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摘要[目的]研究4种柱花草种子在萌发过程中4种贮藏蛋白质含量的变化。[方法]用Bradford 蛋白质定量检测试剂盒对提取的蛋白进行测定。[结果]4种柱花草胚中贮藏蛋白质含量的大小顺序为球蛋白>白蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。球蛋白在胚生长时期大量降解，含量总体下降了43%；白蛋白在种子开始萌发时下降很快，下降幅度为39%；萌发后期种子胚芽长到4.3 cm时白蛋白含量降低了58%；在整个萌发过程中醇溶蛋白含量的变化与谷蛋白含量的变化相似，都呈波浪状变化，醇溶蛋白降解幅度最小。而总蛋白质含量在整个萌发阶段是随着萌发的进行而逐渐减少，其中有钩柱花草总蛋白含量的降解幅度最大，为49%；其余差异不明显。[结论]4种柱花草的种子萌发早期蛋白质的降解幅度大于萌发后期蛋白质的降解幅度。在种子萌发初期，柱花草种子中的贮藏蛋白质有不同程度的降解，为胚的生长发育提供需要的营养物质。在种子萌发后期，胚突破种皮形成幼芽，种子由异养逐渐向自养过渡，降解幅度减小。
关键词柱花草；贮藏蛋白质；种子萌发
中图分类号S541+.9文献标识码
A文章编号0517-6611（2014）36-12810-04
Abstract [Objective] The four kinds of storage protein contents changed in four Stylo seed germination. [Method] To determine the extraction of protein by Bradford protein assay kit. [Result] The results showed that the storage protein content of Stylo seed embryo in the size of globulin>albumin>glutenin>prolamin. Globulin had a large number of degradation in the embryo period ， the contents dropped 43% totally. Albumin decreased rapidly in the begin of germination， by 39%. In the late stage of germination， while the seed germ grow to 4.3 cm， albumin content reduced 58%. The change of protein content in the whole germination had wavy， prolamin resembled with glutenin， its degradation was the smallest. The total protein content in the whole germination stage reduced gradually， the total protein of hook Stylos degraded maximum， by 49%. The rest of the difference was not obvious. [Conclusion] Protein degradation in earlier stage was greater than the later stage in seed germination. At the beginning of Stylos seed germination， storage proteins had difference degradation， which provide nutrients to embryo growth and development， at the later period bud through the seed coat， the degradation decreased， the seeds transited from heterotrophic to autotrophic gradually.
