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摘要[目的]筛选增殖DCPV的替代寄主。[方法]利用DCPV感染斜纹夜蛾筛选增殖DCPV的替代寄主，并用人工饲料开展规模饲养。[结果]斜纹夜蛾对DCPV敏感且Pl-DCPV产量高，DCPV对斜纹夜蛾的LC50为3.39×105 PIB/mL，利用斜纹夜蛾增殖的Pl-DCPV平均增殖量为2.01×108 PIB/头，Pl-DCPV对松毛虫的LC50为1.45×106 PIB/mL，略低于DCPV对松毛虫的LC50（3.86×105 PIB/mL）。[结论]综合分析，斜纹夜蛾可作为增殖DCPV的合适寄主。
关键词DCPV；斜纹夜蛾；替代寄主；筛选
中图分类号S767.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）21-0143-03
Study on Screening on Alternate Hosts of DCPV and Utilization Technology
WU Huaqing1，ZHAO Zhiping2，LIU Weihong1，LIU Fuyueqing1* et al
（1.Maoming Institute of Forestry Science，Maoming，Guangdong 525000； 2.Forestry Protection Station of Jianghua Forestry Bureau，Jianghua，Hunan 425500）
Abstract[Objective] The aim was to screen alternate hosts for DCPV proliferation. [Method] We infected Prodenia litur by DCPV to screen alternate hosts for DCPV proliferation，and carried out scale breeding by using artificial feed.[Result] Prodenia litur was sensitive to DCPV，and had high yield of PlDCPV.The LC50 of DCPV to Prodenia litur was 3.39×105 PIB/mL，and the average proliferation yield of PlDCPV by using Prodenia litur was 2.01×108 PIB per insect.The LC50 of PlDCPV to Dendrolimus was 1.45×106 PIB/mL，which was slightly lower than that of DCPV to Dendrolimus （3.86×105 PIB/mL）.[Conclusion] Comprehensive analysis，Prodenia litur could be used as suitable alternate hosts for DCPV proliferation.
Key wordsDCPV；Prodenia litur；Alternate hosts；Screening
利用马尾松毛虫生产、增殖松毛虫质型多角体病毒（Dendrolimus cytoplasmic polyhedrosis virus，以下简称DCPV）易受季节及虫源的限制，林间复制出来的DCPV，杂质偏多，影响质量和产量[1]，而采用人工饲料在室内饲养马尾松毛虫鲜见成功报道。可以认为，利用替代寄主昆虫来生产DCPV是目前获得大量DCPV的主要途径。1990年陈昌洁等[2]、1993年周小毛等[3]、1996年曾陈湘等[4]做了很多这方面的研究，但都未能应用于生产。笔者利用DCPV可以感染原宿主以外昆虫的特点，筛选了对DCPV敏感、虫体适中、易饲养、周期短、病毒增殖量高的斜纹夜蛾作为目前合适的替代寄主，并用人工饲料开展了规模饲养，旨在为实现DCPV的工厂化生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病毒材料。
病毒材料DCPV 50%甘油悬浮剂，含量为3×109 PIB/mL（PIB是多角体Po-lyhedral inclusion body的简写），由茂名市林业科学研究所林间采集后，经室内分离提纯获得，在-40 ℃低温冰箱中保存。
