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摘 要 目的：研究SMCC在不同溶液中的降解情况。方法：将SMCC分别用ACN、DMA和DMSO等有机溶剂溶解并制成一定浓度（约3 mg/ml）的储备液，再用不同的缓冲液稀释10倍并混匀作为供试品溶液，采用高效液相色谱法观察主峰的降解情况。结果：对于SMCC的水解，碱性环境以及DMSO或DMA的存在有显著的促进作用，而酸性环境以及ACN的存在则有一定的抑制作用。结论：交联反应可在弱碱环境下以DMA/DMSO作溶剂，而色谱分析則可在酸性环境下以ACN作溶剂。
关键词 SMCC ADC 水解 HPLC
中图分类号：TQ464.7 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）19-0073-05
A study on degradation behavior of SMCC in different solutions
YAO Junliang*
（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）
ABSTRACT Objective： To investigate the degradation phenomenon of SMCC in different solutions. Methods： Stock solutions of SMCC were prepared in ACN， DMA and DMSO， respectively， to give a final concentration of 3 mg/ml. Working solutions were prepared by 10-fold dilution of stock solutions in several buffer solutions. The degradation of SMCC was monitored by an HPLC method. Results： The hydrolysis of SMCC could be accelerated with the introduction of basic buffer solution or DMA/DMSO， while it could be hindered with the introduction of acidic solution or ACN. Conclusion： Cross-linking reaction could be performed in weakly alkaline condition by using solvent of DMA/DMSO， while HPLC analysis could be carried out in acidic condition by using solvent of ACN.
KEY WORDS SMCC； ADC； hydrolysis； HPLC
抗体-药物偶联剂（antibody-drug conjugates， ADC），是由单克隆抗体和化学药物分子偶联而成的新型生物制剂[1-3]，是近年来发展迅速的一类肿瘤靶向治疗药物[4-5]。ADC通常由一个抗体（antibody），一个弹头药物（cytotoxic drug）和一个活性连接子（linker）组成[6]（图1）。其中，连接子通常需要具备以下特性：一是进入目标细胞前能够保证ADC在血浆中结构稳定；二是进入细胞后能够使药物顺利释放[7-8]。按照细胞中的药物释放行为，可将连接子分为两大类：可剪切型（Cleavable Linkers）和非剪切型（Non-cleavable Linkers）[9]。前者通过细胞内化学环境的变化或酶解作用使其与药物间的化学键断裂，从而释放完整的药物分子；而后者则是通过蛋白酶的水解作用将抗体部分降解，剩余的药物分子上通常依然保留着连接子和部分氨基酸残基[7]。目前仅有的两个批准上市的ADC药物，Adcetris[10]和Kadcyla[11]，分别采用了可剪切型连接子vc（valine-citrulline）和非剪切型连接子琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺）环已烷-1-1羟酸酯（succinimidyl-4-（N-maleimidomethyl） cyclohexane-1-carboxylate，SMCC）。本文将以SMCC为研究对象进行相关的试验和讨论。
