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摘要 [目的]验证混合菌对竹笋壳的降解效果。[方法]运用红外光谱分析（IR）、气质联用（GC-MS）和扫描电子显微镜技术（SEM）对降解前后竹笋壳的成分和表面结构变化进行了分析。[结果]混合菌分泌的水解酶先降解竹笋壳表面的蜡质、半纤维素和纤维素，甲基化和氧化竹笋壳木质素侧链，随后破坏木质素苯环。[结论]竹笋壳表面硅结构的裸露程度可以作为竹笋壳降解程度的评价指标。
关键词 竹笋壳；混合菌；降解；微观表征 中图分类号 TS209 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0006-02
Microstructure Characterization of Degradation Process of Bamboo Shoot Shell
ZHANG Ya-qiang，ZHANG Ping，NIU Chun* （Ningxia Tairui Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yinchuan，Ningxia 750101）
Abstract [Objective] The aim was to verify degradation process of bamboo shoot shell by mixed bacteria.[Method] We analyzed the composition and surface structure of bamboo shoot shell before and after degradation by IR，GC-MS and SEM.[Result] The hydrolytic enzymes secreted by mixed bacteria firstly degraded the wax，hemicellulose and cellulose of bamboo shoot shell surface，and methylated and oxidized the lignin side chain of bamboo shoot shell，and then destroyed the lignin benzene.[Conclusion] The bare degree of silicon structure of bamboo shoot shell surface could be taken as the evaluation index of bamboo shoot shell degradation degree.
Key words Bamboo shoot shell；Mixed bacteria；Degradation；Microstructure characterization
国内外关于真菌降解秸秆的研究较多，但研究重点还停留在筛选高效降解菌或通过研究真菌培养条件等来实现产酶的最优化[1-3]，而对降解过程和机理的研究则比较少见。有研究指出，真菌对秸秆的降解作用是通过其产生的2种胞外酶系：纤维素、半纤维素水解酶系；木质素降解酶系（锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶）来实现[4]。但这些酶作用后秸秆结构的变化还需进一步研究。为深入了解降解过程与机理以及降解前后秸秆结构和成分的变化，笔者运用红外光谱分析（IR）、气质联用（GC-MS）和扫描电子显微镜技术（SEM）对降解前后竹笋壳的成分和表面结构变化进行了分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料与试剂。竹笋壳购自安徽宁国茂盛源食品有限公司；平菇、黑曲霉保藏于宁夏泰瑞制药股份有限公司；试剂均为分析纯，购自国药集团。
1.1.2 培养基。竹笋壳固态发酵营养液：酒石酸铵22.00 g，KH2PO4 20.00 g，MgSO4·7H2O 13.80 g，CaCl2 1.00 g，NaCl 0.60 g，MnSO4·H2O 0.35 g，FeSO4·7H2O 60 mg，CoCl2·6H2O 110 mg，ZnSO4·7H2O 60 mg，AlK（SO4）2·12H2O 6 mg，H3BO3 6 mg，VB1 100 mg，麸皮0.03 g，吐温-80 1.10 g，愈创木酚0.50 mmol，CuSO4·5H2O 20 mg，定容到1 L。
1.1.3 儀器。SCION SQ单四级杆气质联用仪为布鲁克·道尔顿公司产品；Nicolet 67 傅里叶红外光谱仪为美国Thermo Nicolet公司产品；JSM-6490LV 扫描电子显微镜为日本电子制造。
1.2 方法
1.2.1 竹笋壳固态混合发酵。竹笋壳洗净，风干，粉碎至60目，称5.00 g置于250 mL锥形瓶中；加入初始pH为5.5的营养液12 mL，调节培养基含水量为60%；先接种活化的平菇菌丝悬液培养176 h，再接种活化的黑曲霉孢子悬液共同培养11 d；平菇和黑曲霉总接种量为20%，接种比例为3∶2；培养温度为28 ℃。
1.2.2 降解前后竹笋壳结构和成分的变化。
1.2.2.1 IR分析。
