【摘 要】
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本研究旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法及细胞水平上的PCR扩增测序筛选出靶向食蟹猴NTCP基因具有高敲除活性的gRNA。首先通过比对食蟹猴与人类NTCP氨基酸序列,选择差异位点,即
【机 构】
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河北科技师范学院动物科技学院,军事医学科学院放射与辐射医学研究所
【基金项目】
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国家“重大新药创制”科技重大专项：生物类似药非临床与临床研究的药代动力学、药效动力学以及免疫原性评价的关键技术（2015ZX09501008-006）
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本研究旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法及细胞水平上的PCR扩增测序筛选出靶向食蟹猴NTCP基因具有高敲除活性的gRNA。首先通过比对食蟹猴与人类NTCP氨基酸序列,选择差异位点,即第84—87位和第157—165位氨基酸作为基因靶点序列区;利用gRNA软件设计针对上述基因靶点序列的gRNA,每个靶点设计3~4条候选gRNA序列;然后利用gRNA体外检测试剂盒,筛选出靶向NTCP基因的体外敲除活性较高的两条gRNA序列:gRNA1.2和gRNA2.1。将gRNA1.2和gRNA2.1分别插入pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP载体中,转染食蟹猴原代肝细胞。提取转染后细胞基因组DNA,通过PCR扩增NTCP基因并将其克隆到T载体中进行测序分析。结果表明,gRNA1.2和gRNA2.1均可使NTCP基因产生移码突变,但gRNA2.1比gRNA1.2具有更高的敲除活性。本研究为下一步编辑食蟹猴NTCP基因及研究其在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的功能奠定了基础。
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