Kadcyla（T-DM1）原研药厂Genentech曾对多个连接子进行了筛选，最终SMCC脱颖而出，这也说明其在T-DM1中有独到之处[12]。如图2所示，SMCC主要由三部分组成：右侧为NHS（N-琥珀酰亚胺）活性酯，负责与抗体分子中的伯胺生成酰胺键结合；左侧为马来酰亚胺基，负责与药物分子中的巯基发生特异性交联结合；中间为环己烷，可通过位阻效应降低其水解作用[7]。虽然其结构特征和交联机理已得到了广泛的研究[13-14]，但有关其交联反应化学环境以及色谱分析条件的研究却鲜见报端。因此，本文通过分析化学的手段初步模拟探讨了SMCC在各种介质中的稳定性，以期对交联工艺的筛选和优化以及分析和检测方法的开发提供一定的实验基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
SMCC（博瑞生物医药（苏州）股份有限公司，批号：20150812）；乙腈（Fisher，HPLC级，批号：158031，ACN）；磷酸（Sigma，HPLC级，批号：STBF-7157V）；DMA（Sigma，99.8%，批号：SHBG0465V）；DMSO（Merck，HPLC级，批号：K46802100530）；其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，纯度为AR或GR；水为自制高纯水。 1.2 实验仪器
XS105DU电子天平（梅特勒），PB-10酸度计（赛多利斯），高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity）。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（规格：4.6 mm×250 mm，5 mm），流动相A为0.05%的磷酸水溶液、B为乙腈，洗脱梯度见表1。柱温30 ℃，流速1.0 ml/min，
1.3.2 样品制备与测定方法
1）SMCC母液 取SMCC样品约60 mg，精密称定，置于20 ml容量瓶中，用乙腈/DMA/DMSO（视考察条件而定）溶解并稀释至刻度，混匀后备用。
3）测定方法 用移液管准确移取SMCC母液适量，再用PBS缓冲液稀释10倍（SMCC浓度为0.3 mg/ml），混匀后迅速进样，记录色谱图，每隔0.5 h进样1次，观察SMCC随着时间的变化情况。
4）计算和作图 将所得图谱中色谱峰的峰面积与0 h时主峰的峰面积进行对比，以所得比值对时间（h）作图，观察主峰/杂峰的相对含量随时间的变化趋势。
2 结果
SMCC在常温下不吸潮，不溶于水、甲醇和乙醇，易溶于乙腈，DMSO，DMA等有机溶剂。SMCC和抗体交联时需要在水溶液中进行，所以先要用有机溶剂制成母液，待反应时再加入反应液。本研究采用若干有机溶剂联合PBS水溶液，模拟考察其在交联环境中的降解情况。
2.1 SMCC在DMA-H2O/PBS中的变化
将DMA配制的SMCC母液分别用缓冲液A、B、C和H2O稀释10倍后，在样品瓶中连续进样，记录SMCC主峰面积的变化情况，所得实验结果如图3所示（图中缓冲液A、B、C和H2O中情况分别用■、●、△和▼表示）。由图3可知，SMCC在四种溶液体系里都发生了明显的降解，而程度却明显不同：在DMAbuffer A和DMA-H2O中降解较缓慢，而在DMA-buffer B和DMA-buffer C中降解极为显著。上述结果初步说明SMCC对碱性PBS环境极其敏感，中性次之，酸性最惰。同时，Buffer B和C的情况说明，钾和钠离子类型对其降解影响甚微。
2.2 SMCC在ACN/DMX/H2O中的变化
为了进一步阐明SMCC的降解机制，我们也研究了其在不含PBS缓冲液时主峰的变化。如图4所示，SMCC在ACN-DMA和ACN-H2O体系中稳定无降解，而在DMA-H2O和DMSO-H2O均出现了明显降解。说明在无水参与时，SMCC在上述有机溶剂中至少6 h内稳定；有水参与时，ACN条件下依然稳定，而DMA和DMSO条件下不稳定。因此可以推断ACN能够抑制SMCC在水中降解，而DMA和DMSO则促进其降解，说明SMCC在水中的降解跟母液溶剂有很大的关系。
