症状。砷中毒的致病机制仍未明确，研究表明砷可通过多种途径导致细胞或基因的损伤，如砷可干扰DNA甲基化、抑制DNA修复、导致DNA损伤、致染色体畸变、诱导细胞增生、改变信号转导模式、氧化应激等。铅中毒的机制目前亦尚未完全阐明。铅对全身各系统和器官均有毒性作用，主要表现为严重的中枢神经系统病变如癫痫样发作，运动过度，攻击性行为，语言功能发育迟滞以至丧失等，重症病例可有失明和偏瘫；近年来有学者发现铅中毒还可导致视网膜病变；对造血系统的影响多导致贫血，溶血；腹绞痛常是消化系统最突出的症状之一；对泌尿系统的毒性作用主要是损伤肾近曲小管。
急性砷摄入后血砷立即升高，但其生物半衰期仅1-2天，故血砷检测的临床应用受到很大限制。尿砷在摄入砷后4-12小时即见升高，停止摄入2周还可测出峰值的35%，故为较好的砷近期摄入指标，临床最为常用。尿砷检测结果若超过正常值上限，即可考虑有过量砷摄入可能；急性砷中毒时，尿砷含量常超过正常值上限的数倍。程晓天等[4]学者的研究中选择山西省砷中毒病区村和非砷中毒病区村，采集水样和儿童尿样，分析砷含量，结果两个砷中毒病区村水砷和儿童尿砷含量均远大于非病区村，具有极显著性差异（P<0.01）。说明尿砷检测对地方性砷中毒的研究工作具有实际意义。
1 材料及方法
1.1 材料。
1.1.1 仪器及容器。
（1）原子荧光光度计（科创海光AFS-3100）购自北京科创海光仪器有限公司。
（2）微波消解仪（Multiwave 3000）购自奥地利安东帕公司。
（3）带盖聚乙烯塑料试管，10mL。
1.1.2 试剂。
（1）砷标准液（GBW08611）购自中国计量科学研究院。
（2）浓盐酸（36%～38%）优级纯。
（3）5%盐酸溶液：475mL去离子水中加入25mL浓HCl。
（4）2%硼氢化钾溶液：将2.5gNaOH溶解在300mL去离子水中，再加10gKBH4进行充分溶解，用容量瓶定容至500mL。
（5）5%硫脲+5%抗坏血酸溶液：5g硫脲和5g抗坏血酸溶于80mL去离子水中，用容量瓶定容至100mL。
（6）标准系列的配制：（见表1）。
1.2 检测方法。本研究采用的是原子荧光光谱法检测尿砷。其具体检测原理为：尿样中加入硝酸破坏其中的有机物，再加入硫脲-抗坏血酸溶液将5价砷还原成3价砷，在硼氢化钾作用下生成砷的氢化物，在氩氢焰中分解为单质态砷，吸收由高性能空心阴极灯发射的193.7nm的光后，发射出原子荧光，测定荧光强度，以峰面积进行定量。
在计算砷浓度的过程中引入了浓度校正系数k，按式（1）计算尿样换算成标准比重（1.020）下的浓度校正系数k。按式（2）计算尿中砷的浓度。
k=1.020-1.000实测比重-1.000……（1）
X=c*k*d……（2）
式中：X——尿中砷的浓度，μg/l；
c——由标准曲线查得的稀释尿样中砷的浓度，μg/l；
d——尿样稀释倍数。 1.2.1 样品处理：
（1）尿样的采集：尿样收集在带盖样品杯中（注意防止采样过程的污染），取少量尿液测定比重后，弃去。剩余的尿液按100mL尿加1mL的硝酸，低温（4℃）保存，一周内分析完毕。
（2）尿样的处理：将尿样从冰箱中取出，室温平衡10分钟，上下颠倒混匀。取2.0mL尿样于样品消解罐中，加入3mL硝酸，微波消化5min，冷却卸压后取出样品罐将消化液分次转移到10mL比色管中，同时加入0.5mL盐酸和2.5mL抗坏血酸-硫脲混合液，并定容至10mL，室温反应30min。
（3）样品空白的处理：取2.0mL去离子水按样品同样处理，作为样品空白。
1.2.2 上机测定。将处理好的样本依次上机测定。
2 方法学性能验证方法及结果
2.1 精密度验证。对四个浓度的标本做批内、批间精密度验证，测试数据见表2。通过计算分别得到批内CV分别为1.5%和1.4%，批间CV分别为1.5%和0.9%，均在尿砷检测指南中给出的原子荧光光谱法测尿砷的CV范围0.87-1.75%内。结果显示见表3。