培养完成后，取适量发酵培养基，用pH 4.8的HAc-NaHAc缓冲液50 mL浸泡3 h，过滤，滤渣置于105 ℃烘箱中烘干备用。称适量样品，添加基质量100倍的KBr粉末制盐片，傅里叶红外光谱仪扫描。
1.2.2.2 GC-MS分析。添加200 mL蒸馏水到样品中，200 r/min振荡1 h，用8层纱布过滤，用CH2Cl2萃取滤液3次，蒸发浓缩，0.45 μm有机膜过滤。
气质联用条件：色谱柱为DB-5MS（0.25 mm×60 m，0.25 μm）；载气为高纯氦；载气流量为1.00 mL/min；程序：50 ℃保持2 min，5 ℃/min 升温到280 ℃保持3 min。 1.2.2.3 SEM分析。
先用蒸馏水清洗样品，再用乙醇和丙酮清洗，冷冻干燥后得样品，喷金，扫描电子显微镜观察。
2 结果与分析
2.1 IR分析结果
由图1可知，经混合菌降解后，竹笋壳的结构发生了明显改变。综合有关学者对秸秆类物质的IR分析结果可以得出[5]，竹笋壳在降解前后，主要是蜡质的剥落和木质纤维素类物质发生了较大变化。蜡质的剥落和纤维素、半纤维素的降解引起了—CH3、—CH2和C—H键的减少，导致3 380和2 920 cm-1处的红外吸收发生了变化。而木质素先是支链甲基化、侧链氧化，之后是苯环解环，所以1 550 cm-1处的红外吸收也发生了明显变化。上述过程进行到一定程度后，竹笋壳中的硅结构便随着包裹它的成分的剥离而裸露出来，这从1 050 cm-1处聚合态硅发生转化也得到了充分证明。
2.2 降解前后竹笋壳洗脱液的GC-MS分析结果
竹笋壳表面被角质蜡状膜包裹着，一般由醛类、脂溶性的脂肪酸、脂类、烷烃、酮类和脂肪醇组成[6]。细胞壁填充物中还含有硅类化合物。而原始竹笋壳洗脱液中的硅类物质、长链脂肪酸和长链脂肪烃正好印证了这些结构（图2），说明竹笋壳有部分表面结构在振荡提取时可能被洗脱下来溶于水中，从而被萃取出来。
和原始竹笋壳相比，降解后竹笋壳洗脱液中出现了硅类化合物这一新物质（图3）。随着木质纤维素类物质从竹笋壳表面脱落，硅结构便裸露出来，有少量在机械振荡作用下被洗脱下来萃取到水中。硅氧化物这一物质出现在洗脱液中，从一定程度上证明了竹笋壳的纤维结构已被混合菌有效降解。
2.3 SEM分析
由图4可知，原始竹笋壳表面结构规整紧密，其上突出的大圆点和小圆点是竹笋壳中的硅结构[7]，硅结构表面还有一层包裹竹笋壳的致密蜡质结构[8]；降解后竹笋壳表观结构被破坏，出现了很多空洞和裂缝，硅结构也越来越明显裸露。
3 结论
混合菌降解竹笋壳的微观过程基本如下：混合菌分泌的水解酶先将竹笋壳表面的蜡质、半纤维素和纤维素进行降解，对木质素进行侧链甲基化和氧化，使竹笋壳表面出现裂痕，内部结构裸露，随后破坏木质素苯环，菌丝进入竹笋壳内部，释放木质纤维素降解酶系[9]。
参考文献
[1] 黄丹莲，曾光明，黄国和，等.白腐菌固态发酵条件最优化及其降解植物生物质的研究[J].环境科学学报，2005，25（2）：232-237.
[2] 王洪媛，范丙全.三株高效秸秆纤维素降解真菌的筛选及其降解效果[J].微生物学报，2010，50（7）：870-875.
[3] XIONG X P，WEN X H，BAI Y N，et al.Effects of culture conditions on ligninolytic enzymes and protease production by Phanerochaete chrysospori-um in air[J].Journal of environmental sciences，2008，20（1）：94-100.
[4] SANCHEZ C.Lignocellulosic residues：Biodegradation and bioconversion by fungi[J].Biotechnology advances，2009，27（2）：185-194.
[5] 白洪志，杨谦，张鲁进.纤维素降解菌简青霉H-11的筛选及酶学特性的研究[J].华北农学报，2007，22（3）：160-162.
[6] 王仁佑，刘剑潇，黄红丽，等.鼠李糖脂对两株木质素降解菌产酶能力的影响[J].湖南大学学报（自然科学版），2008，35（10）：70-74.
[7] ZENG G M，YU M，CHEN Y N，et al.Effects of inoculation with Phanerochaete chrysosporium at various time points on enzyme activities during agricultural waste composting[J].Bioresource technology，2010，101（1）：222-227.
[8] RODRGUEZ GOUTO S，MDDES D，SANROMAN M A.Optimum stability conditions of pH and temperature for ligninase and manganese-dependent peroxidase from Phanerochaete chrysosporium.Application to in vitro decolorization of Poly R-478 by MnP[J].World journal of microbiology and biotechnology，2006，22（6）：607-612.
