论文部分内容阅读
【摘 要】非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）的药物治疗目前仍以含铂双药联合化疗为标准治疗方案，但多项研究表明，化疗药物对于NSCLC的疗效达到瓶颈。在这样的背景下，通过干预表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶信号转导以治疗NSCLC的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）逐渐成为我们关注的焦点。但无论近期疗效如何，最终患者都不可避免的产生耐药及病情进展。因此，了解 EGFR-TKI 耐药机制有利于指导临床制定克服耐药的策略。故本文对EGFR-TKI的耐药机制进行综述。
【关键词】 表皮生长因子受体； 非小细胞肺癌； 酪氨酸激酶抑制剂； 耐药； 突变
【中图分类号】R734 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）04-01890-03
【Abstract】Nowadays ，the standard option for non-small cell lung carcinoma（NSCLC） is still Platinum-based double drug combination chemotherapy， the efficiency of chemotherapy，however，has hit a plateau .In this situation，tyrosine kinase inhibitor（TKI） which treats NSCLC through interrupting epidermal growth factor receptor（EGFR）signaling gradually becomes our focus .However it will eventually develop resistance to these TKIs and the disease will progress simultaneously. Therefore，understanding the resistance mechanisms of EGFR-response to TKIs will guide the clinic.In this paper， we summarize the mechanisms of resistance to EGFR TKIs that have been identified to date and discusses potential therapeutic strategies to overcome EGFR TKI resistance in NSCLC patients.
【Key words】Epidermal growth factor receptor； Non-small cell lung cancer； Tyrosine kinase inhibitor； Drug resistance； Mutant
1 引言
在世界范圍内，肺癌是目前癌症死亡的首要原因。传统含铂双药对于进展期肺癌的治疗效果并不理想，随着多种致癌基因的发现，多种以突变致癌基因为目标的靶向治疗药物应运而生。在NSCLC患者中， EGFR是较为常见的致癌基因之一，EGFR信号传导通路参与调控细胞的存活、增殖、细胞侵袭及转移等过程[1]。EGFR-TKI正是基于这一基础研究的治疗NSCLC的靶向药物。IPASS、INTEREST 和SAT-URN研究分别证实EGRF突变者接受TKI治疗均能明显获益[2]。然而，患者最终会因各种原因出现耐药。本文对此进行综述，以期为NSCLC的临床治疗及基础研究提供参考。
2 EGFR 基因及其突变
EGFR 属于EGFR受体家族，主要由胞外配体结合区、跨膜区和胞内区构成。EGFR-TKI是一类分子靶向药物，可以通过和三磷酸腺苷竞争，可逆性与EGFR胞内酪氨酸激酶结合并抑制其活性，遏制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移。EGFR 是多种分子进程信号通路中主要的组成部分[3]。研究发现，19号外显子缺失突变和21号外显子密码子858替代突变（i858）对TKI高度敏感。但与此同时，也有部分突变与耐药的机制相关，如EGFR基因20外显子768～774位插入突变可导致肿瘤细胞对EGFR-TKI的敏感性降低，引起EGFR-TKI原发性耐药，EGFR基因二次突变则与继发性耐药有关[4]。
3 EGFR-TKIs 的耐药机制
3.1.原发性耐药
原发性耐药即患者对首次使用TKI治疗无反应，在症状改善、病灶控制和生存时间等方面未获得明显益处。其原因主要包括：
3.1.1.EGFR耐药突变
临床研究[5]证实，EGFR突变阳性的NSCLC对吉非替尼或厄洛替尼的治疗有效率为70%-80%，而野生型患者的有效率仅约10%-20%，因而，不少患者对EGFR-TKIs存在着原发性耐药，某些EGFR突变也可以引起NSCLC对EGFR-TKIs耐药，如治疗前存在EGFR20外显子插人突变提示原发性耐药[6]。
3.1.2.RAS基因突变的存在。
在亚洲，这一人群的比例<10%[7]。ras基因编码的蛋白家族与 MAPK、STAT3及PI3K等信号分子相互作用，在调控细胞生长、分化和凋亡中起到重要作用。在 EGFR下游信号通路中，ras通过活化Raf激酶和MAPK促进细胞增殖，导致对 EGFR-TKI 耐药[8]。 Pao等[9]曾收集了60例首次接受TKI单药化疗的肺腺癌患者，在38例对TKI不敏感的患者中，9例存在K-RAS的基因突变；而在客观缓解的21例患者中，均无K-RAS的突变。由此可以推断，K-RAS突变与肺腺癌患者TKI原发性耐药密切相关。 3.1.3.B-Raf基因突变