Key words Stylo； Storage protein； Seed germination
柱花草属（Stylosanthes SW.）为多年生豆科植物，广泛分布于世界热带、亚热带地区。柱花草性喜湿热，耐酸瘦土，抗炭疽病，适生于我国热带、南亚热带地区，目前在海南、广东、广西等省区的推广面积约53万hm2。柱花草产量高，枝叶营养丰富，干物质粗蛋白含量15%～16%，同时含有多种氨基酸，是畜禽的优良饲料。柱花草根系发达，并且具有生物固氮能力，可固氮225～300 kg/hm2，是幼龄果园和热带经济林的理想绿肥作物，对防止雨水冲刷、保持水土、改良和培肥土壤、促进果树、林木生长发育具有显著作用。人们可充分利用荒山荒坡、果园、热带经济作物园和林间空地种植柱花草，以发展食草型、节粮型畜禽，为饲料工业主产提供优质草粉。目前关于柱花草的研究主要集中于植株形态、高产栽培技术、种子生产技术、品质、抗性、品种选育、饲料开发以及遗传多样性研究等方面，对种子发芽机理、机制的研究很少[1-10]。
贮藏蛋白质（Storage protein）是种子内贮藏物质的重要组分之一，为种子萌发和幼苗早期生长提供营养物质和能源[11]。种子内贮藏蛋白质主要以蛋白体形式存在，主要包括球蛋白（Globulin）、白蛋白（Albumin）、醇溶蛋白（Prolamin）和谷蛋白（Glutelin）四类。豆科种子中蛋白质含量丰富，以球蛋白为主（占60%～75%）[12-15]。种子贮藏蛋白质的降解一般分为三个步骤：①贮藏蛋白被修饰；②被修饰的贮藏蛋白（大分子）被肽链内切酶降解成小分子蛋白（肽）；③小分子蛋白被肽酶降解成氨基酸。子叶、下胚轴中蛋白质降解所得的部分氨基酸会重新合成新的蛋白质。在种子萌发早期，胚中这种蛋白质积累，可能是为幼苗生长提供营养，对幼苗存活具有重要意义[16-21]。笔者对4种柱花草种子萌发时胚中4种贮藏蛋白质（白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白）的降解和总蛋白含量的动态变化进行研究，旨在研究种子蛋白质的多态性，为科学保护和充分利用柱花草地方品种资源及育种研究提供理论依据。 1材料与方法
1.1材料来源
试验所用柱花草有
热研2号柱花草（S. guianensis SW. cv. Reyan No.2）、维拉诺有钩柱花草（S. hamata （L.）Taub.cv. Verano）、西卡柱花草（S. scabra Vog cv. Seca）、马弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）。种子产于海南省儋州市那大镇宝岛新村牧草基地，于2013年2月开始收集。
1.2方法
2013年4月8日开始，各选取50粒饱满健康、大小一致的种子进行发芽试验，设4个重复。播种前用80 ℃热水浸泡2～3 min后取出冷却，将处理后种子播种于放置2层滤纸（相对湿度60%～80%）的培养皿中，放入培养箱（25 ℃，湿度为80%～90%）中发芽，每隔2 d喷一次水以保持滤纸的湿润。
1.3样品制备根据不同的发芽时间进行取样，分别是发芽的第2、3、4、5、6、7天。用解剖刀把胚分成子叶、胚轴、胚根，装入相对应的密封塑料袋中，贴好标签，放入-80 ℃的超低温冰箱中保存备用。每次取样时挑出腐烂霉变的种子丢掉。
1.4测定项目
称取样品1 g左右，贮藏蛋白质通过以下方法进行分离。①白蛋白的分离方法为：用l0 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）缓冲液室温提取2 h，10 000 r/min低温离心10 min，取上清液备用；②球蛋白的分离方法为：用1 mol/L NaCl、10 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）缓冲液室温提取2 h，其他同上；③醇溶蛋白的分离方法为：用70%（V/V）乙醇、10 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）缓冲液室温提取2 h，其他同上；④谷蛋白的分离方法为：用浓度0.5%十二烷基硫酸钠、浓度1%巯基乙醇、10 mmol/L TrisHCL（pH7.5）缓冲液室温提取2 h，其他同上。用Bradford 蛋白质定量检测试剂盒对提取的蛋白进行分析测定。
