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摘 要：目的：建立了QuEChERS方法结合高效液相色谱-串联质谱测定鸡蛋中氯霉素类兽药残留分析方法。方法：鸡蛋样品以80%乙腈水提取，加入盐析剂处理，取上清液经C18净化，UPLC-MS/MS测定。结果：目标化合物在0.010～0.100 ?g/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R≥0.991，检出限和定量限分别为0.505～0.750 ?g/kg和1.683～2.500 ?g/kg。在0.01 mg/kg添加水平下，氟苯尼考胺、氯霉素、氟甲砜霉素的平均加标回收率范围在76.5%～108.0%，相对标准偏差（RSD）范围在5.33%～6.01%。结论：本方法快速、简便、准确，可用于鸡蛋中氯霉素类药物的残留测定。
关键词：QuEChERS;超高效液相色谱-串联质谱;鸡蛋;氯霉素
鸡蛋营养丰富，富含优质蛋白质、维生素和矿物质等，是餐桌上常见的食品。氯霉素类抗生素具有广谱性，能有效治疗动物疾病。但是，氯霉素存在严重的毒副作用，如能抑制人体骨髓造血功能，引起人体的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症[1]。由于氯霉素类药物价格低廉，疗效好，在畜禽养殖过程中会残留在鸡蛋中，对人们的健康和环境构成严重危害，我国已经明确规定氯霉素不得在雞蛋中检出[2]。
QuEChERS前处理方法具有快速、简便、廉价、有效、耐用、安全等特点，是近年来应用广泛的样品前处理技术，常常用于兽药残留分析。氯霉素类药物的测定方法主要有气相色谱法[3]、气相色谱-质谱法[4]、液相色谱-串联质谱法[5]等，其中超高效串联质谱法具有分析速度快和灵敏度高的特点。本研究在QuECHERS方法的基础上，对提取溶液种类和净化剂含量等参数进行了优化，结合UPLC-MS/MS测定，建立了一种快速、有效、简便的测定鸡蛋中氯霉素类药物的方法。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：MixOne数显涡旋振荡器（合肥艾本森科学仪器有限公司）;高速离心机（日本Hitachi Limited公司）;FSH-2可调高速电动匀浆机（上海天由仪器科技有限公司）;Milli-Q超纯水净仪（美国Millipore公司）;超声波清洗器（浙江纳德科学仪器有限公司）;Waters XEVO MS超高效液相串联质谱仪（美国Waters公司）。
试剂：氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品溶液（100 ?g/mL）（北京坛墨质检科技有限公司）;乙腈、甲酸和甲醇（HPLC级，美国德国MERCK公司）;实验室用水为Milli-Q超纯水;十八烷基键合硅胶填料（C18）和石墨化炭黑（GCB）（美国Agilent公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液配制
分别吸取浓度为100 ?g/mL标准溶液（氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺），用甲醇配制成浓度为2.0 ?g/mL的混合标准储备液。准确吸取适量混合标准储备液，用空白提取液稀释成浓度为0.01 ?g/mL、0.02 ?g/mL、0.04 ?g/mL、0.08 ?g/mL和0.10 ?g/mL的基质混合标准溶液，流动相（甲醇∶水=10%∶90%）稀释成浓度梯度为同系列浓度的溶剂混合标准溶液。
1.2.2 样品前处理
称取鸡蛋样品2.00 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈-水（8∶2，V/V）（含0.1%甲酸）提取，高速匀浆，静置5 min，加入1 g MgSO4和1 g NaCl，剧烈振荡3 min后，超声提取10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液于5 mL离心管中，加入10.0 mg固相萃取填料C18进行净化，10 000 r/min离心10 min，过0.22 ?m滤膜后，UPLC-MS/MS测定。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）;流动相：A为0.1%（V/V）甲酸水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～3 min，20% B;3～5 min，80% B;5～8 min，100% B;8～10 min，10% B。流速：0.2mL/min;进样量：5 ?L。
1.2.4 质谱条件
离子源：电喷雾电离源（ESI）;负离子模式扫描（氟苯尼考胺为正离子模式）;多反应监测（MRM）;电喷雾电压：3.5 kV，离子源和离子化溶剂温度分别为150 ℃和500 ℃，离子化和锥孔气体流量分别为1 000 L/h和50 L/h。质谱参数见表1。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的选择