B-Raf基因全称鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（vraf murine sarcoma viral oncogene homologB1），是EGFR信号通路中位于K-ras下游的一个基因。B-Raf编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，将信号从Ras转导至MEK1/2，参与调控细胞的生长、增殖与分化。B-Raf基因在非小细胞肺癌中的突变率为1%～3%，突变多为15外显子第1 799位核苷酸上T替换成A，导致谷氨酸被缬氨酸所取代（V600E）[10]。B-Raf突变可导致10%～15%的K-ras野生型非小细胞肺癌患者发生EGFR-TKI原发性耐药。
3.1.4.HER2基因突变
人类表皮生长因子受体2（human epid-ermal growth factor receptor-2，HER2），又称c-erbB-2基因，是表皮生长因子受体家族成员之一。HER2具有酪氨酸激酶活性，可与EGFR构成异源二聚体，激活酪氨酸激酶，使受体自身磷酸化，活化下游信号分子，促进肿瘤细胞生长、增殖及分化。突变的HER2具有更强的受体活性和信号转导能力，可降低EGFR-TKI治疗效果，导致原发耐药[11]。
3.1.5.EML4-ALK
棘皮动物微管相关蛋白样4（ echinoderm microtubule associated protein like 4，EML4）间变性淋巴瘤激酶（ anaplastic lymphomakinase，ALK）融合基因（ EML4-ALK）是NSCLC中新发现的癌变驱动基因[12]。在 NSCLC 患者中有约3% ～ 7% 的患者含有该融合基因，由于EML4-ALK 融合基因通过激活Ras/Mek/Erk、PI3K/Akt及STAT3的信号通路产生致瘤作用[13]，使得存在该融合基因的患者使用TKI并不能抑制Akt的活化。
3.1.6.其他学说
其他可能的原发耐药机制还有ROS1基因重排， KIF5B-RET基因融合， NF-κB信号途径的激活。
3.2.获得性耐药
EGFR—TKI获得性耐药的定义目前仍有争议。目前认为EGFR—TKIs治疗有确切的临床获益，按照RECIST或WHO标准疾病进展后，继续单药EGFR-TKIs治疗至少30天无效。
3.2.1.EGFR 基因的二次突变
3.2.1.1.T790M突变
目前最普遍认同的是二次突变学说，EGFR基因20外显子在吉非替尼治疗过程中出现二次突变，导致EGFR 790位的苏氨酸被甲硫氨酸所取代。构成了空间位阻，阻碍了TKI和EGFR-TK相应位点的竞争性结合，而ATP与酪氨酸激酶的结合则不受影响，使得激酶可以继续磷酸化[14]。Pao 等[15]回顾性分析了 155 例 NSCLC 患者治疗前肿瘤组织的EGFR，结果无一例携带 T790M 突变。Bell等人[16]在研究之后指出：T790M并非致癌性突变，其在肿瘤早期可能仅以微小克隆的形式存在于癌组织中，随着敏感克隆被TKI清除而被保留下来并进一步扩增，从而在肿瘤发展的继承阶段起重要作用。
3.2.1.2.非T790M突变
继发性耐药突变还有D761Y、L858R、L747S、E884K及G796A等，它们的总发生率小于5%。与T790M突变相比，其耐药可能性要小很多[17]。一项关于L858R、L747S和L858R、D761Y突变的体外临床试验显示，当吉非替尼或厄洛替尼达到1uM时，可以阻止这些突变，提示可以通过TKI的剂量转换来解决对TKI的耐药[18]。
3.2.2.c-Met 的扩增
2007年，Dana-Farber肿瘤研究中心报道了MET基因的扩增可能与TKI的获得性耐药有关。MET是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）受体，与肿瘤的扩增、侵袭和转移有关。MET基因扩增在未经治疗的NSCLC中很少见，但却存在于对TKI产生获得性耐药的部分病例中，提示其与另一种新的耐药机制有关[19]。Met 扩增通过EGFR3 介导的PI3K/蛋白激酶B 信号通路促进肿瘤细胞的增殖； 相对于未接受治疗的肺癌患者，伴有吉非替尼耐药的NSCLC 患者中Met 基因扩增会被更频繁的检出[20]。癌基因 Met 的扩增导致 20% 的EGFR 突變的 NSCLC 患者 TKI 耐药，且与 T790M 突变无关。Engelman 等[21]构建一株开始对吉非替尼敏感但暴露在递增浓度的吉非替尼6 个月后产生耐药克隆的细胞株，其耐药原因是 Met 基因的扩增。这提示未来临床设计的 EGFR-TKI 获得性耐药的抑制剂不仅要阻断 EGFR T790M 突变通路，还需要阻断 MET/ErbB3/PI3K 信号轴。
3.2.3.pten基因突变
张力蛋白同源的 10 号染色体缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homology deleted onchromosome ten，PTEN）是一个抑癌基因，其表达产物具有抑制肿瘤的作用，能够负向调控Akt，控制细胞的增殖与生存，在 PI3K / Akt 通路中具有重要的作用。早在 2005 年 Kokubo 等[22]即发现PTEN 低表达与吉非替尼获得性耐药相关。Endoh等[23]的一项研究也显示在吉非替尼治疗的患者中PTEN 高表达者生存期较长。而 EGFR 激活突变的患者若存在 PTEN 缺失，EGFR-TKI 治疗效果亦不佳[24]。Cappuzzo 等[25]在 93 例经吉非替尼治疗的NSCLC 患者中检测出 19 例存在 PTEN 缺失，但客观有效率、疾病进展时间及生存时间与 PTEN 阳性患者比较未显示有明显差异。研究显示，PTEN 可通过激活 Akt 导致 EGFR-TKI 耐药[26]。另外，最近有学者在 PC9 与 PC9 耐药细胞株中发现核转录因子EGR1 的低表达导致了 PTEN 表达降低[27]，也可能是引起 TKI 耐药的机制之一。NSCLC 患者中，PTEN 基因表达丧失（ < 5%） ，使得蛋白激酶 B 过度表达而抵抗凋亡，进而对 EGFR-TKI 产生耐药[28]. 3.2.4.PIK3CA基因突變