1.5数据处理试验所测定的数据用Excel分析。
2结果与分析
2.1柱花草种子萌发过程中各贮藏蛋白质含量的变化
种子发芽是一个需要大量能量的过程。子叶中贮藏着富含化学能的有机物。在种子萌发过程中，有机物在释放能量的同时，转化成胚易吸收的形态[22]。当种子萌发，种子中的贮藏蛋白质在各种酶的作用下降解为小分子氨基酸，供给新蛋白质和其他代谢物质合成之用[23-24]。根据4种柱花草种子萌发程度的不同，选取柱花草萌发的5种不同状态的胚为样品进行4种蛋白质含量的测定。由图1～4可知，柱花草种子胚中4种蛋白质含量的大小顺序为球蛋白>白蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。
2.1.1热研2号柱花草种子不同萌发期球蛋白含量的变化。
由图1可知，球蛋白是柱花草种子中4种贮藏蛋白质中含量最高的蛋白质，在热研2号柱花草种子整个萌发过程中含量逐渐下降，到种子发芽末期，子叶中球蛋白含量总体下降了43%。在种子萌发初期球蛋白大量降解，萌发后期胚突破种皮形成幼芽后种子由异养逐渐向自养过渡，球蛋白的降解幅度减缓，从萌发4期到萌发5期球蛋白含量下降了12%。
2.1.2有钩柱花草种子不同萌发期白蛋白含量的变化。由图2可知，在有钩柱花草种子的整个发芽阶段，白蛋白含量逐渐减少。当种子开始萌发时白蛋白含量下降很快，到萌发后期白蛋白含量降低了58%。从萌发3期到萌发5期，白蛋白含量下降了27%。有钩柱花草种子白蛋白的含量仅次于球蛋白含量，是4种蛋白质中降解幅度较大的蛋白质，说明白蛋白是柱花草种子贮藏蛋白质的主要组分之一。
2.1.3西卡柱花草种子不同萌发期谷蛋白含量的变化。
由图3可知，在西卡柱花草种子的胚生长期和幼芽生长中期，谷蛋白含量略降低4%；到萌发4期，谷蛋白含量仅降低33%；到幼苗生长期，谷蛋白含量稍有增加，幅度为9%。在整个萌发过程中，谷蛋白含量变化幅度小，呈波浪状变化。谷蛋白在西卡柱花草种子整个萌发期间除醇溶蛋白以外是其他3种蛋白质中降解幅度最小的蛋白质。分析得出，在种子胚和幼芽生长初期，可能是由于此时需要许多的营养物质，谷蛋白在蛋白酶的作用下分解为各种氨基酸，含量降低。谷蛋白中含有丰富的谷氨酸和天门冬氨酸等氨基酸，是合成许多关键酶的原材料，所以后期重新合成谷蛋白，使其含量增加[25]。
在种子胚生长和幼芽生长初期醇溶蛋白含量增加，可能是由于萌发初期各种营养物质的降解需要足够多的酶来催化，因此一些酞胺类氨基酸又重新合成酶[26-27]。新合成的蛋白质（酶蛋白）调节其他物质的代谢变化，所以醇溶蛋白含量增加。
2.2柱花草种子萌发过程中总贮藏蛋白质含量的变化
在柱花草种子萌发过程中，当种子未露白时胚生长消耗大量的营养物质，蛋白质迅速分解，降解幅度大。在种子露白后，幼芽开始生长，蛋白质降解幅度变小。这是由于种子幼芽由异养转变成为自养，总蛋白质的降解幅度在萌发后期下降。总之，柱花草种子的萌发就是贮藏蛋白质不断降解成小分子化合物，从贮藏部位运送到利用部位以及分解的氨基酸重新组合成新的蛋白质的过程。总蛋白降解幅度的变化在一定程度上证明柱花草种子萌发是从异养到自养的过程。
2.2.1热研2号柱花草种子不同萌发期总蛋白质含量的变化。
由图5可知，热研2号柱花草种子萌发过程中总蛋白含量在整个萌发阶段逐渐减少，总蛋白的降解幅度为42%。在种子萌发初期胚突破种皮生长时，蛋白质的降解幅度相对较大，达到24%左右。而幼芽开始生长发育后总蛋白质的降解程度减小，降解幅度为4%左右。
3结论与讨论
研究表明，柱花草种子萌发过程中胚的4种贮藏蛋白质含量大小顺序为球蛋白>白蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。不同种类贮藏蛋白质的降解方式和降解程度不同。球蛋白和白蛋白是降解最多的蛋白质，是胚和幼芽生长的主要氮源。在整个萌发过程中，醇溶蛋白含量的变化与谷蛋白含量的变化相似，都呈波浪状变化。蛋白质总含量在4种柱花草种子整个萌发阶段是随着萌发的进行而逐渐减少，种子萌发早期蛋白质的降解幅度大于萌发后期蛋白质的降解幅度。 醇溶蛋白中含有丰富的谷酞胺和脯氨酸，其降解生成的脯氨酸能够保护植株幼体免受外界不良环境的影响[28-29]。在柱花草种子萌发后期，这种蛋白质的积累可能是为幼苗生长提供营养，对提高幼苗存活具有重要意义。而谷蛋白含量在总体上变化不明显，说明谷蛋白不是提供胚和幼芽生长的营养蛋白，有可能是功能蛋白或结构蛋白，需深入研究。