1.1.2供试虫源。樟蚕（Eriogyna pyretorus）、绿翅绢野螟（Diaphania angustalis）、鳳凰木夜蛾（Pericyma crulgeni）采自茂名市林业科学研究所科研基地；斜纹夜蛾（Prodenia litur）、菜粉蝶（Pieris rapae）、粘虫（Mythimna separata Walker）采自菜地；银纹夜蛾（Argyrogramma agnata）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hiibner）外购。
1.2方法
1.2.1DCPV替代寄主筛选。
挑选试验的鳞翅目幼虫均用所取食寄主作饲料喂养，在室内喂养至4龄。将DCPV稀释为1×106 PIB/mL浸润天然饲料表面，晾干后喂饲幼虫，喂饲病毒后，前3 d清除死伤的幼虫，第4天开始至第19天，每天检查1次，并逐条解剖死虫的中肠，第20天全部解剖死、活虫的中肠，统计感染病毒死亡率。
1.2.2DCPV对斜纹夜蛾的感染试验。
挑选4龄斜纹夜蛾200头，将DCPV按梯度稀释成不同浓度，使DCPV含量分别为1×104、1×105、1×106、1×107 PIB/mL，浸润块状人工饲料后，饲养至第4天开始检查，至第20天结束，逐条解剖死虫中肠，并最后解剖残存活虫中肠进行检查，确定是否有感染病毒。 1.2.3斜纹夜蛾人工饲养及Pl-DCPV产量测定。
斜纹夜蛾人工饲料配方由中山大学生命科学学院工程中心提供，室内继代扩繁技术参照涂叶苟等[5]的方法，感染DCPV后，提纯、测定Pl-DCPV（从感染DCPV的斜纹夜蛾中肠分离提取出来）的平均产量。
1.2.4Pl-DCPV感染试验。
1.2.4.1Pl-DCPV对斜纹夜蛾的回接感染试验。
用2×106 PIB/mL Pl-DCPV对4龄斜纹夜蛾进行感染，每天保持清理虫粪，第4天开始检查、解剖死虫中肠，至第20天全部解剖残存活虫中肠进行检查，确定是否感染病毒并计算感染率，安排3批次试验。
1.2.4.2Pl-DCPV对松毛虫的感染试验。
在林间挑选个体均匀的4龄期健康松毛虫200头，放到健康、濃密的松枝上，用80目尼龙网袋套紧，每笼20头，共10笼，待用。将稀释好的1×104、1×105、1×106、1×107 PIB/mL溶液Pl-DCPV，分别喷洒2笼（2个重复），要求均匀喷洒到笼内松针，保证松针湿透滴水，另外设置2笼喷洒清水作对照。每天保持清理虫粪，第4天开始检查、解剖死虫中肠，至第20天全部解剖残存活虫中肠进行检查，确定是否感染病毒并计算感染死亡率。
2结果与分析
2.1DCPV感染8种鳞翅目幼虫的结果
DCPV对这8种鳞翅目昆虫的感染可分为2类：一类是不受感染，如菜粉蝶、绿翅绢野螟、凤凰木夜蛾、粘虫和樟蚕；另一类是受感染，如银纹夜蛾、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾。
由表1可知，斜纹夜蛾对DCPV最敏感，感染达到77.6%，感染病毒致死的死亡率高达70.1%。斜纹夜蛾感染后虫体变色，解剖病虫观察，中肠发病明显，呈皱褶状，黄白色。
2.2DCPV对斜纹夜蛾的感染情况
2.2.1DCPV不同浓度对斜纹夜蛾的感染死亡率。用不同浓度的DCPV感染4龄斜纹夜蛾，显示不同程度的致病感染，感染死亡率随浓度的增大而提高（表2）。由表2可知，DCPV对斜纹夜蛾的感染死亡率最低为44.0%，最高为82.0%，说明DCPV对斜纹夜蛾感染致死毒力较强。
2.2.2浓度与感染死亡率的直线回归方程及相关系数。
依据表2的数据，将浓度转化为Log值，表述为x；将感染死亡率转化为机率值，表述为y，直线回归方程为y=3.346 8+0.364 9x，浓度对数与感染死亡率机率值相关系数rxy=0999，大于r0.05=0.950，表明相关程度达到显著水平，根据直线回归方程求得LC50=3.39×105 PIB/mL。
2.3斜纹夜蛾人工饲养及Pl-DCPV产量测定结果
利用人工饲料对斜纹夜蛾连续饲养了2年，每年饲养9～10代，每代平均历期32～38 d。Pl-DCPV的产量最低为1.57×108 PIB/头，最高为3.16×108 PIB/头，平均为2.01×108 PIB/头（表3）。按DCPV防治马尾松毛虫用量7.5×1010 PIB/hm2
计算，约375头斜纹夜蛾幼虫增殖产生的多角体就可防治1 hm2林地的松毛虫。
2.4Pl-DCPV的感染试验结果
2.4.1Pl-DCPV对斜纹夜蛾的回接感染试验结果。
Pl-DCPV对4龄斜纹夜蛾的回接感染率最低为14.5%，最高为30.6%，平均为25.1%，其中因感染PlDCPV而致死的分别有3、8和8头，感染死亡率分别为6.3%、16.3%和8.5%，平均9.9%（表4）。
2.4.2Pl-DCPV对马尾松毛虫的感染测定结果。
