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摘要：目的：建立病毒蚀斑法作为狂犬病毒毒力滴定的比较精确的方法。
方法：我们采用比较法，平行测定35批狂犬病Vero细胞疫苗，比较病毒蚀斑法与NIH小鼠法测定狂犬病毒滴度的结果。
结果：病毒蚀斑法和NIH小鼠法具有一定相关性，且判定结果时间由NIH小鼠法测定的21天缩短为病毒蚀斑法测定的10天。
结论：病毒蚀斑法具有快速、经济、操作简单、重复性好等诸多优点，适用于狂犬疫苗生产研究中的病毒毒力滴定。
关键词：BHK细胞Vero细胞人用狂犬疫苗病毒滴定蚀斑法PFULD50
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2013）04-0007-02
狂犬病毒（RV）属于弹状病毒科狂犬病毒属，是人和动物狂犬病的病原体。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。能使各种温血动物如狼、狐、猫、牛、羊、马、猪等感染狂犬病。在狂犬病毒的疫苗生产和研制过程中，对病毒毒力的测定是很重要的一步。世界卫生组织的《生物制品规程》狂犬病毒抗原滴度检测的方法建议采用小鼠法和其他适宜的生物学方法。一般实验室采用小鼠LD50法测定，但是由于动物实验需要鉴定员有较高的操作技术，且动物存在个体差异，测定费用较高，测定结果的时间较长等不足之处，国内外已经开始尝试使用蚀斑法进行毒力测定。
细胞培养形成单层后接种病毒形成的蚀斑技术，是较精确地测定病毒感染力的方法。将各稀释度的病毒悬液接种到平皿或细胞培养板中的单层细胞上，先让细胞吸附病毒一定时间，然后在单层细胞上覆盖营养琼脂或者甲基纤维素培养基以限制病毒复制释放后的相对移动，只能感染周围细胞。被感染的细胞由于退化或死亡细胞不能摄入染料，从而形成肉眼可见的不染色区域，称为蚀斑形成单位（PFU）。狂犬病毒的蚀斑形成主要决定条件有两个，一是要有适应细胞培养的病毒株，二是要有敏感的细胞株。本实验室通过大量的实验证明BHK细胞对狂犬病毒（PM株）颇为敏感，使用BHK细胞测定毒力滴度比Vero细胞上接种病毒测定结果高2—3倍，且出斑清晰可数，现将实验结果报告如下：
1材料和方法
1.1材料。
1.1.1病毒株。狂犬病毒PM株购于美国ATCC，于Vero细胞上适应传代后的病毒液。
1.1.2细胞株。BHK细胞株系国外引进，保存于液氮中。实验前，经复苏、传代、无菌试验，确认无支原体及其它微生物污染。
1.1.3生长液、维持液、覆盖液。
1.1.3.1生长液配方。
1.2方法。
1.2.1蚀斑滴定法。将病毒样品在冰浴中用病毒维持液作10倍系列稀释，取10-1-10-6六个稀释度各0.2ml分别接种于12孔细胞培养板内的BHK细胞单层，每个稀释度平行接种2孔，10-1接种一孔，最后留一孔作对照（CK）。37℃吸附1小时后每孔加入1%的甲基纤维素覆盖物，继续在37℃孵育10天后用甲醛固定，吸出覆盖物，用1%的结晶紫染色30min，水冲洗自然风干后数斑并计算病毒滴度。
1.2.2小鼠LD50滴定方法。将病毒样品在冰浴中用病毒维持液作10倍系列稀释，取10-1-10-6各稀释度病毒液分别颅内接种10-12克昆明小鼠6只，每只脑内0.03ml，逐日观察并于第7天后记录小鼠发病及死亡数至第21天，用《中国生物制品规程》2005版中Reed和Muench法计算每批病毒的LD50值。
2结果
2.1蚀斑滴定法。
2.2PFU与小鼠LD50的关系。蚀斑法与NIH小鼠法平行测定35批狂犬病Vero细胞疫苗，结果表明用蚀斑法滴定的毒力结果略高于NIH小鼠法，二者呈正相关系（见图3），可以考虑用蚀斑法替代NIH小鼠法测定狂犬病Vero细胞疫苗的病毒滴度。
3结论
病毒蚀斑法不仅具有快速、经济、操作简单、重复性好等诸多优点，而且可以避免使用NIH小鼠法时小鼠间个体差异，其测定结果更为可靠。可以考虑通过进一步探索出斑条件和方法使其测定的病毒滴度能更真实的反映待测样品的病毒感染滴度，从而替代NIH小鼠法测定病毒疫苗的滴度。
4讨论