[9] 高大文，文湘華，钱易.白腐真菌培养条件对其分泌木质素降解酶的影响[J].中国环境科学，2005，25（5）：572-575.
关键词 竹笋壳；混合菌；降解；微观表征 中图分类号 TS209 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0006-02
Microstructure Characterization of Degradation Process of Bamboo Shoot Shell
ZHANG Ya-qiang，ZHANG Ping，NIU Chun* （Ningxia Tairui Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yinchuan，Ningxia 750101）
Abstract [Objective] The aim was to verify degradation process of bamboo shoot shell by mixed bacteria.[Method] We analyzed the composition and surface structure of bamboo shoot shell before and after degradation by IR，GC-MS and SEM.[Result] The hydrolytic enzymes secreted by mixed bacteria firstly degraded the wax，hemicellulose and cellulose of bamboo shoot shell surface，and methylated and oxidized the lignin side chain of bamboo shoot shell，and then destroyed the lignin benzene.[Conclusion] The bare degree of silicon structure of bamboo shoot shell surface could be taken as the evaluation index of bamboo shoot shell degradation degree.
Key words Bamboo shoot shell；Mixed bacteria；Degradation；Microstructure characterization
国内外关于真菌降解秸秆的研究较多，但研究重点还停留在筛选高效降解菌或通过研究真菌培养条件等来实现产酶的最优化[1-3]，而对降解过程和机理的研究则比较少见。有研究指出，真菌对秸秆的降解作用是通过其产生的2种胞外酶系：纤维素、半纤维素水解酶系；木质素降解酶系（锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶）来实现[4]。但这些酶作用后秸秆结构的变化还需进一步研究。为深入了解降解过程与机理以及降解前后秸秆结构和成分的变化，笔者运用红外光谱分析（IR）、气质联用（GC-MS）和扫描电子显微镜技术（SEM）对降解前后竹笋壳的成分和表面结构变化进行了分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料与试剂。竹笋壳购自安徽宁国茂盛源食品有限公司；平菇、黑曲霉保藏于宁夏泰瑞制药股份有限公司；试剂均为分析纯，购自国药集团。
1.1.2 培养基。竹笋壳固态发酵营养液：酒石酸铵22.00 g，KH2PO4 20.00 g，MgSO4·7H2O 13.80 g，CaCl2 1.00 g，NaCl 0.60 g，MnSO4·H2O 0.35 g，FeSO4·7H2O 60 mg，CoCl2·6H2O 110 mg，ZnSO4·7H2O 60 mg，AlK（SO4）2·12H2O 6 mg，H3BO3 6 mg，VB1 100 mg，麸皮0.03 g，吐温-80 1.10 g，愈创木酚0.50 mmol，CuSO4·5H2O 20 mg，定容到1 L。
1.1.3 儀器。SCION SQ单四级杆气质联用仪为布鲁克·道尔顿公司产品；Nicolet 67 傅里叶红外光谱仪为美国Thermo Nicolet公司产品；JSM-6490LV 扫描电子显微镜为日本电子制造。
1.2 方法
1.2.1 竹笋壳固态混合发酵。竹笋壳洗净，风干，粉碎至60目，称5.00 g置于250 mL锥形瓶中；加入初始pH为5.5的营养液12 mL，调节培养基含水量为60%；先接种活化的平菇菌丝悬液培养176 h，再接种活化的黑曲霉孢子悬液共同培养11 d；平菇和黑曲霉总接种量为20%，接种比例为3∶2；培养温度为28 ℃。
1.2.2 降解前后竹笋壳结构和成分的变化。
1.2.2.1 IR分析。
培养完成后，取适量发酵培养基，用pH 4.8的HAc-NaHAc缓冲液50 mL浸泡3 h，过滤，滤渣置于105 ℃烘箱中烘干备用。称适量样品，添加基质量100倍的KBr粉末制盐片，傅里叶红外光谱仪扫描。
1.2.2.2 GC-MS分析。添加200 mL蒸馏水到样品中，200 r/min振荡1 h，用8层纱布过滤，用CH2Cl2萃取滤液3次，蒸发浓缩，0.45 μm有机膜过滤。