2.6 数据处理。所有数据以均数X、标准差S以及变异系数CV表示，线性回归分析。使用Spss11.7软件和Excel电子表格处理。
3 讨论
有关砷急性中毒目前尚无国家诊断标准，主要根据砷化合物口服或较大量急性接触史以及出现的典型临床症状做出诊断。而关于砷慢性中毒，我国已颁布《职业性慢性砷中毒诊断标准》（GBZ83-2002），根据较长时间密切接触砷化合物的职业史，结合皮炎、皮肤过度角化、皮肤色素沉着及消化系统、神经系统为主的临床表现，参考发砷、尿砷等实验室检查结果，综合分析后做出诊断。在《职业性慢性铅中毒诊断标准》（GBZ37-2002）和《职业性慢性砷中毒诊断标准》（GBZ83-2002）中都有规定尿铅，尿砷检测是诊断和治疗中重要的检测项目。
尿砷含量相关检测有多种方法，其中比较常见的有：氢化物发生-原子荧光分析（HG—AFS）法[4]，原子分光光谱法，电感耦合等离子体质谱（ICP—MS）法[5]，氢化物发生-电感耦合等离子体发射光谱（HG—ICP—OES）法[6]。程晓天等[4]的研究发现，氢化物发生-原子荧光分析法（HG-AFS）较我国的砷检测标准方法二乙基二硫代氨基甲酸银（DDC-Ag）法（WS/T28-1996）和氢化物发生原子吸收法的灵敏度和准确度高，且具有取样量少，节约试剂，节约时间，减少污染的优点，是比较常用的砷检测方法。
本部分对原子荧光光谱法测尿砷的方法学性能验证中的精密度，回收率两项指标均在尿砷检测指南中给出的范围内，同时还对该方法的检测范围及最低检出限进行了评价。符合《医疗机构临床试验室管理方法》和《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO 15189：2007）的相关规定。因此可以应用于临床检测工作中。
在原子荧光光谱法测尿砷中，比较繁琐的步骤是对尿液标本的处理，这一步骤比较费时，占用了大量的时间，降低了检测效率，以至于延迟了尿砷检测报告发放的时间。我们寄希望于今后检验技术的更新，在尿标本的处理方面有大的突破，这样可以减少处理时间，提高工作效率，最终以缩短检验报告发放的时间，从而更快速地将检测结果送到临床。
随着检验技术的不断更新，这就要求新方法的方法学性能验证工作的进行。在旧的尿砷检测国标法似乎已经不能满足现有的临床检验工作的背景下，希望在今后的研究工作中，有关部门进行研究并制定新的国标检测方法，这样可以更精准地指导各级检验部门进行尿砷的检测工作。
检验工作是为临床工作服务的，有了精准，快速的检验数据，临床医生得以及早地对潜在砷中毒的患者进行宣教，隔离，降低砷中毒的患病率。同时精准的检测数据还能指导临床医生对已患砷中毒的患者及时做出诊断和治疗，以减轻砷中毒给患者带来的危害。
参考文献
[1] Jones H， Visoottiviseth P， Bux MK. Case reports： arsenic pollution in Thailand， Bangladesh， and Hungary. Rev Environ Contam Toxicol. 2008，197（5）：163-87
[2] Rushton L， Hutchings SJ， Fortunato L. Occupational cancer burden in Great Britain. Br J Cancer. 2012 Jun 19，107 （1）：S3-7
[3] 于光前，陈志，赵丽军等.中国地方性砷中毒流行趋势分析.中国地方病学杂志.2010，29（1）：3-8
[4] 程晓天，温新平，王正辉等.HG—AFS法分析尿砷方法及应用研究.中国地方病学杂志，2007，26（2）：130-132
[5] 董明，张爱华，潘巧裕等.电感耦合等离子质谱法测定尿样中的铅、镉、砷、汞、铊第十六届全国卫生检验新技术学术研讨会暨展览会会刊.2008年10月26日：25-29
[6] 赵磊，肖婷婷，张爱华.HG—ICP—OES检测尿中总砷含量的方法探讨黔南民族医专学报.2009，1（6）：9-13