2.3 SMCC在ACN-PBS中的变化
在得知ACN可能会抑制SMCC在纯水中的降解之后，我们又对酸性和碱性PBS缓冲液中的情况进行了对比研究（图5）。从图5可以看出，SMCC在ACN-buffer A中基本无降解，在ACN-buffer B和ACN-buffer C中降解剧烈。可见ACN的存在的确可以抑制SMCC的降解，只不过在酸性至中性条件下显著，碱性条件下不明显。
2.4 SMCC在ACN-NH4 PBS中的变化
对于PBS缓冲盐的选择，除了上述實验用到的钾盐和钠盐之外，我们也考察了铵盐（Buffer D和E）对SMCC降解的影响。图6中的（●）和（▲）分别表示ACN-buffer D和ACN-buffer E中SMCC主峰的变化趋势。与ACN-H2O（■）中相比，SMCC在pH 4.0的ACNNH4 PBS体系中出现了较为明显的降解，而当磷酸铵盐的pH为7.0时，SMCC发生了剧烈降解，在1 h内主峰甚至完全消失。这一结果表明，铵盐对SMCC稳定性的影响要远大于钾盐和钠盐，因此可以推断铵离子或游离氨可能直接参与了其降解反应。
2.5 SMCC降解杂质统计
上述实验中我们主要考察了SMCC在多种溶液环境中主峰的变化趋势，在此本文将进一步对其降解杂质进行简单的研究。表2中列出了各降解实验中产生杂质的相对保留时间，结果表明SMCC的降解杂质主要有4种，相对保留时间分别为0.16，0.42，0.60和0.67，我们依次命名为Imp-1，Imp-2，Imp-3和Imp-4。为了更直观地展示降解情况，我们将各条件下反应2 h后SMCC主峰和杂质峰的含量作柱形图对比（图7）。图中显示，除了DMA-ACN、ACN-H2O和ACN-buffer A之外，SMCC在其他条件下均有降解，只是杂质产生情况各有不同，说明其在不同溶液中的降解机理可能有所差异。
3 討论
如前所述，我们通过高效液相色谱法分别研究了SMCC在多种溶液环境中的降解情况。总体来看，其降解反应只在有水相存在时才会发生，因此可以推断该反应属于水解反应，这一点也可以通过其结构特点加以印证。SMCC分子中两侧的NHS酯和马来酰亚胺都可以在一定条件下发生水解，从而阻碍交联进程，因此在与抗体和药物交联时要尽量控制SMCC的水解程度。
实验中，我们引入了不同的有机溶剂（DMA，DMSO，can）、水和缓冲溶液（buffer A-F），所有最终的反应液中均含90%的水相和10%的有机相。结果表明SMCC的水解不仅与水相有关，也和有机相密切相关，当有机相为DMA/DMSO，水相为碱性时，水解更容易发生。推测可能是因为DMA/DMSO在NHS酯水解过程中起催化剂的作用，而碱性则利于水解反应平衡的正向移动。
不同的反应产生不同的杂质，因此可以根据杂质类型逆推水解机制。配合表2和图7，我们可以大致将反应类型分为以下几类：①只生成Imp-1和Imp-4的反应，推测可能是NHS酯的水解，因为其活性较马来酰亚胺强，在弱酸性至中性时就可以发生；②同时生成Imp-1、Imp-3和Imp-4的反应，推测可能是NHS酯和马来酰亚胺同步水解的反应，因为在碱性较强时出现，强碱环境突破马来酰亚胺的稳定临界点，其水解动力学曲线非线性亦侧面折射出可能为两步反应；③出现杂质Imp-2的反应，可能是NH3参与的酰胺化反应，因为在pH 7.0的铵溶液中含量极高，而在其他条件下均未出现。由于本研究旨在探讨适宜的检测和交联环境，并非研究详细的降解机理，因此未对各杂质做进一步的鉴定研究。
综上所述，对于交联过程来说，一方面应避免强碱和铵盐环境，以防水解过快而无法交联；另一方面也不宜在酸性条件进行，使得SMCC活性低交联困难。同时有机助溶剂则宜采用DMA和DMSO等既不易使蛋白变性又能高效溶解SMCC的溶剂。对于色谱分析来说，稀释剂宜采用ACN等溶解度高且有利于SMCC结构稳定的溶剂，流动相则宜控制在酸性，不可用铵盐。此外，我们在实验过程中还发现，SMCC在反应时需注意其浓度和环境温度，在温度较低浓度较高时容易产生絮状沉淀，大大影响反应进程。
参考文献
[1] Papachristos A， Pippa N， Demetzos C， et al. Antibody-drug conjugates： a mini-review. The synopsis of two approved medicines[J]. Drug Deliv， 2016， 23（5）： 1662-1666.