感染试验结果表明，Pl-DCPV对马尾松毛虫的毒力能够维持在较高水平（表5）。依据表5的数据，将浓度转化为Log值，表述为x；将感染死亡率转化为机率值，表述为y，直线回归方程为y=3.450 9+0.300 1x，浓度对数与感染死亡率机率值相关系数rxy=0.992，大于r0.05=0.950，表明相关程度达到显著水平。根据直线回归方程求得LC50=1.45×106 PIB/mL，略低于刘清浪等[6]研究得出的DCPV对松毛虫的毒力（LC50=3.86×105 PIB/mL）。
3结论与讨论
从DCPV对斜纹夜蛾的感染死亡率、浓度与感染死亡率的相关性、回归方程及致死中浓度来看，斜纹夜蛾对DCPV比较敏感；且斜纹夜蛾虫体适中，病毒增殖量大，可作为生产、增殖松毛虫质型多角体病毒的寄主。
P1-DCPV平均产量为2.01×108 PIB/头，与林间宿主马尾松毛虫增殖的多角体病毒回收量接近。Pl-DCPV对4龄松毛虫的LC50为1.45×106 PIB/mL，毒力稍低于DCPV对松毛虫的毒力，但感染死亡率高。同时发现P1-DCPV对斜纹夜蛾的回接感染效果差，说明DCPV经过斜纹夜蛾体内增殖后，对斜纹夜蛾的致病性已发生改变，具体致病机理需继续研究。
参考文献
[1]
曾陈湘，吴若光，何雪香.马尾松毛虫质型多角体病毒替代寄主筛选的研究[J].广东林业科技，1996，12（2）：22-27.
[2] 陈昌洁，王志贤，陶粮，等.利用棉铃虫为宿主增殖松毛虫质型多角体病毒[J].林业科学研究，1990，3（3）：263-265.
[3] 周小毛，戴冠群.马尾松毛虫质型多角体病毒替代宿主的研究[J].华南农业大学学报，1993，14（1）：114-121.
[4] 曾陈湘，吴若光，何雪香.用棉铃虫生产的马尾松毛虫质型多角体病毒对马尾松毛虫的毒力[J].广东林业科技，1996，12（1）：27-29.
[5] 涂业苟，曾吉华.斜纹夜蛾的人工饲养技术[J].江西农业学报，2010，22（1）：87-88.
[6] 刘清浪，吴若光，曾陈湘.应用马尾松毛虫质型多角体病毒防治松毛虫的研究[J].病毒学杂志，1986，1（4）：65-72.
45卷21期吴华青等DCPV替代寄主筛选及利用技术研究
关键词DCPV；斜纹夜蛾；替代寄主；筛选
中图分类号S767.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）21-0143-03
Study on Screening on Alternate Hosts of DCPV and Utilization Technology
WU Huaqing1，ZHAO Zhiping2，LIU Weihong1，LIU Fuyueqing1* et al
（1.Maoming Institute of Forestry Science，Maoming，Guangdong 525000； 2.Forestry Protection Station of Jianghua Forestry Bureau，Jianghua，Hunan 425500）
Abstract[Objective] The aim was to screen alternate hosts for DCPV proliferation. [Method] We infected Prodenia litur by DCPV to screen alternate hosts for DCPV proliferation，and carried out scale breeding by using artificial feed.[Result] Prodenia litur was sensitive to DCPV，and had high yield of PlDCPV.The LC50 of DCPV to Prodenia litur was 3.39×105 PIB/mL，and the average proliferation yield of PlDCPV by using Prodenia litur was 2.01×108 PIB per insect.The LC50 of PlDCPV to Dendrolimus was 1.45×106 PIB/mL，which was slightly lower than that of DCPV to Dendrolimus （3.86×105 PIB/mL）.[Conclusion] Comprehensive analysis，Prodenia litur could be used as suitable alternate hosts for DCPV proliferation.