PIK3CA基因编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylino-sitol 3-kinases，PI3Ks）的催化亚基，由生长因子受体如EGFR、胰岛素受体等激活。活化的PI3Ks磷酸化4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2），生成第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）并激活Akt、GSK-3β、mTOR、FH等下游分子，调控细胞的成长、增殖、分化、黏附和迁移[29]。PIK3CA的突变多发生于9号外显子编码的螺旋区和20号外显子编码的激酶区[30]。研究表明PIK3CA基因突变可导致PI3K-Akt信号传导通路持续激活，致使肿瘤细胞对EGFR-TKI的敏感性降低，发生EGFR-TKI耐药[31]。
3.2.5.上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）
EMT 在肿瘤的发展与转移中起着重要的作用，代表上皮表型的上皮细胞钙黏蛋白（ E-cadherin） 减少，增强细胞运动及代表间质表型的蛋白如纤维连接蛋白、波形蛋白等增多是 EMT 的主要特点。肿瘤细胞需要经历 EMT 才具有扩散转移的能力。在肺腺癌中近半数的 TKI 获得性耐药与EMT 有关[32]。Thomson 等[33]的实验表明 EGFR-TKI 对肿瘤细胞基础水平 p-Akt 和 p-Erk 的抑制只在上皮表型的肿瘤细胞中起作用，而对间质表型的肿瘤细胞无效。Chung 等[34]报道的 1 例 NSCLC 患者经过近 1 年 EGFR-TKI 治疗后病情复发进展。在其转移肿瘤组织中，并未检测出 EGFR T790M 突变或 MET 扩增等已知的获得性耐药机制，却发现上皮细胞钙黏蛋白缺失，波形蛋白表达增加，即出现EMT。这些研究均提示 EMT 与 EGFR-TKI 获得性耐药有着密不可分的联系。
3.2.6.胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）
IGF-1R 是一种跨膜蛋白，在肿瘤转化及肿瘤细胞的增殖等方面起着重要作用。IGF-1R主要通过Ras/Raf /MAPK通路及PI3K/Akt通路起作用。抑制IGF-1R 能够下调PI3K/Akt通路的信号转导，使吉非替尼的药效增强[35]。抑制IGF-1R的活化或降低生存素的表达可增加NSCLC 细胞死亡。多数存在EGFR过表达的NSCLC组织伴有 IGF-1R的高表达，这些均提示IGF-1R与EGFR-TKI耐药有关，抑制 IGF-1R 的信号通路可能逆转或延迟 NSCLC 患者的获得性耐药。
3.2.7.其他学说
学者还提出了一些其他可能的耐药机制，如肝细胞生长因子过表达，双调蛋白升高，整合素β1上调， BIM 下调，10号染色体q23D的缺失、细胞的程序性死亡。AXL受体酪氨酸激酶的激活等。
4 结语
虽然分子靶向治疗对NSCLC的治疗具有重大的意义，但随之而来的耐药现象也不可避免地为靶向治疗带来了不小的麻烦，针对于一个靶点的研究往往不能取得很好的疗效， 本文所提及的耐药机制可能只是TKI耐药机制的冰山一角，可能发现某些耐药机制之间存在交互作用，甚至只是同一机制的不同阶段，亦或某种机制既参与原发耐药也参与获得性耐药.充分了解EGFR-TKI的耐药机制有助于寻找到能够预测疗效和指导治疗策略的分子标志物，使得NSCLC的靶向治疗效果更上一层楼。
References：
[1] Olaussen， K.A.， et al.， Telomeres and telomerase as targets for anticancer drug development. Crit Rev Oncol Hematol， 2006. 57（3）： p. 191-214.
[2] Cappuzzo， F.， et al.， Erlotinib as maintenance treatment in advanced non-small-cell lung cancer： a multicentre， randomised， placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol， 2010. 11（6）： p. 521-9.
[3] Lin， L. and T.G. Bivona， Mechanisms of Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitors and Novel Therapeutic Strategies to Overcome Resistance in NSCLC Patients. Chemother Res Pract， 2012. 2012： p. 817297.
[4] Epidermal Growth Factor Receptor Mutation （EGFR） Testing for Prediction of Response to EGFR-Targeting Tyrosine Kinase Inhibitor （TKI） Drugs in Patients with Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer： An Evidence-Based Analysis. Ont Health Technol Assess Ser， 2010. 10（24）： p. 1-48.
[5] Mitsudomi， T. and Y. Yatabe， Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Sci， 2007. 98（12）： p. 1817-24. [6] Greulich， H.， et al.， Oncogenic transformation by inhibitor-sensitive and -resistant EGFR mutants. PLoS Med， 2005. 2（11）： p. e313.