气质联用条件：色谱柱为DB-5MS（0.25 mm×60 m，0.25 μm）；载气为高纯氦；载气流量为1.00 mL/min；程序：50 ℃保持2 min，5 ℃/min 升温到280 ℃保持3 min。 1.2.2.3 SEM分析。
先用蒸馏水清洗样品，再用乙醇和丙酮清洗，冷冻干燥后得样品，喷金，扫描电子显微镜观察。
2 结果与分析
2.1 IR分析结果
由图1可知，经混合菌降解后，竹笋壳的结构发生了明显改变。综合有关学者对秸秆类物质的IR分析结果可以得出[5]，竹笋壳在降解前后，主要是蜡质的剥落和木质纤维素类物质发生了较大变化。蜡质的剥落和纤维素、半纤维素的降解引起了—CH3、—CH2和C—H键的减少，导致3 380和2 920 cm-1处的红外吸收发生了变化。而木质素先是支链甲基化、侧链氧化，之后是苯环解环，所以1 550 cm-1处的红外吸收也发生了明显变化。上述过程进行到一定程度后，竹笋壳中的硅结构便随着包裹它的成分的剥离而裸露出来，这从1 050 cm-1处聚合态硅发生转化也得到了充分证明。
2.2 降解前后竹笋壳洗脱液的GC-MS分析结果
竹笋壳表面被角质蜡状膜包裹着，一般由醛类、脂溶性的脂肪酸、脂类、烷烃、酮类和脂肪醇组成[6]。细胞壁填充物中还含有硅类化合物。而原始竹笋壳洗脱液中的硅类物质、长链脂肪酸和长链脂肪烃正好印证了这些结构（图2），说明竹笋壳有部分表面结构在振荡提取时可能被洗脱下来溶于水中，从而被萃取出来。
和原始竹笋壳相比，降解后竹笋壳洗脱液中出现了硅类化合物这一新物质（图3）。随着木质纤维素类物质从竹笋壳表面脱落，硅结构便裸露出来，有少量在机械振荡作用下被洗脱下来萃取到水中。硅氧化物这一物质出现在洗脱液中，从一定程度上证明了竹笋壳的纤维结构已被混合菌有效降解。
2.3 SEM分析
由图4可知，原始竹笋壳表面结构规整紧密，其上突出的大圆点和小圆点是竹笋壳中的硅结构[7]，硅结构表面还有一层包裹竹笋壳的致密蜡质结构[8]；降解后竹笋壳表观结构被破坏，出现了很多空洞和裂缝，硅结构也越来越明显裸露。
3 结论
混合菌降解竹笋壳的微观过程基本如下：混合菌分泌的水解酶先将竹笋壳表面的蜡质、半纤维素和纤维素进行降解，对木质素进行侧链甲基化和氧化，使竹笋壳表面出现裂痕，内部结构裸露，随后破坏木质素苯环，菌丝进入竹笋壳内部，释放木质纤维素降解酶系[9]。
参考文献
[1] 黄丹莲，曾光明，黄国和，等.白腐菌固态发酵条件最优化及其降解植物生物质的研究[J].环境科学学报，2005，25（2）：232-237.
[2] 王洪媛，范丙全.三株高效秸秆纤维素降解真菌的筛选及其降解效果[J].微生物学报，2010，50（7）：870-875.
[3] XIONG X P，WEN X H，BAI Y N，et al.Effects of culture conditions on ligninolytic enzymes and protease production by Phanerochaete chrysospori-um in air[J].Journal of environmental sciences，2008，20（1）：94-100.
[4] SANCHEZ C.Lignocellulosic residues：Biodegradation and bioconversion by fungi[J].Biotechnology advances，2009，27（2）：185-194.
[5] 白洪志，杨谦，张鲁进.纤维素降解菌简青霉H-11的筛选及酶学特性的研究[J].华北农学报，2007，22（3）：160-162.
[6] 王仁佑，刘剑潇，黄红丽，等.鼠李糖脂对两株木质素降解菌产酶能力的影响[J].湖南大学学报（自然科学版），2008，35（10）：70-74.
[7] ZENG G M，YU M，CHEN Y N，et al.Effects of inoculation with Phanerochaete chrysosporium at various time points on enzyme activities during agricultural waste composting[J].Bioresource technology，2010，101（1）：222-227.
[8] RODRGUEZ GOUTO S，MDDES D，SANROMAN M A.Optimum stability conditions of pH and temperature for ligninase and manganese-dependent peroxidase from Phanerochaete chrysosporium.Application to in vitro decolorization of Poly R-478 by MnP[J].World journal of microbiology and biotechnology，2006，22（6）：607-612.
[9] 高大文，文湘華，钱易.白腐真菌培养条件对其分泌木质素降解酶的影响[J].中国环境科学，2005，25（5）：572-575.