Key wordsDCPV；Prodenia litur；Alternate hosts；Screening
利用马尾松毛虫生产、增殖松毛虫质型多角体病毒（Dendrolimus cytoplasmic polyhedrosis virus，以下简称DCPV）易受季节及虫源的限制，林间复制出来的DCPV，杂质偏多，影响质量和产量[1]，而采用人工饲料在室内饲养马尾松毛虫鲜见成功报道。可以认为，利用替代寄主昆虫来生产DCPV是目前获得大量DCPV的主要途径。1990年陈昌洁等[2]、1993年周小毛等[3]、1996年曾陈湘等[4]做了很多这方面的研究，但都未能应用于生产。笔者利用DCPV可以感染原宿主以外昆虫的特点，筛选了对DCPV敏感、虫体适中、易饲养、周期短、病毒增殖量高的斜纹夜蛾作为目前合适的替代寄主，并用人工饲料开展了规模饲养，旨在为实现DCPV的工厂化生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病毒材料。
病毒材料DCPV 50%甘油悬浮剂，含量为3×109 PIB/mL（PIB是多角体Po-lyhedral inclusion body的简写），由茂名市林业科学研究所林间采集后，经室内分离提纯获得，在-40 ℃低温冰箱中保存。
1.1.2供试虫源。樟蚕（Eriogyna pyretorus）、绿翅绢野螟（Diaphania angustalis）、鳳凰木夜蛾（Pericyma crulgeni）采自茂名市林业科学研究所科研基地；斜纹夜蛾（Prodenia litur）、菜粉蝶（Pieris rapae）、粘虫（Mythimna separata Walker）采自菜地；银纹夜蛾（Argyrogramma agnata）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hiibner）外购。
1.2方法
1.2.1DCPV替代寄主筛选。
挑选试验的鳞翅目幼虫均用所取食寄主作饲料喂养，在室内喂养至4龄。将DCPV稀释为1×106 PIB/mL浸润天然饲料表面，晾干后喂饲幼虫，喂饲病毒后，前3 d清除死伤的幼虫，第4天开始至第19天，每天检查1次，并逐条解剖死虫的中肠，第20天全部解剖死、活虫的中肠，统计感染病毒死亡率。
1.2.2DCPV对斜纹夜蛾的感染试验。
挑选4龄斜纹夜蛾200头，将DCPV按梯度稀释成不同浓度，使DCPV含量分别为1×104、1×105、1×106、1×107 PIB/mL，浸润块状人工饲料后，饲养至第4天开始检查，至第20天结束，逐条解剖死虫中肠，并最后解剖残存活虫中肠进行检查，确定是否有感染病毒。 1.2.3斜纹夜蛾人工饲养及Pl-DCPV产量测定。
斜纹夜蛾人工饲料配方由中山大学生命科学学院工程中心提供，室内继代扩繁技术参照涂叶苟等[5]的方法，感染DCPV后，提纯、测定Pl-DCPV（从感染DCPV的斜纹夜蛾中肠分离提取出来）的平均产量。
1.2.4Pl-DCPV感染试验。
1.2.4.1Pl-DCPV对斜纹夜蛾的回接感染试验。
用2×106 PIB/mL Pl-DCPV对4龄斜纹夜蛾进行感染，每天保持清理虫粪，第4天开始检查、解剖死虫中肠，至第20天全部解剖残存活虫中肠进行检查，确定是否感染病毒并计算感染率，安排3批次试验。
1.2.4.2Pl-DCPV对松毛虫的感染试验。
在林间挑选个体均匀的4龄期健康松毛虫200头，放到健康、濃密的松枝上，用80目尼龙网袋套紧，每笼20头，共10笼，待用。将稀释好的1×104、1×105、1×106、1×107 PIB/mL溶液Pl-DCPV，分别喷洒2笼（2个重复），要求均匀喷洒到笼内松针，保证松针湿透滴水，另外设置2笼喷洒清水作对照。每天保持清理虫粪，第4天开始检查、解剖死虫中肠，至第20天全部解剖残存活虫中肠进行检查，确定是否感染病毒并计算感染死亡率。
2结果与分析
2.1DCPV感染8种鳞翅目幼虫的结果
DCPV对这8种鳞翅目昆虫的感染可分为2类：一类是不受感染，如菜粉蝶、绿翅绢野螟、凤凰木夜蛾、粘虫和樟蚕；另一类是受感染，如银纹夜蛾、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾。