[7] Linardou， H.， et al.， Assessment of somatic k-RAS mutations as a mechanism associated with resistance to EGFR-targeted agents： a systematic review and meta-analysis of studies in advanced non-small-cell lung cancer and metastatic colorectal cancer. Lancet Oncol， 2008. 9（10）： p. 962-72.
[8] Luo， F.， et al.， Mutated K-ras（Asp12） promotes tumourigenesis in Apc（Min） mice more in the large than the small intestines， with synergistic effects between K-ras and Wnt pathways. Int J Exp Pathol， 2009. 90（5）： p. 558-74.
[9] Pao， W.， et al.， EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A， 2004. 101（36）： p. 13306-11.
[10] Tan， Y.H.， et al.， Detection of BRAF V600E mutation by pyrosequencing. Pathology， 2008. 40（3）： p. 295-8.
[11] Wang， S.E.， et al.， HER2 kinase domain mutation results in constitutive phosphorylation and activation of HER2 and EGFR and resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Cell， 2006. 10（1）： p. 25-38.
[12] Soda， M.， et al.， Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature， 2007. 448（7153）： p. 561-6.
[13] Li， Y.， et al.， Evaluation of EML4-ALK fusion proteins in non-small cell lung cancer using small molecule inhibitors. Neoplasia， 2011. 13（1）： p. 1-11.
[14] Kobayashi， S.， et al.， EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med， 2005. 352（8）： p. 786-92.
[15] Pao， W.， et al.， Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain. PLoS Med， 2005. 2（3）： p. e73.
[16] Bell， D.W.， et al.， Inherited susceptibility to lung cancer may be associated with the T790M drug resistance mutation in EGFR. Nat Genet， 2005. 37（12）： p. 1315-6.
[17] Tokumo， M.， et al.， Double mutation and gene copy number of EGFR in gefitinib refractory non-small-cell lung cancer. Lung Cancer， 2006. 53（1）： p. 117-21.
[18] Costa， D.B.， et al.， Differential responses to erlotinib in epidermal growth factor receptor （EGFR）-mutated lung cancers with acquired resistance to gefitinib carrying the L747S or T790M secondary mutations. J Clin Oncol， 2008. 26（7）： p. 1182-4； author reply 1184-6. [19] Smolen， G.A.， et al.， Amplification of MET may identify a subset of cancers with extreme sensitivity to the selective tyrosine kinase inhibitor PHA-665752. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006. 103（7）： p. 2316-21.
[20] Bean， J.， et al.， MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A， 2007. 104（52）： p. 20932-7.
[21] Engelman， J.A.， et al.， MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science， 2007. 316（5827）： p. 1039-43.
[22] Kokubo， Y.， et al.， Reduction of PTEN protein and loss of epidermal growth factor receptor gene mutation in lung cancer with natural resistance to gefitinib （IRESSA）. Br J Cancer， 2005. 92（9）： p. 1711-9.
[23] Endoh， H.， et al.， PTEN and PIK3CA expression is associated with prolonged survival after gefitinib treatment in EGFR-mutated lung cancer patients. J Thorac Oncol， 2006. 1（7）： p. 629-34.
[24] Vivanco， I.， et al.， The phosphatase and tensin homolog regulates epidermal growth factor receptor （EGFR） inhibitor response by targeting EGFR for degradation. Proc Natl Acad Sci U S A， 2010. 107（14）： p. 6459-64.
[25] Cappuzzo， F.， et al.， Insulin-like growth factor receptor 1 （IGFR-1） is significantly associated with longer survival in non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib. Ann Oncol， 2006. 17（7）： p. 1120-7.
[26] Sos， M.L.， et al.， PTEN loss contributes to erlotinib resistance in EGFR-mutant lung cancer by activation of Akt and EGFR. Cancer Res， 2009. 69（8）： p. 3256-61.
[27] Yamamoto， C.， et al.， Loss of PTEN expression by blocking nuclear translocation of EGR1 in gefitinib-resistant lung cancer cells harboring epidermal growth factor receptor-activating mutations. Cancer Res， 2010. 70（21）： p. 8715-25.
[28] Sharma， S.V.， et al.， A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell， 2010. 141（1）： p. 69-80.
[29] Vanhaesebroeck， B. and M.D. Waterfield， Signaling by distinct classes of phosphoinositide 3-kinases. Exp Cell Res， 1999. 253（1）： p. 239-54.
[30] Samuels， Y.， et al.， High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science， 2004. 304（5670）： p. 554.
[31] Samuels， Y.， et al.， Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells. Cancer Cell， 2005. 7（6）： p. 561-73.
[32] Uramoto， H.， et al.， Epithelial-mesenchymal transition in EGFR-TKI acquired resistant lung adenocarcinoma. Anticancer Res， 2010. 30（7）： p. 2513-7.
[33] Thomson， S.， et al.， Kinase switching in mesenchymal-like non-small cell lung cancer lines contributes to EGFR inhibitor resistance through pathway redundancy. Clin Exp Metastasis， 2008. 25（8）： p. 843-54.
[34] Chung， J.H.， et al.， Clinical and molecular evidences of epithelial to mesenchymal transition in acquired resistance to EGFR-TKIs. Lung Cancer， 2011. 73（2）： p. 176-82.
