关键词：盐肤木提取物;没食子酸;苔黑酚葡萄糖苷;没食子酸乙酯;五没食子酰葡萄糖;高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）01-0001-0072-04
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.01.017
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盐肤木属Rhus的落叶灌木或小乔木，全世界约有250种，我国有6种、3个变种，其中药用的主要为盐肤木R. chinensis[1-3]，其分布广泛，资源丰富，在中国、朝鲜、日本、马来西亚及其他东南亚国均有分布[4]。盐肤木性微寒，味酸咸，有活血化瘀、行气止痛功效[5]。目前临床多用盐肤木根的水煎剂，治疗冠心病、心绞痛、胸闷、憋气、肺脓疡、小儿久泻等。本课题组前期“基于斑马鱼心血管损伤保护（冠心病）模型筛选盐肤木有效部位”研究表明，盐肤木治疗冠心病的有效部位为总酚酸[6]。药理研究显示，没食子酸可通过内皮细胞依赖和非依赖方式舒张胸主动脉血管，从而缓解由高血压引起的冠心病[7];苔黑酚葡萄糖苷有扩张冠状动脉、增加心排量等作用[8];没食子酸乙酯对冠状动脉具有选择性扩张作用[9];五没食子酰葡萄糖能够抗血管生成[10]。本研究采用HPLC对盐肤木提取物中的没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖4种成分进行同时测定，为盐肤木质量控制水平的提高提供方法学依据。
1 仪器与试药
Ultimate-3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司），UV-1800紫外分光光度计（日本岛津），KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），XS105型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。
没食子酸对照品（批号Y19M8C36143，HPLC纯度≥98%）、苔黑酚葡萄糖苷对照品（批号P15F7F9628，HPLC纯度≥98%）、没食子酸乙酯对照品（批号KJ1906CA14，HPLC纯度≥98%）、五没食子酰葡萄糖对照品（批号P29F7F10218，HPLC≥99%），上海源叶生物科技有限公司;盐肤木（批号20180101），漳州市聚善堂药业有限公司;甲醇（色谱纯），德国默克公司;甲酸（批号A1309012，色谱纯），上海阿拉丁试剂有限公司;水为超纯水。
称取盐肤木适量，按料液比1∶8加入70%乙醇，浸润30 min，加热回流提取2次，每次2 h，合并提取液，浓缩，离心，过SP825L大孔树脂，用适量浓度的酸水进行除杂，50%乙醇进行洗脱，得到纯化的药液，浓缩，冷冻干燥，得到盐肤木提取物，备用。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取没食子酸对照品8.03 mg于25 mL容量瓶、苔黑酚葡萄糖苷对照品12.16 mg于25 mL容量瓶、没食子酸乙酯对照品12.52 mg于25 mL容量瓶、五没食子酰葡萄糖对照品5.09 mg于10 mL容量瓶，加50%甲醇定容至刻度，得到对照品贮备液。精密吸取上述没食子酸、没食子酸乙酯贮备液各2 mL，苔黑酚葡萄糖苷、五没食子酰葡萄糖贮备液各5 mL于25 mL容量瓶，加50%甲醇定容至刻度，过0.45 ?m微孔滤膜，即得没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖浓度分别为25.696、97.28、40.064、101.86 ?g/mL的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取盐肤木提取物约0.1 g至100 mL容量瓶，加50%甲醇适量，超声（功率350 W，频率50 kHz）10 min溶解，并定容至刻度，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。
2.3 色谱条件 色谱柱：Hypersil-Gold Dim C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流动相：甲醇（B）-0.1%甲酸（C），梯度洗脱（0～8 min，5%→5%B;8～9 min，5%→13%B;9～16 min，13%B;16～17 min，13%→25%B;17～28 min，25%B;28～29 min，25%→32%B;29～35 min，32%B;35～37 min，32%→70%B;37～40 min，70%B）;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;检测波长：273 nm。理论塔板数按没食子酸峰计算应不低于3000。色谱图见图1。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别进样1、2、4、6、10、15、20 ?L，记录色谱峰面积，以进样量（?g）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程、相关系数和线性范围，见表1。
2.4.2 精密度试验
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10 ?L，注入色谱仪，按“2.3”项下色谱条件，在同一日内连续进样6次，测定峰面积，结果没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为0.80%、0.79%、0.81%、2.43%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，于室温放置0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取10 ?L，按“2.3”项下色谱条件进样分析，计算各色谱峰面积的RSD，结果没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为0.96%、1.57%、1.07%、3.63%，表明室温条件下供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4.4 重复性试验
称取同一样品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件进样10 ?L，測得没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖的平均含量分别为62.23、195.87、46.67、226.39 mg/g，RSD分别为1.45%、2.77%、1.70%、3.18%，表明该方法重复性良好。
2.4.5 加样回收率试验
精密移取已测定含量的供试品溶液2 mL至50 mL容量瓶中，平行9份，按低、中、高3个浓度，分别精密加入80%、100%、120%对照品溶液（321.2 ?g/mL没食子酸300、400、460 ?L，486.4 ?g/mL苔黑酚葡萄糖苷640、800、960 ?L，100.16 ?g/mL没食子酸乙酯740、920、1120 ?L，509 ?g/mL五没食子酰葡萄糖700、880、1060 ?L），加50%甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 ?m微孔滤膜，按“2.3”项下色谱条件进样10 ?L测定，计算加样回收率及RSD。结果表明，没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖的平均加样回收率分别为99.86%、99.34%、98.80%、100.79%，RSD分别为2.10%、1.91%、2.39%、2.04%，见表2。
2.4.6 样品含量测定
分别精密称取不同批次盐肤木提取物，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件进样10 ?L，测定没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖含量，结果见表3。
3 讨论
盐肤木主要药理作用有抗菌抗氧化[11-14]、抗炎[15]、抗肿瘤[16]、抗HIV-1活性[17]等。因此，本研究采用HPLC对盐肤木提取物中没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖进行同时测定，以4种酚酸类成分含量作为指标，建立简便、准确、快捷的检测方法。 本试验比较了5种不同类型的色谱柱（Ultimate XB-C18、Shim-pack VP-ODS、Platisil-ODS、Hypersil-Gold Dim C18、Diamonsil-C18），最终选择Hypersil-Gold Dim C18色谱柱，可以更好地分离所测定的化合物。测定的4种化合物均含有1个或多个酚羟基，具有一定的酸性，为保证获得较好的峰形，采用酸水作为水相，在预试验中以不同浓度磷酸、甲酸以及冰醋酸进行优化，最终以0.1%甲酸作为水相，可得到较好的色谱峰。本试验以乙腈-0.1%甲酸和甲醇-0.1%甲酸作为流动相进行筛选优化，结果采用乙腈-0.1%甲酸作为流动相时，4种化合物的峰形不够美观且分离度未达到相应要求，而以甲醇-0.1%甲酸作为流动相进行梯度洗脱时，分离度较好且峰形尖锐。没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖各自的吸收波长为271、272、273、281 nm，综合考虑，同时检测4种成分选择273 nm为检测波长，结果各指标峰形较好。
本研究建立的HPLC方法能简便、高效地对盐肤木提取物中的没食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、没食子酸乙酯、五没食子酰葡萄糖进行同时测定，方法学考察表明，该方法精密性、稳定性、重复性均良好，结果准确，可有效控制盐肤木的质量。
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（收稿日期：2018-05-14）
（修回日期：2018-06-13;编辑：陈静）