由表1可知，斜纹夜蛾对DCPV最敏感，感染达到77.6%，感染病毒致死的死亡率高达70.1%。斜纹夜蛾感染后虫体变色，解剖病虫观察，中肠发病明显，呈皱褶状，黄白色。
2.2DCPV对斜纹夜蛾的感染情况
2.2.1DCPV不同浓度对斜纹夜蛾的感染死亡率。用不同浓度的DCPV感染4龄斜纹夜蛾，显示不同程度的致病感染，感染死亡率随浓度的增大而提高（表2）。由表2可知，DCPV对斜纹夜蛾的感染死亡率最低为44.0%，最高为82.0%，说明DCPV对斜纹夜蛾感染致死毒力较强。
2.2.2浓度与感染死亡率的直线回归方程及相关系数。
依据表2的数据，将浓度转化为Log值，表述为x；将感染死亡率转化为机率值，表述为y，直线回归方程为y=3.346 8+0.364 9x，浓度对数与感染死亡率机率值相关系数rxy=0999，大于r0.05=0.950，表明相关程度达到显著水平，根据直线回归方程求得LC50=3.39×105 PIB/mL。
2.3斜纹夜蛾人工饲养及Pl-DCPV产量测定结果
利用人工饲料对斜纹夜蛾连续饲养了2年，每年饲养9～10代，每代平均历期32～38 d。Pl-DCPV的产量最低为1.57×108 PIB/头，最高为3.16×108 PIB/头，平均为2.01×108 PIB/头（表3）。按DCPV防治马尾松毛虫用量7.5×1010 PIB/hm2
计算，约375头斜纹夜蛾幼虫增殖产生的多角体就可防治1 hm2林地的松毛虫。
2.4Pl-DCPV的感染试验结果
2.4.1Pl-DCPV对斜纹夜蛾的回接感染试验结果。
Pl-DCPV对4龄斜纹夜蛾的回接感染率最低为14.5%，最高为30.6%，平均为25.1%，其中因感染PlDCPV而致死的分别有3、8和8头，感染死亡率分别为6.3%、16.3%和8.5%，平均9.9%（表4）。
2.4.2Pl-DCPV对马尾松毛虫的感染测定结果。
感染试验结果表明，Pl-DCPV对马尾松毛虫的毒力能够维持在较高水平（表5）。依据表5的数据，将浓度转化为Log值，表述为x；将感染死亡率转化为机率值，表述为y，直线回归方程为y=3.450 9+0.300 1x，浓度对数与感染死亡率机率值相关系数rxy=0.992，大于r0.05=0.950，表明相关程度达到显著水平。根据直线回归方程求得LC50=1.45×106 PIB/mL，略低于刘清浪等[6]研究得出的DCPV对松毛虫的毒力（LC50=3.86×105 PIB/mL）。
3结论与讨论
从DCPV对斜纹夜蛾的感染死亡率、浓度与感染死亡率的相关性、回归方程及致死中浓度来看，斜纹夜蛾对DCPV比较敏感；且斜纹夜蛾虫体适中，病毒增殖量大，可作为生产、增殖松毛虫质型多角体病毒的寄主。
P1-DCPV平均产量为2.01×108 PIB/头，与林间宿主马尾松毛虫增殖的多角体病毒回收量接近。Pl-DCPV对4龄松毛虫的LC50为1.45×106 PIB/mL，毒力稍低于DCPV对松毛虫的毒力，但感染死亡率高。同时发现P1-DCPV对斜纹夜蛾的回接感染效果差，说明DCPV经过斜纹夜蛾体内增殖后，对斜纹夜蛾的致病性已发生改变，具体致病机理需继续研究。
参考文献
[1]
曾陈湘，吴若光，何雪香.马尾松毛虫质型多角体病毒替代寄主筛选的研究[J].广东林业科技，1996，12（2）：22-27.
[2] 陈昌洁，王志贤，陶粮，等.利用棉铃虫为宿主增殖松毛虫质型多角体病毒[J].林业科学研究，1990，3（3）：263-265.
[3] 周小毛，戴冠群.马尾松毛虫质型多角体病毒替代宿主的研究[J].华南农业大学学报，1993，14（1）：114-121.
[4] 曾陈湘，吴若光，何雪香.用棉铃虫生产的马尾松毛虫质型多角体病毒对马尾松毛虫的毒力[J].广东林业科技，1996，12（1）：27-29.
[5] 涂业苟，曾吉华.斜纹夜蛾的人工饲养技术[J].江西农业学报，2010，22（1）：87-88.
[6] 刘清浪，吴若光，曾陈湘.应用马尾松毛虫质型多角体病毒防治松毛虫的研究[J].病毒学杂志，1986，1（4）：65-72.
45卷21期吴华青等DCPV替代寄主筛选及利用技术研究