本研究考察了6种提取溶剂的提取效果，分别为90%甲醇水、80%甲醇水、70%甲醇水、90%乙腈水、80%乙腈水和70%乙腈水。结果表明，含有甲醇组的提取液色素干扰严重，蛋白沉淀效果差，影响目标物提取，回收率均在60%以下。乙腈组织渗透力和沉淀蛋白质能力强，本试验选取乙腈作为提取溶剂。提取剂中加入水的含量对目标物氟苯尼考胺的提取有显著影响，其中提取剂中含水量为10%和20%时，氟苯尼考胺回收率无差异，当提取剂中含水量下降到30%时，氟苯尼考胺的回收率从90%下降为50%。为了减少有机溶剂乙腈的用量，节约成本，因此，选择乙腈-水（8∶2，V/V）为提取溶剂，提取回收率在76.5%～108%，按照GB/T 27404—2008准确度要求，该方法满足农药残留检测的要求。
2.2 净化剂的选择
C18可以去除提取液中非极性物质，降低干扰和减小基质效应，提高分析结果的准确性和重现性;GCB可以消除色素对试验结果的干扰和质谱离子化的影响。本文分别考察了加入5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的C18加入量对目标物的影响。研究证明C18为20 mg，添加浓度为0.01 mg/kg时，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率范围在76.5%～108%。同时，当在20 mg C18中加入20 mg GCB时，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收范围为75.6%～92.4%，为了节约成本和减少试验步骤，本研究选择不加GCB。因此，本研究选择净化剂为C18，添加量为20 mg。 2.3 色谱-质谱条件选择及优化
在相同梯度洗脱条件下，考察了流动相甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液对氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素的分离度、灵敏度和峰型的影响。试验表明，以乙腈水体系为流动相时，氟苯尼考胺保留时间小于0.5 min;以甲醇水体系作为流动相时，氟苯尼考胺能有效保留，保留时间为1.27 min，本研究选择洗脱能力弱的甲醇体系，图1为氯霉素类药物在甲醇体系的MRM色谱图。
氯霉素类药物用甲醇配制成浓度为200 ?g/L，质谱注射泵直接进入质谱进行MS扫描，优化毛细管电压寻找母离子;优化碰撞能量，选择响应高和干扰小的子离子作为定量离子。电离模式、定量离子对、定性离子对、碰撞能量及锥孔电压见表1。
2.4 基质效应、检出限和定量限
配制基质匹配混合标准溶液，UPLC-MS/MS进行检测。在0.010～0.100 ?g/mL范围内溶剂和基质匹配标准曲线的线性相关系数R≥0.991。以定量离子的信噪比S/N=3和S/N=10分别计算检出限（LOD）和定量限（LOQ）[6]，氯霉素类化合物在鸡蛋基质中的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.505～0.750 ?g/kg和1.683～2.500 ?g/kg，结果见表2。
在UPLC-MS/MS检测复杂样品时，易受样品基质的干扰，影响目标物的离子化，产生增强或抑制效应，称为基质效应（Matrix Effect，ME）[7]。基质效应=基质匹配校准曲线的斜率/溶剂标准校准曲线的斜率，比值越接近1，则基质效应越小;比值在0.8～1.2范围内，则表明基质效应不明显。基质效应见表2，除氟苯尼考胺外，氯霉素和氟甲砜霉素在鸡蛋中基质效应较为明显，因此采用空白基质匹配标准曲线以降低基质效应的影响。
2.5 回收率与精密度
选择空白鸡蛋样品，在0.01 mg/kg添加水平下，进行6次平行试验。采用基质匹配标准曲线进行定量分析，氯霉素类药物在鸡蛋基质中的回收率与相对标准偏差结果见表3。氟苯尼考胺、氯霉素、氟甲砜霉素的平均加标回收率范围在76.5%～108.0%，相对标准偏差（RSD）范围在5.33%～6.01%，符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[8]。
2.6 实际样品测定
随机选取超市和养殖场的动物源性食品，包括超市鸡蛋12份和养殖场21份，共33份样品，运用所建立的方法对样品进行检测，同时做方法对比，运用国标方法《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》（GB/T 22338—2008）[9]。结果显示，所测的33份鸡蛋样品均未检出氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素。
3 结论
本文利用QuEChERS方法结合超高效液相色谱-三重四极杆质谱法，建立了鸡蛋样品基质中氯霉素兽药残留的测定方法。该方法快速、简便、灵敏，能够对样品中的目标化合物进行准确的定性和定量分析，采用基质匹配校正曲线定量，能最大程度地消除基质干扰，使检测结果更加精确，适用于动物源性食品鸡蛋中兽药残留的快速检测。
参考文献
[1]武书庚.鸡蛋的营养价值和对人体健康的益处[J].养生大世界，2020（9）：80-81.
[2]崔荣飞，赵兴鑫，田梅，等.动物源性食品中非法添加物残留危害及检测技术[J].今日畜牧兽医，2019，35（12）：1-3.
[3]郭军，王文兰，赵全东，等.气相色谱法测定水产品中氯霉素残留的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2018，9（23）：6216-6220.