该研究分析了4种柱花草种子萌发和幼芽生长发育过程中贮藏蛋白质的代谢规律，为今后改进代谢途径来提高柱花草种子的发芽速度、整齐度以及幼苗存活率和抗逆性等提供理论指导，对柱花草的种子生产有重要意义。研究柱花草种子贮藏蛋白质的多样性，可为结合柱花草新品种登记和保护、品种亲缘关系和分类研究以及构建蛋白质指纹图谱等方面提供一定的理论依据。
参考文献
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关键词柱花草；贮藏蛋白质；种子萌发
中图分类号S541+.9文献标识码
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Abstract [Objective] The four kinds of storage protein contents changed in four Stylo seed germination. [Method] To determine the extraction of protein by Bradford protein assay kit. [Result] The results showed that the storage protein content of Stylo seed embryo in the size of globulin>albumin>glutenin>prolamin. Globulin had a large number of degradation in the embryo period ， the contents dropped 43% totally. Albumin decreased rapidly in the begin of germination， by 39%. In the late stage of germination， while the seed germ grow to 4.3 cm， albumin content reduced 58%. The change of protein content in the whole germination had wavy， prolamin resembled with glutenin， its degradation was the smallest. The total protein content in the whole germination stage reduced gradually， the total protein of hook Stylos degraded maximum， by 49%. The rest of the difference was not obvious. [Conclusion] Protein degradation in earlier stage was greater than the later stage in seed germination. At the beginning of Stylos seed germination， storage proteins had difference degradation， which provide nutrients to embryo growth and development， at the later period bud through the seed coat， the degradation decreased， the seeds transited from heterotrophic to autotrophic gradually.
Key words Stylo； Storage protein； Seed germination