[2] Gebleux R， Casi G. Antibody-drug conjugates： current status and future perspectives[J]. Pharmacol Ther， 2016， 167： 48-59.
[3] Bakhtiar R. Antibody drug conjugates[J]. Biotechnol Lett， 2016， 38（10）： 1655-1664.
[4] Polakis P. Antibody drug conjugates for cancer therapy[J]. Pharmacol Rev， 2016， 68（1）： 3-19.
[5] Thomas A， Teicher BA， Hassan R. Antibody–drug conjugates for cancer therapy[J]. Lancet Oncol， 2016， 17（6）： e254-e262.
[6] Ducry L， Stump B. Antibody-drug conjugates： linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies[J]. Bioconjug Chem， 2010， 21（1）： 5-13.
[7] McCombs JR， Owen SC. Antibody drug conjugates： design and selection of linker， payload and conjugation chemistry[J]. AAPS J， 2015， 17（2）： 339-351.
[8] Jain N， Smith SW， Ghone S， et al. Current ADC linker chemistry[J]. Pharm Res， 2015， 32（11）： 3526-3540.
[9] Nolting B. Linker technologies for antibody-drug conjugates[J]. Methods Mol Biol， 2013， 1045： 71-100.
[10] Katz J， Janik JE， Younes A. Brentuximab vedotin （SGN-35）[J]. Clin Cancer Res， 2011， 17（20）： 6428-6436.
[11] Verma S， Miles D， Gianni L， et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer[J]. N Engl J Med， 2012， 367（19）： 1783-1791.
[12] Lewis Phillips GD， Li G， Dugger DL， et al. Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1， an antibodycytotoxic drug conjugate[J]. Cancer Res， 2008， 68（22）： 9280-9290.
[13] Mattson G， Conklin E， Desai S， et al. A practical approach to crosslinking[J]. Mol Biol Rep， 1993， 17（3）： 167-183.
[14] Partis MD， Griffiths DG， Roberts GC， et al. Crosslinking of protein by ω-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters[J]. J Protein Chem， 1983， 2（3）： 263-277.
关键词 SMCC ADC 水解 HPLC
中图分类号：TQ464.7 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）19-0073-05
A study on degradation behavior of SMCC in different solutions
YAO Junliang*
（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）
ABSTRACT Objective： To investigate the degradation phenomenon of SMCC in different solutions. Methods： Stock solutions of SMCC were prepared in ACN， DMA and DMSO， respectively， to give a final concentration of 3 mg/ml. Working solutions were prepared by 10-fold dilution of stock solutions in several buffer solutions. The degradation of SMCC was monitored by an HPLC method. Results： The hydrolysis of SMCC could be accelerated with the introduction of basic buffer solution or DMA/DMSO， while it could be hindered with the introduction of acidic solution or ACN. Conclusion： Cross-linking reaction could be performed in weakly alkaline condition by using solvent of DMA/DMSO， while HPLC analysis could be carried out in acidic condition by using solvent of ACN.