[4]张春辉.气相色谱质谱法同时测定动物组织中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺及氯霉素[J].企业科技与发展，2020（9）：79-81.
[5]黄建芳.QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱法同时测定大黄鱼中五氯酚及氯霉素类药物残留[J].現代食品，2020（21）：170-173.
[6]郭学桃.化学检测中检出限的测定与运用[J].大众标准化，2018（5）：42-45.
[7]周剑，王敏，杨梦瑞.液相色谱质谱分析中的基质效应研究[J].农产品质量与安全，2018（1）：67-70.
[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[9]国家质量监督检验检疫总局.动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定GB/T 22338—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
关键词：QuEChERS;超高效液相色谱-串联质谱;鸡蛋;氯霉素
鸡蛋营养丰富，富含优质蛋白质、维生素和矿物质等，是餐桌上常见的食品。氯霉素类抗生素具有广谱性，能有效治疗动物疾病。但是，氯霉素存在严重的毒副作用，如能抑制人体骨髓造血功能，引起人体的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症[1]。由于氯霉素类药物价格低廉，疗效好，在畜禽养殖过程中会残留在鸡蛋中，对人们的健康和环境构成严重危害，我国已经明确规定氯霉素不得在雞蛋中检出[2]。
QuEChERS前处理方法具有快速、简便、廉价、有效、耐用、安全等特点，是近年来应用广泛的样品前处理技术，常常用于兽药残留分析。氯霉素类药物的测定方法主要有气相色谱法[3]、气相色谱-质谱法[4]、液相色谱-串联质谱法[5]等，其中超高效串联质谱法具有分析速度快和灵敏度高的特点。本研究在QuECHERS方法的基础上，对提取溶液种类和净化剂含量等参数进行了优化，结合UPLC-MS/MS测定，建立了一种快速、有效、简便的测定鸡蛋中氯霉素类药物的方法。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：MixOne数显涡旋振荡器（合肥艾本森科学仪器有限公司）;高速离心机（日本Hitachi Limited公司）;FSH-2可调高速电动匀浆机（上海天由仪器科技有限公司）;Milli-Q超纯水净仪（美国Millipore公司）;超声波清洗器（浙江纳德科学仪器有限公司）;Waters XEVO MS超高效液相串联质谱仪（美国Waters公司）。
试剂：氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品溶液（100 ?g/mL）（北京坛墨质检科技有限公司）;乙腈、甲酸和甲醇（HPLC级，美国德国MERCK公司）;实验室用水为Milli-Q超纯水;十八烷基键合硅胶填料（C18）和石墨化炭黑（GCB）（美国Agilent公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液配制
分别吸取浓度为100 ?g/mL标准溶液（氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺），用甲醇配制成浓度为2.0 ?g/mL的混合标准储备液。准确吸取适量混合标准储备液，用空白提取液稀释成浓度为0.01 ?g/mL、0.02 ?g/mL、0.04 ?g/mL、0.08 ?g/mL和0.10 ?g/mL的基质混合标准溶液，流动相（甲醇∶水=10%∶90%）稀释成浓度梯度为同系列浓度的溶剂混合标准溶液。
1.2.2 样品前处理
称取鸡蛋样品2.00 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈-水（8∶2，V/V）（含0.1%甲酸）提取，高速匀浆，静置5 min，加入1 g MgSO4和1 g NaCl，剧烈振荡3 min后，超声提取10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液于5 mL离心管中，加入10.0 mg固相萃取填料C18进行净化，10 000 r/min离心10 min，过0.22 ?m滤膜后，UPLC-MS/MS测定。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）;流动相：A为0.1%（V/V）甲酸水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～3 min，20% B;3～5 min，80% B;5～8 min，100% B;8～10 min，10% B。流速：0.2mL/min;进样量：5 ?L。
1.2.4 质谱条件
离子源：电喷雾电离源（ESI）;负离子模式扫描（氟苯尼考胺为正离子模式）;多反应监测（MRM）;电喷雾电压：3.5 kV，离子源和离子化溶剂温度分别为150 ℃和500 ℃，离子化和锥孔气体流量分别为1 000 L/h和50 L/h。质谱参数见表1。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的选择
本研究考察了6种提取溶剂的提取效果，分别为90%甲醇水、80%甲醇水、70%甲醇水、90%乙腈水、80%乙腈水和70%乙腈水。结果表明，含有甲醇组的提取液色素干扰严重，蛋白沉淀效果差，影响目标物提取，回收率均在60%以下。乙腈组织渗透力和沉淀蛋白质能力强，本试验选取乙腈作为提取溶剂。提取剂中加入水的含量对目标物氟苯尼考胺的提取有显著影响，其中提取剂中含水量为10%和20%时，氟苯尼考胺回收率无差异，当提取剂中含水量下降到30%时，氟苯尼考胺的回收率从90%下降为50%。为了减少有机溶剂乙腈的用量，节约成本，因此，选择乙腈-水（8∶2，V/V）为提取溶剂，提取回收率在76.5%～108%，按照GB/T 27404—2008准确度要求，该方法满足农药残留检测的要求。