柱花草属（Stylosanthes SW.）为多年生豆科植物，广泛分布于世界热带、亚热带地区。柱花草性喜湿热，耐酸瘦土，抗炭疽病，适生于我国热带、南亚热带地区，目前在海南、广东、广西等省区的推广面积约53万hm2。柱花草产量高，枝叶营养丰富，干物质粗蛋白含量15%～16%，同时含有多种氨基酸，是畜禽的优良饲料。柱花草根系发达，并且具有生物固氮能力，可固氮225～300 kg/hm2，是幼龄果园和热带经济林的理想绿肥作物，对防止雨水冲刷、保持水土、改良和培肥土壤、促进果树、林木生长发育具有显著作用。人们可充分利用荒山荒坡、果园、热带经济作物园和林间空地种植柱花草，以发展食草型、节粮型畜禽，为饲料工业主产提供优质草粉。目前关于柱花草的研究主要集中于植株形态、高产栽培技术、种子生产技术、品质、抗性、品种选育、饲料开发以及遗传多样性研究等方面，对种子发芽机理、机制的研究很少[1-10]。
贮藏蛋白质（Storage protein）是种子内贮藏物质的重要组分之一，为种子萌发和幼苗早期生长提供营养物质和能源[11]。种子内贮藏蛋白质主要以蛋白体形式存在，主要包括球蛋白（Globulin）、白蛋白（Albumin）、醇溶蛋白（Prolamin）和谷蛋白（Glutelin）四类。豆科种子中蛋白质含量丰富，以球蛋白为主（占60%～75%）[12-15]。种子贮藏蛋白质的降解一般分为三个步骤：①贮藏蛋白被修饰；②被修饰的贮藏蛋白（大分子）被肽链内切酶降解成小分子蛋白（肽）；③小分子蛋白被肽酶降解成氨基酸。子叶、下胚轴中蛋白质降解所得的部分氨基酸会重新合成新的蛋白质。在种子萌发早期，胚中这种蛋白质积累，可能是为幼苗生长提供营养，对幼苗存活具有重要意义[16-21]。笔者对4种柱花草种子萌发时胚中4种贮藏蛋白质（白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白）的降解和总蛋白含量的动态变化进行研究，旨在研究种子蛋白质的多态性，为科学保护和充分利用柱花草地方品种资源及育种研究提供理论依据。 1材料与方法
1.1材料来源
试验所用柱花草有
热研2号柱花草（S. guianensis SW. cv. Reyan No.2）、维拉诺有钩柱花草（S. hamata （L.）Taub.cv. Verano）、西卡柱花草（S. scabra Vog cv. Seca）、马弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）。种子产于海南省儋州市那大镇宝岛新村牧草基地，于2013年2月开始收集。
1.2方法
2013年4月8日开始，各选取50粒饱满健康、大小一致的种子进行发芽试验，设4个重复。播种前用80 ℃热水浸泡2～3 min后取出冷却，将处理后种子播种于放置2层滤纸（相对湿度60%～80%）的培养皿中，放入培养箱（25 ℃，湿度为80%～90%）中发芽，每隔2 d喷一次水以保持滤纸的湿润。
1.3样品制备根据不同的发芽时间进行取样，分别是发芽的第2、3、4、5、6、7天。用解剖刀把胚分成子叶、胚轴、胚根，装入相对应的密封塑料袋中，贴好标签，放入-80 ℃的超低温冰箱中保存备用。每次取样时挑出腐烂霉变的种子丢掉。
1.4测定项目
称取样品1 g左右，贮藏蛋白质通过以下方法进行分离。①白蛋白的分离方法为：用l0 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）缓冲液室温提取2 h，10 000 r/min低温离心10 min，取上清液备用；②球蛋白的分离方法为：用1 mol/L NaCl、10 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）缓冲液室温提取2 h，其他同上；③醇溶蛋白的分离方法为：用70%（V/V）乙醇、10 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）缓冲液室温提取2 h，其他同上；④谷蛋白的分离方法为：用浓度0.5%十二烷基硫酸钠、浓度1%巯基乙醇、10 mmol/L TrisHCL（pH7.5）缓冲液室温提取2 h，其他同上。用Bradford 蛋白质定量检测试剂盒对提取的蛋白进行分析测定。
1.5数据处理试验所测定的数据用Excel分析。
2结果与分析
2.1柱花草种子萌发过程中各贮藏蛋白质含量的变化
种子发芽是一个需要大量能量的过程。子叶中贮藏着富含化学能的有机物。在种子萌发过程中，有机物在释放能量的同时，转化成胚易吸收的形态[22]。当种子萌发，种子中的贮藏蛋白质在各种酶的作用下降解为小分子氨基酸，供给新蛋白质和其他代谢物质合成之用[23-24]。根据4种柱花草种子萌发程度的不同，选取柱花草萌发的5种不同状态的胚为样品进行4种蛋白质含量的测定。由图1～4可知，柱花草种子胚中4种蛋白质含量的大小顺序为球蛋白>白蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。