[35] Guix， M.， et al.， Acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors in cancer cells is mediated by loss of IGF-binding proteins. J Clin Invest， 2008. 118（7）： p. 2609-19.
【关键词】 表皮生长因子受体； 非小细胞肺癌； 酪氨酸激酶抑制剂； 耐药； 突变
【中图分类号】R734 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）04-01890-03
【Abstract】Nowadays ，the standard option for non-small cell lung carcinoma（NSCLC） is still Platinum-based double drug combination chemotherapy， the efficiency of chemotherapy，however，has hit a plateau .In this situation，tyrosine kinase inhibitor（TKI） which treats NSCLC through interrupting epidermal growth factor receptor（EGFR）signaling gradually becomes our focus .However it will eventually develop resistance to these TKIs and the disease will progress simultaneously. Therefore，understanding the resistance mechanisms of EGFR-response to TKIs will guide the clinic.In this paper， we summarize the mechanisms of resistance to EGFR TKIs that have been identified to date and discusses potential therapeutic strategies to overcome EGFR TKI resistance in NSCLC patients.
【Key words】Epidermal growth factor receptor； Non-small cell lung cancer； Tyrosine kinase inhibitor； Drug resistance； Mutant
1 引言
在世界范圍内，肺癌是目前癌症死亡的首要原因。传统含铂双药对于进展期肺癌的治疗效果并不理想，随着多种致癌基因的发现，多种以突变致癌基因为目标的靶向治疗药物应运而生。在NSCLC患者中， EGFR是较为常见的致癌基因之一，EGFR信号传导通路参与调控细胞的存活、增殖、细胞侵袭及转移等过程[1]。EGFR-TKI正是基于这一基础研究的治疗NSCLC的靶向药物。IPASS、INTEREST 和SAT-URN研究分别证实EGRF突变者接受TKI治疗均能明显获益[2]。然而，患者最终会因各种原因出现耐药。本文对此进行综述，以期为NSCLC的临床治疗及基础研究提供参考。
2 EGFR 基因及其突变
EGFR 属于EGFR受体家族，主要由胞外配体结合区、跨膜区和胞内区构成。EGFR-TKI是一类分子靶向药物，可以通过和三磷酸腺苷竞争，可逆性与EGFR胞内酪氨酸激酶结合并抑制其活性，遏制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移。EGFR 是多种分子进程信号通路中主要的组成部分[3]。研究发现，19号外显子缺失突变和21号外显子密码子858替代突变（i858）对TKI高度敏感。但与此同时，也有部分突变与耐药的机制相关，如EGFR基因20外显子768～774位插入突变可导致肿瘤细胞对EGFR-TKI的敏感性降低，引起EGFR-TKI原发性耐药，EGFR基因二次突变则与继发性耐药有关[4]。
3 EGFR-TKIs 的耐药机制
3.1.原发性耐药
原发性耐药即患者对首次使用TKI治疗无反应，在症状改善、病灶控制和生存时间等方面未获得明显益处。其原因主要包括：
3.1.1.EGFR耐药突变
临床研究[5]证实，EGFR突变阳性的NSCLC对吉非替尼或厄洛替尼的治疗有效率为70%-80%，而野生型患者的有效率仅约10%-20%，因而，不少患者对EGFR-TKIs存在着原发性耐药，某些EGFR突变也可以引起NSCLC对EGFR-TKIs耐药，如治疗前存在EGFR20外显子插人突变提示原发性耐药[6]。
3.1.2.RAS基因突变的存在。
在亚洲，这一人群的比例<10%[7]。ras基因编码的蛋白家族与 MAPK、STAT3及PI3K等信号分子相互作用，在调控细胞生长、分化和凋亡中起到重要作用。在 EGFR下游信号通路中，ras通过活化Raf激酶和MAPK促进细胞增殖，导致对 EGFR-TKI 耐药[8]。 Pao等[9]曾收集了60例首次接受TKI单药化疗的肺腺癌患者，在38例对TKI不敏感的患者中，9例存在K-RAS的基因突变；而在客观缓解的21例患者中，均无K-RAS的突变。由此可以推断，K-RAS突变与肺腺癌患者TKI原发性耐药密切相关。 3.1.3.B-Raf基因突变
B-Raf基因全称鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（vraf murine sarcoma viral oncogene homologB1），是EGFR信号通路中位于K-ras下游的一个基因。B-Raf编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，将信号从Ras转导至MEK1/2，参与调控细胞的生长、增殖与分化。B-Raf基因在非小细胞肺癌中的突变率为1%～3%，突变多为15外显子第1 799位核苷酸上T替换成A，导致谷氨酸被缬氨酸所取代（V600E）[10]。B-Raf突变可导致10%～15%的K-ras野生型非小细胞肺癌患者发生EGFR-TKI原发性耐药。