2.2 净化剂的选择
C18可以去除提取液中非极性物质，降低干扰和减小基质效应，提高分析结果的准确性和重现性;GCB可以消除色素对试验结果的干扰和质谱离子化的影响。本文分别考察了加入5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的C18加入量对目标物的影响。研究证明C18为20 mg，添加浓度为0.01 mg/kg时，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率范围在76.5%～108%。同时，当在20 mg C18中加入20 mg GCB时，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收范围为75.6%～92.4%，为了节约成本和减少试验步骤，本研究选择不加GCB。因此，本研究选择净化剂为C18，添加量为20 mg。 2.3 色谱-质谱条件选择及优化
在相同梯度洗脱条件下，考察了流动相甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液对氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素的分离度、灵敏度和峰型的影响。试验表明，以乙腈水体系为流动相时，氟苯尼考胺保留时间小于0.5 min;以甲醇水体系作为流动相时，氟苯尼考胺能有效保留，保留时间为1.27 min，本研究选择洗脱能力弱的甲醇体系，图1为氯霉素类药物在甲醇体系的MRM色谱图。
氯霉素类药物用甲醇配制成浓度为200 ?g/L，质谱注射泵直接进入质谱进行MS扫描，优化毛细管电压寻找母离子;优化碰撞能量，选择响应高和干扰小的子离子作为定量离子。电离模式、定量离子对、定性离子对、碰撞能量及锥孔电压见表1。
2.4 基质效应、检出限和定量限
配制基质匹配混合标准溶液，UPLC-MS/MS进行检测。在0.010～0.100 ?g/mL范围内溶剂和基质匹配标准曲线的线性相关系数R≥0.991。以定量离子的信噪比S/N=3和S/N=10分别计算检出限（LOD）和定量限（LOQ）[6]，氯霉素类化合物在鸡蛋基质中的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.505～0.750 ?g/kg和1.683～2.500 ?g/kg，结果见表2。
在UPLC-MS/MS检测复杂样品时，易受样品基质的干扰，影响目标物的离子化，产生增强或抑制效应，称为基质效应（Matrix Effect，ME）[7]。基质效应=基质匹配校准曲线的斜率/溶剂标准校准曲线的斜率，比值越接近1，则基质效应越小;比值在0.8～1.2范围内，则表明基质效应不明显。基质效应见表2，除氟苯尼考胺外，氯霉素和氟甲砜霉素在鸡蛋中基质效应较为明显，因此采用空白基质匹配标准曲线以降低基质效应的影响。
2.5 回收率与精密度
选择空白鸡蛋样品，在0.01 mg/kg添加水平下，进行6次平行试验。采用基质匹配标准曲线进行定量分析，氯霉素类药物在鸡蛋基质中的回收率与相对标准偏差结果见表3。氟苯尼考胺、氯霉素、氟甲砜霉素的平均加标回收率范围在76.5%～108.0%，相对标准偏差（RSD）范围在5.33%～6.01%，符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[8]。
2.6 实际样品测定
随机选取超市和养殖场的动物源性食品，包括超市鸡蛋12份和养殖场21份，共33份样品，运用所建立的方法对样品进行检测，同时做方法对比，运用国标方法《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》（GB/T 22338—2008）[9]。结果显示，所测的33份鸡蛋样品均未检出氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素。
3 结论
本文利用QuEChERS方法结合超高效液相色谱-三重四极杆质谱法，建立了鸡蛋样品基质中氯霉素兽药残留的测定方法。该方法快速、简便、灵敏，能够对样品中的目标化合物进行准确的定性和定量分析，采用基质匹配校正曲线定量，能最大程度地消除基质干扰，使检测结果更加精确，适用于动物源性食品鸡蛋中兽药残留的快速检测。
参考文献
[1]武书庚.鸡蛋的营养价值和对人体健康的益处[J].养生大世界，2020（9）：80-81.
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[3]郭军，王文兰，赵全东，等.气相色谱法测定水产品中氯霉素残留的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2018，9（23）：6216-6220.
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[6]郭学桃.化学检测中检出限的测定与运用[J].大众标准化，2018（5）：42-45.
[7]周剑，王敏，杨梦瑞.液相色谱质谱分析中的基质效应研究[J].农产品质量与安全，2018（1）：67-70.
[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[9]国家质量监督检验检疫总局.动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定GB/T 22338—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.