2.1.1热研2号柱花草种子不同萌发期球蛋白含量的变化。
由图1可知，球蛋白是柱花草种子中4种贮藏蛋白质中含量最高的蛋白质，在热研2号柱花草种子整个萌发过程中含量逐渐下降，到种子发芽末期，子叶中球蛋白含量总体下降了43%。在种子萌发初期球蛋白大量降解，萌发后期胚突破种皮形成幼芽后种子由异养逐渐向自养过渡，球蛋白的降解幅度减缓，从萌发4期到萌发5期球蛋白含量下降了12%。
2.1.2有钩柱花草种子不同萌发期白蛋白含量的变化。由图2可知，在有钩柱花草种子的整个发芽阶段，白蛋白含量逐渐减少。当种子开始萌发时白蛋白含量下降很快，到萌发后期白蛋白含量降低了58%。从萌发3期到萌发5期，白蛋白含量下降了27%。有钩柱花草种子白蛋白的含量仅次于球蛋白含量，是4种蛋白质中降解幅度较大的蛋白质，说明白蛋白是柱花草种子贮藏蛋白质的主要组分之一。
2.1.3西卡柱花草种子不同萌发期谷蛋白含量的变化。
由图3可知，在西卡柱花草种子的胚生长期和幼芽生长中期，谷蛋白含量略降低4%；到萌发4期，谷蛋白含量仅降低33%；到幼苗生长期，谷蛋白含量稍有增加，幅度为9%。在整个萌发过程中，谷蛋白含量变化幅度小，呈波浪状变化。谷蛋白在西卡柱花草种子整个萌发期间除醇溶蛋白以外是其他3种蛋白质中降解幅度最小的蛋白质。分析得出，在种子胚和幼芽生长初期，可能是由于此时需要许多的营养物质，谷蛋白在蛋白酶的作用下分解为各种氨基酸，含量降低。谷蛋白中含有丰富的谷氨酸和天门冬氨酸等氨基酸，是合成许多关键酶的原材料，所以后期重新合成谷蛋白，使其含量增加[25]。
在种子胚生长和幼芽生长初期醇溶蛋白含量增加，可能是由于萌发初期各种营养物质的降解需要足够多的酶来催化，因此一些酞胺类氨基酸又重新合成酶[26-27]。新合成的蛋白质（酶蛋白）调节其他物质的代谢变化，所以醇溶蛋白含量增加。
2.2柱花草种子萌发过程中总贮藏蛋白质含量的变化
在柱花草种子萌发过程中，当种子未露白时胚生长消耗大量的营养物质，蛋白质迅速分解，降解幅度大。在种子露白后，幼芽开始生长，蛋白质降解幅度变小。这是由于种子幼芽由异养转变成为自养，总蛋白质的降解幅度在萌发后期下降。总之，柱花草种子的萌发就是贮藏蛋白质不断降解成小分子化合物，从贮藏部位运送到利用部位以及分解的氨基酸重新组合成新的蛋白质的过程。总蛋白降解幅度的变化在一定程度上证明柱花草种子萌发是从异养到自养的过程。
2.2.1热研2号柱花草种子不同萌发期总蛋白质含量的变化。
由图5可知，热研2号柱花草种子萌发过程中总蛋白含量在整个萌发阶段逐渐减少，总蛋白的降解幅度为42%。在种子萌发初期胚突破种皮生长时，蛋白质的降解幅度相对较大，达到24%左右。而幼芽开始生长发育后总蛋白质的降解程度减小，降解幅度为4%左右。
3结论与讨论
研究表明，柱花草种子萌发过程中胚的4种贮藏蛋白质含量大小顺序为球蛋白>白蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。不同种类贮藏蛋白质的降解方式和降解程度不同。球蛋白和白蛋白是降解最多的蛋白质，是胚和幼芽生长的主要氮源。在整个萌发过程中，醇溶蛋白含量的变化与谷蛋白含量的变化相似，都呈波浪状变化。蛋白质总含量在4种柱花草种子整个萌发阶段是随着萌发的进行而逐渐减少，种子萌发早期蛋白质的降解幅度大于萌发后期蛋白质的降解幅度。 醇溶蛋白中含有丰富的谷酞胺和脯氨酸，其降解生成的脯氨酸能够保护植株幼体免受外界不良环境的影响[28-29]。在柱花草种子萌发后期，这种蛋白质的积累可能是为幼苗生长提供营养，对提高幼苗存活具有重要意义。而谷蛋白含量在总体上变化不明显，说明谷蛋白不是提供胚和幼芽生长的营养蛋白，有可能是功能蛋白或结构蛋白，需深入研究。
该研究分析了4种柱花草种子萌发和幼芽生长发育过程中贮藏蛋白质的代谢规律，为今后改进代谢途径来提高柱花草种子的发芽速度、整齐度以及幼苗存活率和抗逆性等提供理论指导，对柱花草的种子生产有重要意义。研究柱花草种子贮藏蛋白质的多样性，可为结合柱花草新品种登记和保护、品种亲缘关系和分类研究以及构建蛋白质指纹图谱等方面提供一定的理论依据。
参考文献
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