本实验室实验结果阐明了狂犬病毒在BHK细胞上形成蚀斑的若干因素。实践中须注意的是BHK细胞虽然对多种病毒易感，而且细胞也容易传代培养，但细胞维持期短暂。采用较低温度（33℃）培养是延长细胞维持期的措施之一，但其出现蚀斑的时间也相应延长。我们在实验中适当提高维持液的PH，减少维持液中的小牛血清含量以及每隔2天左右更换维持液的方法，可使病毒在BHK细胞上较为稳定地出现蚀斑。
文献介绍用1%的石炭酸复红甲醇液与1%结晶紫甲醇液对感染单纯疱疹病毒的人胚肌皮单层细胞进行染色观察蚀斑形成，我们简化后仅采用1%结晶紫甲醇液进行细胞染色，观察狂犬病毒蚀斑的形成也取得良好的效果。实际操作中要注意的是，在滴加染色液时必须均匀地使细胞着色，否则细胞染色深浅不匀，有损细胞的显示。在细胞染色过程中，用流水冲洗残余染色液时，水流切勿直接冲及细胞面，以免将细胞层冲散影响蚀斑的观察。
综上所述，应用病毒蚀斑法滴定狂犬病毒毒力，具有快速、廉价、简便、重复性高、不用动物等优点是替代小鼠LD50滴定方法测定狂犬病毒毒力可行方法。
参考文献
[1]Kamesaburo Yoshino et al. Plague assay of rabies virus in chick embryo cells.Arch Virusforsch 1966；18：370
[2]肖泽帅等.狂犬病毒甲基纤维素蚀斑及蚀斑减少中和试验的建立，实验和临床病毒学杂志，1987，1：11
[3]严子林等.狂犬病毒蚀斑方法的建立。病毒学杂志，1988，2：142
[4]李宏玲等.用细胞病变及蚀斑形成滴定狂犬病毒方法的建立，中华微生物学和免疫学杂志，1990，10（3）：197
[5]郑民实等.单纯疱疹病毒空斑形成影响因素的研究.病毒学杂志.1987；8：22-27Vero细胞广泛应用与病毒疫苗的生产
[6]Wiktor TJ，et al；Tissue culture methods.Lab Tech in Rabies WHO：Geneva，1973；109
[7]李淑云等.应用蚀斑法滴定黄热疫苗效力.中国生物制品学杂志，2000，13（3）：180-182
[8]严家新等.用细胞培养法取代动物实验法检定狂犬病疫苗.中国生物制品学杂志.2003，16（3）：192-193
[9]郑筱萸等.《中华人民共和国药典》2005版.三部
[10]《世界卫生组织生物制品规程》.WHO TRS.840，P.202-204，1994
方法：我们采用比较法，平行测定35批狂犬病Vero细胞疫苗，比较病毒蚀斑法与NIH小鼠法测定狂犬病毒滴度的结果。
结果：病毒蚀斑法和NIH小鼠法具有一定相关性，且判定结果时间由NIH小鼠法测定的21天缩短为病毒蚀斑法测定的10天。
结论：病毒蚀斑法具有快速、经济、操作简单、重复性好等诸多优点，适用于狂犬疫苗生产研究中的病毒毒力滴定。
关键词：BHK细胞Vero细胞人用狂犬疫苗病毒滴定蚀斑法PFULD50
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2013）04-0007-02
狂犬病毒（RV）属于弹状病毒科狂犬病毒属，是人和动物狂犬病的病原体。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。能使各种温血动物如狼、狐、猫、牛、羊、马、猪等感染狂犬病。在狂犬病毒的疫苗生产和研制过程中，对病毒毒力的测定是很重要的一步。世界卫生组织的《生物制品规程》狂犬病毒抗原滴度检测的方法建议采用小鼠法和其他适宜的生物学方法。一般实验室采用小鼠LD50法测定，但是由于动物实验需要鉴定员有较高的操作技术，且动物存在个体差异，测定费用较高，测定结果的时间较长等不足之处，国内外已经开始尝试使用蚀斑法进行毒力测定。
细胞培养形成单层后接种病毒形成的蚀斑技术，是较精确地测定病毒感染力的方法。将各稀释度的病毒悬液接种到平皿或细胞培养板中的单层细胞上，先让细胞吸附病毒一定时间，然后在单层细胞上覆盖营养琼脂或者甲基纤维素培养基以限制病毒复制释放后的相对移动，只能感染周围细胞。被感染的细胞由于退化或死亡细胞不能摄入染料，从而形成肉眼可见的不染色区域，称为蚀斑形成单位（PFU）。狂犬病毒的蚀斑形成主要决定条件有两个，一是要有适应细胞培养的病毒株，二是要有敏感的细胞株。本实验室通过大量的实验证明BHK细胞对狂犬病毒（PM株）颇为敏感，使用BHK细胞测定毒力滴度比Vero细胞上接种病毒测定结果高2—3倍，且出斑清晰可数，现将实验结果报告如下：