KEY WORDS SMCC； ADC； hydrolysis； HPLC
抗体-药物偶联剂（antibody-drug conjugates， ADC），是由单克隆抗体和化学药物分子偶联而成的新型生物制剂[1-3]，是近年来发展迅速的一类肿瘤靶向治疗药物[4-5]。ADC通常由一个抗体（antibody），一个弹头药物（cytotoxic drug）和一个活性连接子（linker）组成[6]（图1）。其中，连接子通常需要具备以下特性：一是进入目标细胞前能够保证ADC在血浆中结构稳定；二是进入细胞后能够使药物顺利释放[7-8]。按照细胞中的药物释放行为，可将连接子分为两大类：可剪切型（Cleavable Linkers）和非剪切型（Non-cleavable Linkers）[9]。前者通过细胞内化学环境的变化或酶解作用使其与药物间的化学键断裂，从而释放完整的药物分子；而后者则是通过蛋白酶的水解作用将抗体部分降解，剩余的药物分子上通常依然保留着连接子和部分氨基酸残基[7]。目前仅有的两个批准上市的ADC药物，Adcetris[10]和Kadcyla[11]，分别采用了可剪切型连接子vc（valine-citrulline）和非剪切型连接子琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺）环已烷-1-1羟酸酯（succinimidyl-4-（N-maleimidomethyl） cyclohexane-1-carboxylate，SMCC）。本文将以SMCC为研究对象进行相关的试验和讨论。
Kadcyla（T-DM1）原研药厂Genentech曾对多个连接子进行了筛选，最终SMCC脱颖而出，这也说明其在T-DM1中有独到之处[12]。如图2所示，SMCC主要由三部分组成：右侧为NHS（N-琥珀酰亚胺）活性酯，负责与抗体分子中的伯胺生成酰胺键结合；左侧为马来酰亚胺基，负责与药物分子中的巯基发生特异性交联结合；中间为环己烷，可通过位阻效应降低其水解作用[7]。虽然其结构特征和交联机理已得到了广泛的研究[13-14]，但有关其交联反应化学环境以及色谱分析条件的研究却鲜见报端。因此，本文通过分析化学的手段初步模拟探讨了SMCC在各种介质中的稳定性，以期对交联工艺的筛选和优化以及分析和检测方法的开发提供一定的实验基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
SMCC（博瑞生物医药（苏州）股份有限公司，批号：20150812）；乙腈（Fisher，HPLC级，批号：158031，ACN）；磷酸（Sigma，HPLC级，批号：STBF-7157V）；DMA（Sigma，99.8%，批号：SHBG0465V）；DMSO（Merck，HPLC级，批号：K46802100530）；其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，纯度为AR或GR；水为自制高纯水。 1.2 实验仪器
XS105DU电子天平（梅特勒），PB-10酸度计（赛多利斯），高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity）。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（规格：4.6 mm×250 mm，5 mm），流动相A为0.05%的磷酸水溶液、B为乙腈，洗脱梯度见表1。柱温30 ℃，流速1.0 ml/min，
1.3.2 样品制备与测定方法
1）SMCC母液 取SMCC样品约60 mg，精密称定，置于20 ml容量瓶中，用乙腈/DMA/DMSO（视考察条件而定）溶解并稀释至刻度，混匀后备用。
3）测定方法 用移液管准确移取SMCC母液适量，再用PBS缓冲液稀释10倍（SMCC浓度为0.3 mg/ml），混匀后迅速进样，记录色谱图，每隔0.5 h进样1次，观察SMCC随着时间的变化情况。
4）计算和作图 将所得图谱中色谱峰的峰面积与0 h时主峰的峰面积进行对比，以所得比值对时间（h）作图，观察主峰/杂峰的相对含量随时间的变化趋势。
2 结果
SMCC在常温下不吸潮，不溶于水、甲醇和乙醇，易溶于乙腈，DMSO，DMA等有机溶剂。SMCC和抗体交联时需要在水溶液中进行，所以先要用有机溶剂制成母液，待反应时再加入反应液。本研究采用若干有机溶剂联合PBS水溶液，模拟考察其在交联环境中的降解情况。
2.1 SMCC在DMA-H2O/PBS中的变化