3.1.4.HER2基因突变
人类表皮生长因子受体2（human epid-ermal growth factor receptor-2，HER2），又称c-erbB-2基因，是表皮生长因子受体家族成员之一。HER2具有酪氨酸激酶活性，可与EGFR构成异源二聚体，激活酪氨酸激酶，使受体自身磷酸化，活化下游信号分子，促进肿瘤细胞生长、增殖及分化。突变的HER2具有更强的受体活性和信号转导能力，可降低EGFR-TKI治疗效果，导致原发耐药[11]。
3.1.5.EML4-ALK
棘皮动物微管相关蛋白样4（ echinoderm microtubule associated protein like 4，EML4）间变性淋巴瘤激酶（ anaplastic lymphomakinase，ALK）融合基因（ EML4-ALK）是NSCLC中新发现的癌变驱动基因[12]。在 NSCLC 患者中有约3% ～ 7% 的患者含有该融合基因，由于EML4-ALK 融合基因通过激活Ras/Mek/Erk、PI3K/Akt及STAT3的信号通路产生致瘤作用[13]，使得存在该融合基因的患者使用TKI并不能抑制Akt的活化。
3.1.6.其他学说
其他可能的原发耐药机制还有ROS1基因重排， KIF5B-RET基因融合， NF-κB信号途径的激活。
3.2.获得性耐药
EGFR—TKI获得性耐药的定义目前仍有争议。目前认为EGFR—TKIs治疗有确切的临床获益，按照RECIST或WHO标准疾病进展后，继续单药EGFR-TKIs治疗至少30天无效。
3.2.1.EGFR 基因的二次突变
3.2.1.1.T790M突变
目前最普遍认同的是二次突变学说，EGFR基因20外显子在吉非替尼治疗过程中出现二次突变，导致EGFR 790位的苏氨酸被甲硫氨酸所取代。构成了空间位阻，阻碍了TKI和EGFR-TK相应位点的竞争性结合，而ATP与酪氨酸激酶的结合则不受影响，使得激酶可以继续磷酸化[14]。Pao 等[15]回顾性分析了 155 例 NSCLC 患者治疗前肿瘤组织的EGFR，结果无一例携带 T790M 突变。Bell等人[16]在研究之后指出：T790M并非致癌性突变，其在肿瘤早期可能仅以微小克隆的形式存在于癌组织中，随着敏感克隆被TKI清除而被保留下来并进一步扩增，从而在肿瘤发展的继承阶段起重要作用。
3.2.1.2.非T790M突变
继发性耐药突变还有D761Y、L858R、L747S、E884K及G796A等，它们的总发生率小于5%。与T790M突变相比，其耐药可能性要小很多[17]。一项关于L858R、L747S和L858R、D761Y突变的体外临床试验显示，当吉非替尼或厄洛替尼达到1uM时，可以阻止这些突变，提示可以通过TKI的剂量转换来解决对TKI的耐药[18]。
3.2.2.c-Met 的扩增
2007年，Dana-Farber肿瘤研究中心报道了MET基因的扩增可能与TKI的获得性耐药有关。MET是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）受体，与肿瘤的扩增、侵袭和转移有关。MET基因扩增在未经治疗的NSCLC中很少见，但却存在于对TKI产生获得性耐药的部分病例中，提示其与另一种新的耐药机制有关[19]。Met 扩增通过EGFR3 介导的PI3K/蛋白激酶B 信号通路促进肿瘤细胞的增殖； 相对于未接受治疗的肺癌患者，伴有吉非替尼耐药的NSCLC 患者中Met 基因扩增会被更频繁的检出[20]。癌基因 Met 的扩增导致 20% 的EGFR 突變的 NSCLC 患者 TKI 耐药，且与 T790M 突变无关。Engelman 等[21]构建一株开始对吉非替尼敏感但暴露在递增浓度的吉非替尼6 个月后产生耐药克隆的细胞株，其耐药原因是 Met 基因的扩增。这提示未来临床设计的 EGFR-TKI 获得性耐药的抑制剂不仅要阻断 EGFR T790M 突变通路，还需要阻断 MET/ErbB3/PI3K 信号轴。
3.2.3.pten基因突变
张力蛋白同源的 10 号染色体缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homology deleted onchromosome ten，PTEN）是一个抑癌基因，其表达产物具有抑制肿瘤的作用，能够负向调控Akt，控制细胞的增殖与生存，在 PI3K / Akt 通路中具有重要的作用。早在 2005 年 Kokubo 等[22]即发现PTEN 低表达与吉非替尼获得性耐药相关。Endoh等[23]的一项研究也显示在吉非替尼治疗的患者中PTEN 高表达者生存期较长。而 EGFR 激活突变的患者若存在 PTEN 缺失，EGFR-TKI 治疗效果亦不佳[24]。Cappuzzo 等[25]在 93 例经吉非替尼治疗的NSCLC 患者中检测出 19 例存在 PTEN 缺失，但客观有效率、疾病进展时间及生存时间与 PTEN 阳性患者比较未显示有明显差异。研究显示，PTEN 可通过激活 Akt 导致 EGFR-TKI 耐药[26]。另外，最近有学者在 PC9 与 PC9 耐药细胞株中发现核转录因子EGR1 的低表达导致了 PTEN 表达降低[27]，也可能是引起 TKI 耐药的机制之一。NSCLC 患者中，PTEN 基因表达丧失（ < 5%） ，使得蛋白激酶 B 过度表达而抵抗凋亡，进而对 EGFR-TKI 产生耐药[28]. 3.2.4.PIK3CA基因突變
PIK3CA基因编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylino-sitol 3-kinases，PI3Ks）的催化亚基，由生长因子受体如EGFR、胰岛素受体等激活。活化的PI3Ks磷酸化4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2），生成第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）并激活Akt、GSK-3β、mTOR、FH等下游分子，调控细胞的成长、增殖、分化、黏附和迁移[29]。PIK3CA的突变多发生于9号外显子编码的螺旋区和20号外显子编码的激酶区[30]。研究表明PIK3CA基因突变可导致PI3K-Akt信号传导通路持续激活，致使肿瘤细胞对EGFR-TKI的敏感性降低，发生EGFR-TKI耐药[31]。