1材料和方法
1.1材料。
1.1.1病毒株。狂犬病毒PM株购于美国ATCC，于Vero细胞上适应传代后的病毒液。
1.1.2细胞株。BHK细胞株系国外引进，保存于液氮中。实验前，经复苏、传代、无菌试验，确认无支原体及其它微生物污染。
1.1.3生长液、维持液、覆盖液。
1.1.3.1生长液配方。
1.2方法。
1.2.1蚀斑滴定法。将病毒样品在冰浴中用病毒维持液作10倍系列稀释，取10-1-10-6六个稀释度各0.2ml分别接种于12孔细胞培养板内的BHK细胞单层，每个稀释度平行接种2孔，10-1接种一孔，最后留一孔作对照（CK）。37℃吸附1小时后每孔加入1%的甲基纤维素覆盖物，继续在37℃孵育10天后用甲醛固定，吸出覆盖物，用1%的结晶紫染色30min，水冲洗自然风干后数斑并计算病毒滴度。
1.2.2小鼠LD50滴定方法。将病毒样品在冰浴中用病毒维持液作10倍系列稀释，取10-1-10-6各稀释度病毒液分别颅内接种10-12克昆明小鼠6只，每只脑内0.03ml，逐日观察并于第7天后记录小鼠发病及死亡数至第21天，用《中国生物制品规程》2005版中Reed和Muench法计算每批病毒的LD50值。
2结果
2.1蚀斑滴定法。
2.2PFU与小鼠LD50的关系。蚀斑法与NIH小鼠法平行测定35批狂犬病Vero细胞疫苗，结果表明用蚀斑法滴定的毒力结果略高于NIH小鼠法，二者呈正相关系（见图3），可以考虑用蚀斑法替代NIH小鼠法测定狂犬病Vero细胞疫苗的病毒滴度。
3结论
病毒蚀斑法不仅具有快速、经济、操作简单、重复性好等诸多优点，而且可以避免使用NIH小鼠法时小鼠间个体差异，其测定结果更为可靠。可以考虑通过进一步探索出斑条件和方法使其测定的病毒滴度能更真实的反映待测样品的病毒感染滴度，从而替代NIH小鼠法测定病毒疫苗的滴度。
4讨论
本实验室实验结果阐明了狂犬病毒在BHK细胞上形成蚀斑的若干因素。实践中须注意的是BHK细胞虽然对多种病毒易感，而且细胞也容易传代培养，但细胞维持期短暂。采用较低温度（33℃）培养是延长细胞维持期的措施之一，但其出现蚀斑的时间也相应延长。我们在实验中适当提高维持液的PH，减少维持液中的小牛血清含量以及每隔2天左右更换维持液的方法，可使病毒在BHK细胞上较为稳定地出现蚀斑。
文献介绍用1%的石炭酸复红甲醇液与1%结晶紫甲醇液对感染单纯疱疹病毒的人胚肌皮单层细胞进行染色观察蚀斑形成，我们简化后仅采用1%结晶紫甲醇液进行细胞染色，观察狂犬病毒蚀斑的形成也取得良好的效果。实际操作中要注意的是，在滴加染色液时必须均匀地使细胞着色，否则细胞染色深浅不匀，有损细胞的显示。在细胞染色过程中，用流水冲洗残余染色液时，水流切勿直接冲及细胞面，以免将细胞层冲散影响蚀斑的观察。
综上所述，应用病毒蚀斑法滴定狂犬病毒毒力，具有快速、廉价、简便、重复性高、不用动物等优点是替代小鼠LD50滴定方法测定狂犬病毒毒力可行方法。
参考文献
[1]Kamesaburo Yoshino et al. Plague assay of rabies virus in chick embryo cells.Arch Virusforsch 1966；18：370
[2]肖泽帅等.狂犬病毒甲基纤维素蚀斑及蚀斑减少中和试验的建立，实验和临床病毒学杂志，1987，1：11
[3]严子林等.狂犬病毒蚀斑方法的建立。病毒学杂志，1988，2：142
[4]李宏玲等.用细胞病变及蚀斑形成滴定狂犬病毒方法的建立，中华微生物学和免疫学杂志，1990，10（3）：197
[5]郑民实等.单纯疱疹病毒空斑形成影响因素的研究.病毒学杂志.1987；8：22-27Vero细胞广泛应用与病毒疫苗的生产
[6]Wiktor TJ，et al；Tissue culture methods.Lab Tech in Rabies WHO：Geneva，1973；109
[7]李淑云等.应用蚀斑法滴定黄热疫苗效力.中国生物制品学杂志，2000，13（3）：180-182
[8]严家新等.用细胞培养法取代动物实验法检定狂犬病疫苗.中国生物制品学杂志.2003，16（3）：192-193
[9]郑筱萸等.《中华人民共和国药典》2005版.三部
[10]《世界卫生组织生物制品规程》.WHO TRS.840，P.202-204，1994