将DMA配制的SMCC母液分别用缓冲液A、B、C和H2O稀释10倍后，在样品瓶中连续进样，记录SMCC主峰面积的变化情况，所得实验结果如图3所示（图中缓冲液A、B、C和H2O中情况分别用■、●、△和▼表示）。由图3可知，SMCC在四种溶液体系里都发生了明显的降解，而程度却明显不同：在DMAbuffer A和DMA-H2O中降解较缓慢，而在DMA-buffer B和DMA-buffer C中降解极为显著。上述结果初步说明SMCC对碱性PBS环境极其敏感，中性次之，酸性最惰。同时，Buffer B和C的情况说明，钾和钠离子类型对其降解影响甚微。
2.2 SMCC在ACN/DMX/H2O中的变化
为了进一步阐明SMCC的降解机制，我们也研究了其在不含PBS缓冲液时主峰的变化。如图4所示，SMCC在ACN-DMA和ACN-H2O体系中稳定无降解，而在DMA-H2O和DMSO-H2O均出现了明显降解。说明在无水参与时，SMCC在上述有机溶剂中至少6 h内稳定；有水参与时，ACN条件下依然稳定，而DMA和DMSO条件下不稳定。因此可以推断ACN能够抑制SMCC在水中降解，而DMA和DMSO则促进其降解，说明SMCC在水中的降解跟母液溶剂有很大的关系。
2.3 SMCC在ACN-PBS中的变化
在得知ACN可能会抑制SMCC在纯水中的降解之后，我们又对酸性和碱性PBS缓冲液中的情况进行了对比研究（图5）。从图5可以看出，SMCC在ACN-buffer A中基本无降解，在ACN-buffer B和ACN-buffer C中降解剧烈。可见ACN的存在的确可以抑制SMCC的降解，只不过在酸性至中性条件下显著，碱性条件下不明显。
2.4 SMCC在ACN-NH4 PBS中的变化
对于PBS缓冲盐的选择，除了上述實验用到的钾盐和钠盐之外，我们也考察了铵盐（Buffer D和E）对SMCC降解的影响。图6中的（●）和（▲）分别表示ACN-buffer D和ACN-buffer E中SMCC主峰的变化趋势。与ACN-H2O（■）中相比，SMCC在pH 4.0的ACNNH4 PBS体系中出现了较为明显的降解，而当磷酸铵盐的pH为7.0时，SMCC发生了剧烈降解，在1 h内主峰甚至完全消失。这一结果表明，铵盐对SMCC稳定性的影响要远大于钾盐和钠盐，因此可以推断铵离子或游离氨可能直接参与了其降解反应。
2.5 SMCC降解杂质统计
上述实验中我们主要考察了SMCC在多种溶液环境中主峰的变化趋势，在此本文将进一步对其降解杂质进行简单的研究。表2中列出了各降解实验中产生杂质的相对保留时间，结果表明SMCC的降解杂质主要有4种，相对保留时间分别为0.16，0.42，0.60和0.67，我们依次命名为Imp-1，Imp-2，Imp-3和Imp-4。为了更直观地展示降解情况，我们将各条件下反应2 h后SMCC主峰和杂质峰的含量作柱形图对比（图7）。图中显示，除了DMA-ACN、ACN-H2O和ACN-buffer A之外，SMCC在其他条件下均有降解，只是杂质产生情况各有不同，说明其在不同溶液中的降解机理可能有所差异。
3 討论
如前所述，我们通过高效液相色谱法分别研究了SMCC在多种溶液环境中的降解情况。总体来看，其降解反应只在有水相存在时才会发生，因此可以推断该反应属于水解反应，这一点也可以通过其结构特点加以印证。SMCC分子中两侧的NHS酯和马来酰亚胺都可以在一定条件下发生水解，从而阻碍交联进程，因此在与抗体和药物交联时要尽量控制SMCC的水解程度。
实验中，我们引入了不同的有机溶剂（DMA，DMSO，can）、水和缓冲溶液（buffer A-F），所有最终的反应液中均含90%的水相和10%的有机相。结果表明SMCC的水解不仅与水相有关，也和有机相密切相关，当有机相为DMA/DMSO，水相为碱性时，水解更容易发生。推测可能是因为DMA/DMSO在NHS酯水解过程中起催化剂的作用，而碱性则利于水解反应平衡的正向移动。
不同的反应产生不同的杂质，因此可以根据杂质类型逆推水解机制。配合表2和图7，我们可以大致将反应类型分为以下几类：①只生成Imp-1和Imp-4的反应，推测可能是NHS酯的水解，因为其活性较马来酰亚胺强，在弱酸性至中性时就可以发生；②同时生成Imp-1、Imp-3和Imp-4的反应，推测可能是NHS酯和马来酰亚胺同步水解的反应，因为在碱性较强时出现，强碱环境突破马来酰亚胺的稳定临界点，其水解动力学曲线非线性亦侧面折射出可能为两步反应；③出现杂质Imp-2的反应，可能是NH3参与的酰胺化反应，因为在pH 7.0的铵溶液中含量极高，而在其他条件下均未出现。由于本研究旨在探讨适宜的检测和交联环境，并非研究详细的降解机理，因此未对各杂质做进一步的鉴定研究。