3.2.5.上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）
EMT 在肿瘤的发展与转移中起着重要的作用，代表上皮表型的上皮细胞钙黏蛋白（ E-cadherin） 减少，增强细胞运动及代表间质表型的蛋白如纤维连接蛋白、波形蛋白等增多是 EMT 的主要特点。肿瘤细胞需要经历 EMT 才具有扩散转移的能力。在肺腺癌中近半数的 TKI 获得性耐药与EMT 有关[32]。Thomson 等[33]的实验表明 EGFR-TKI 对肿瘤细胞基础水平 p-Akt 和 p-Erk 的抑制只在上皮表型的肿瘤细胞中起作用，而对间质表型的肿瘤细胞无效。Chung 等[34]报道的 1 例 NSCLC 患者经过近 1 年 EGFR-TKI 治疗后病情复发进展。在其转移肿瘤组织中，并未检测出 EGFR T790M 突变或 MET 扩增等已知的获得性耐药机制，却发现上皮细胞钙黏蛋白缺失，波形蛋白表达增加，即出现EMT。这些研究均提示 EMT 与 EGFR-TKI 获得性耐药有着密不可分的联系。
3.2.6.胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）
IGF-1R 是一种跨膜蛋白，在肿瘤转化及肿瘤细胞的增殖等方面起着重要作用。IGF-1R主要通过Ras/Raf /MAPK通路及PI3K/Akt通路起作用。抑制IGF-1R 能够下调PI3K/Akt通路的信号转导，使吉非替尼的药效增强[35]。抑制IGF-1R的活化或降低生存素的表达可增加NSCLC 细胞死亡。多数存在EGFR过表达的NSCLC组织伴有 IGF-1R的高表达，这些均提示IGF-1R与EGFR-TKI耐药有关，抑制 IGF-1R 的信号通路可能逆转或延迟 NSCLC 患者的获得性耐药。
3.2.7.其他学说
学者还提出了一些其他可能的耐药机制，如肝细胞生长因子过表达，双调蛋白升高，整合素β1上调， BIM 下调，10号染色体q23D的缺失、细胞的程序性死亡。AXL受体酪氨酸激酶的激活等。
4 结语
虽然分子靶向治疗对NSCLC的治疗具有重大的意义，但随之而来的耐药现象也不可避免地为靶向治疗带来了不小的麻烦，针对于一个靶点的研究往往不能取得很好的疗效， 本文所提及的耐药机制可能只是TKI耐药机制的冰山一角，可能发现某些耐药机制之间存在交互作用，甚至只是同一机制的不同阶段，亦或某种机制既参与原发耐药也参与获得性耐药.充分了解EGFR-TKI的耐药机制有助于寻找到能够预测疗效和指导治疗策略的分子标志物，使得NSCLC的靶向治疗效果更上一层楼。
References：
[1] Olaussen， K.A.， et al.， Telomeres and telomerase as targets for anticancer drug development. Crit Rev Oncol Hematol， 2006. 57（3）： p. 191-214.
[2] Cappuzzo， F.， et al.， Erlotinib as maintenance treatment in advanced non-small-cell lung cancer： a multicentre， randomised， placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol， 2010. 11（6）： p. 521-9.
[3] Lin， L. and T.G. Bivona， Mechanisms of Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitors and Novel Therapeutic Strategies to Overcome Resistance in NSCLC Patients. Chemother Res Pract， 2012. 2012： p. 817297.
[4] Epidermal Growth Factor Receptor Mutation （EGFR） Testing for Prediction of Response to EGFR-Targeting Tyrosine Kinase Inhibitor （TKI） Drugs in Patients with Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer： An Evidence-Based Analysis. Ont Health Technol Assess Ser， 2010. 10（24）： p. 1-48.
[5] Mitsudomi， T. and Y. Yatabe， Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Sci， 2007. 98（12）： p. 1817-24. [6] Greulich， H.， et al.， Oncogenic transformation by inhibitor-sensitive and -resistant EGFR mutants. PLoS Med， 2005. 2（11）： p. e313.
[7] Linardou， H.， et al.， Assessment of somatic k-RAS mutations as a mechanism associated with resistance to EGFR-targeted agents： a systematic review and meta-analysis of studies in advanced non-small-cell lung cancer and metastatic colorectal cancer. Lancet Oncol， 2008. 9（10）： p. 962-72.
