【摘 要】
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【目的】随着高通量测序方法的应用,越来越多的sRNA(small non-coding RNA,sRNA)需验证。本研究建立用地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA的技术,为细菌sRNA验证提供一种
【机 构】
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湖南省南华大学公共卫生学院,军事医学科学院微生物与流行病研究所,
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【目的】随着高通量测序方法的应用,越来越多的sRNA(small non-coding RNA,sRNA)需验证。本研究建立用地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA的技术,为细菌sRNA验证提供一种灵敏、特异的方法。【方法】在低铁条件下,提取鼠疫菌总RNA,10%dPAGE分离后电转到尼龙膜上并用紫外线交联RNA。膜经地高辛标记RyhB1或RyhB2寡核苷酸RNA探针过夜杂交后洗脱、封闭和免疫检测,最后曝光显影。【结果】地高辛标记的Northern blot曝光时间为20 s-3 min,RyhB1或RyhB2检测灵敏度分别为0.005μg和0.05μg。RyhB1或RyhB2探针特异性好,相互间无交叉反应。带正电或中性的尼龙膜都适用于杂交反应。RNA探针在42℃-65℃内杂交均可,提高温度可减少非特异性反应;而DNA探针杂交温度需摸索。【结论】本研究成功构建一种地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA技术,具有特异性好、灵敏度高、探针易保存、曝光时间短等优点,为细菌sRNA验证和功能研究提供有利工具。
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