综上所述，对于交联过程来说，一方面应避免强碱和铵盐环境，以防水解过快而无法交联；另一方面也不宜在酸性条件进行，使得SMCC活性低交联困难。同时有机助溶剂则宜采用DMA和DMSO等既不易使蛋白变性又能高效溶解SMCC的溶剂。对于色谱分析来说，稀释剂宜采用ACN等溶解度高且有利于SMCC结构稳定的溶剂，流动相则宜控制在酸性，不可用铵盐。此外，我们在实验过程中还发现，SMCC在反应时需注意其浓度和环境温度，在温度较低浓度较高时容易产生絮状沉淀，大大影响反应进程。
参考文献
[1] Papachristos A， Pippa N， Demetzos C， et al. Antibody-drug conjugates： a mini-review. The synopsis of two approved medicines[J]. Drug Deliv， 2016， 23（5）： 1662-1666.
[2] Gebleux R， Casi G. Antibody-drug conjugates： current status and future perspectives[J]. Pharmacol Ther， 2016， 167： 48-59.
[3] Bakhtiar R. Antibody drug conjugates[J]. Biotechnol Lett， 2016， 38（10）： 1655-1664.
[4] Polakis P. Antibody drug conjugates for cancer therapy[J]. Pharmacol Rev， 2016， 68（1）： 3-19.
[5] Thomas A， Teicher BA， Hassan R. Antibody–drug conjugates for cancer therapy[J]. Lancet Oncol， 2016， 17（6）： e254-e262.
[6] Ducry L， Stump B. Antibody-drug conjugates： linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies[J]. Bioconjug Chem， 2010， 21（1）： 5-13.
[7] McCombs JR， Owen SC. Antibody drug conjugates： design and selection of linker， payload and conjugation chemistry[J]. AAPS J， 2015， 17（2）： 339-351.
[8] Jain N， Smith SW， Ghone S， et al. Current ADC linker chemistry[J]. Pharm Res， 2015， 32（11）： 3526-3540.
[9] Nolting B. Linker technologies for antibody-drug conjugates[J]. Methods Mol Biol， 2013， 1045： 71-100.
[10] Katz J， Janik JE， Younes A. Brentuximab vedotin （SGN-35）[J]. Clin Cancer Res， 2011， 17（20）： 6428-6436.
[11] Verma S， Miles D， Gianni L， et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer[J]. N Engl J Med， 2012， 367（19）： 1783-1791.
[12] Lewis Phillips GD， Li G， Dugger DL， et al. Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1， an antibodycytotoxic drug conjugate[J]. Cancer Res， 2008， 68（22）： 9280-9290.
[13] Mattson G， Conklin E， Desai S， et al. A practical approach to crosslinking[J]. Mol Biol Rep， 1993， 17（3）： 167-183.
[14] Partis MD， Griffiths DG， Roberts GC， et al. Crosslinking of protein by ω-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters[J]. J Protein Chem， 1983， 2（3）： 263-277.