[8] Luo， F.， et al.， Mutated K-ras（Asp12） promotes tumourigenesis in Apc（Min） mice more in the large than the small intestines， with synergistic effects between K-ras and Wnt pathways. Int J Exp Pathol， 2009. 90（5）： p. 558-74.
[9] Pao， W.， et al.， EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A， 2004. 101（36）： p. 13306-11.
[10] Tan， Y.H.， et al.， Detection of BRAF V600E mutation by pyrosequencing. Pathology， 2008. 40（3）： p. 295-8.
[11] Wang， S.E.， et al.， HER2 kinase domain mutation results in constitutive phosphorylation and activation of HER2 and EGFR and resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Cell， 2006. 10（1）： p. 25-38.
[12] Soda， M.， et al.， Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature， 2007. 448（7153）： p. 561-6.
[13] Li， Y.， et al.， Evaluation of EML4-ALK fusion proteins in non-small cell lung cancer using small molecule inhibitors. Neoplasia， 2011. 13（1）： p. 1-11.
[14] Kobayashi， S.， et al.， EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med， 2005. 352（8）： p. 786-92.
[15] Pao， W.， et al.， Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain. PLoS Med， 2005. 2（3）： p. e73.
[16] Bell， D.W.， et al.， Inherited susceptibility to lung cancer may be associated with the T790M drug resistance mutation in EGFR. Nat Genet， 2005. 37（12）： p. 1315-6.
[17] Tokumo， M.， et al.， Double mutation and gene copy number of EGFR in gefitinib refractory non-small-cell lung cancer. Lung Cancer， 2006. 53（1）： p. 117-21.
[18] Costa， D.B.， et al.， Differential responses to erlotinib in epidermal growth factor receptor （EGFR）-mutated lung cancers with acquired resistance to gefitinib carrying the L747S or T790M secondary mutations. J Clin Oncol， 2008. 26（7）： p. 1182-4； author reply 1184-6. [19] Smolen， G.A.， et al.， Amplification of MET may identify a subset of cancers with extreme sensitivity to the selective tyrosine kinase inhibitor PHA-665752. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006. 103（7）： p. 2316-21.
[20] Bean， J.， et al.， MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A， 2007. 104（52）： p. 20932-7.
[21] Engelman， J.A.， et al.， MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science， 2007. 316（5827）： p. 1039-43.
[22] Kokubo， Y.， et al.， Reduction of PTEN protein and loss of epidermal growth factor receptor gene mutation in lung cancer with natural resistance to gefitinib （IRESSA）. Br J Cancer， 2005. 92（9）： p. 1711-9.
[23] Endoh， H.， et al.， PTEN and PIK3CA expression is associated with prolonged survival after gefitinib treatment in EGFR-mutated lung cancer patients. J Thorac Oncol， 2006. 1（7）： p. 629-34.
[24] Vivanco， I.， et al.， The phosphatase and tensin homolog regulates epidermal growth factor receptor （EGFR） inhibitor response by targeting EGFR for degradation. Proc Natl Acad Sci U S A， 2010. 107（14）： p. 6459-64.
[25] Cappuzzo， F.， et al.， Insulin-like growth factor receptor 1 （IGFR-1） is significantly associated with longer survival in non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib. Ann Oncol， 2006. 17（7）： p. 1120-7.
[26] Sos， M.L.， et al.， PTEN loss contributes to erlotinib resistance in EGFR-mutant lung cancer by activation of Akt and EGFR. Cancer Res， 2009. 69（8）： p. 3256-61.
[27] Yamamoto， C.， et al.， Loss of PTEN expression by blocking nuclear translocation of EGR1 in gefitinib-resistant lung cancer cells harboring epidermal growth factor receptor-activating mutations. Cancer Res， 2010. 70（21）： p. 8715-25.
[28] Sharma， S.V.， et al.， A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell， 2010. 141（1）： p. 69-80.
[29] Vanhaesebroeck， B. and M.D. Waterfield， Signaling by distinct classes of phosphoinositide 3-kinases. Exp Cell Res， 1999. 253（1）： p. 239-54.
[30] Samuels， Y.， et al.， High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science， 2004. 304（5670）： p. 554.
[31] Samuels， Y.， et al.， Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells. Cancer Cell， 2005. 7（6）： p. 561-73.
[32] Uramoto， H.， et al.， Epithelial-mesenchymal transition in EGFR-TKI acquired resistant lung adenocarcinoma. Anticancer Res， 2010. 30（7）： p. 2513-7.
[33] Thomson， S.， et al.， Kinase switching in mesenchymal-like non-small cell lung cancer lines contributes to EGFR inhibitor resistance through pathway redundancy. Clin Exp Metastasis， 2008. 25（8）： p. 843-54.
[34] Chung， J.H.， et al.， Clinical and molecular evidences of epithelial to mesenchymal transition in acquired resistance to EGFR-TKIs. Lung Cancer， 2011. 73（2）： p. 176-82.
[35] Guix， M.， et al.， Acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors in cancer cells is mediated by loss of IGF-binding proteins. J Clin Invest， 2008. 118（7）： p. 2609-19.