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【摘 要】 目的：建立高效液相色谱法测定养血饮颗粒中黄芪甲苷的含量，提高养血饮颗粒质量标准，为养血饮颗粒制剂评价研究奠定基础。方法：采用Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent蒸发光检测器（低温型）;以乙腈-水（38∶ 62）为流动相;检测波长为270 nm;空气发生器为0.4 MPa;漂移管温度为50 ℃对黄芪甲苷进行含量测定。结果：黄芪甲苷在0.66～6.63μg范围内线性关系良好，回收率为97.81 %（RSD=3.94%，n=9），精密度、稳定性、重现性均符合要求。结论：该方法可以用于养血饮颗粒中黄芪甲苷的含量测定。
【关键词】 养血饮颗粒;黄芪甲苷;含量测定;蒸发光检测器;质量标准
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）7-0027-04
Abstract：Objective A high performance liquid chromatography （HPLC） method was established for the determination of astragaloside glycoside in Yangxueyin Keli， and the quality standard of Yangxueyin granules was improved.Methods Adopt Agilent 1260 high performance liquid chromatography， Agilent evaporative light detector （low temperature type）; use acetonitrile-water （38∶ 62） as mobile phase; detection wavelength is 270nm; air generator is 0.4 MPa; drift tube temperature is 50 ℃， determination of astragaloside glycoside.Results Astragaloside glycoside has a good linear relationship in the range of 0.66 to 6.63 μg， and the recovery rate is 97.81% （RSD=3.94%， n=9）.The precision， stability， and reproducibility meet the requirements.Conclusion The method can be used for the determination of astragaloside glycoside in Yangxueyin Keli.
Keywords：Yangxueyin Keli;Astragaloside Glycoside;Content Determination;Evaporative Light detector;Quality Standard
养血饮颗粒由当归、黄芪、大枣、鹿角胶、阿胶五种药味组成，具有补气养血、益肾助脾的功效[1-3]，是吉林敖东集团力源制药股份有限公司生产的中药颗粒剂产品，现行养血饮颗粒剂标准中含量测定为薄层扫描法[4-6]测定养血饮颗粒中黄芪甲苷的含量，由于薄层扫描法含量测定结果精密度低，重复性差，专属性差，使质量标准陈旧，不能很好的对产品质量进行控制，严重影响制剂的生产和应用[7-10]，因此，確定养血饮颗粒黄芪甲苷含量测定的合适方法，提高养血饮颗粒的质量标准势在必行，本研究将采用高效液相色谱法，蒸发光检测器对养血饮颗粒中黄芪甲苷进行含量测定，提高养血饮颗粒质量标准，为该制剂后续研究提供理论依据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（Agilent 1260），蒸发光检测器（Agilent，低温型）;空气发生器（XWK-Ⅲ）;Phenomenex Luna C18 （4.6mm×250 mm，5μm）色谱柱;黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，110781-201717，纯度96.9%）;养血饮颗粒（吉林敖东集团力源制药股份有限公司，规格为5 g/袋，批号180101、180102、180303、190101、190104、190302、090303、190304、190501、190502）乙腈为色谱纯;水为超纯水;其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 供试品溶液制备 取本品，研细，取约5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加水30 mL，加热使溶解，用水饱合正丁醇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.1.2 对照品溶液制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。
2.1.3 阴性样品溶液制备 按比例取组方中除黄芪以外的其余药材，按照制备工艺制备阴性样品，取阴性样品5 g，按2.1.1方法制备阴性样品溶液。
2.2 色谱条件与系统性试验 以十八烷基键合硅胶为填充剂;以乙腈-水（32∶ 68）为流动相;蒸发光散射检测器检测，空气发生器0.4 MPa，漂移管50℃;检测波长270 nm;流速为1.0mL/min;柱温为35℃;理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于5000。精密吸取对照品溶液10 μL，供试品溶液和阴性样品溶液各15 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，结果供试品与黄芪甲苷对照品色谱图有相同保留时间的色谱峰，阴性无干扰，结果如图1、图2、图3所示。
2.3 方法验证试验
2.3.1 线性 精密称取黄芪甲苷对照品16.58 mg，加甲醇定容至25 mL量瓶中，得浓度为0.6632mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液，该溶液加甲醇等比稀释制成浓度为0.0663 mg/mL、0.0829 mg/mL、0.1658 mg/mL、0.3316 mg/mL对照品溶液，精密吸取上述5种不同浓度对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪。以对照品进样量（μg）的常用对数为横坐标，峰面积常用对数为纵坐标绘制标准曲线。结果黄芪甲苷在0.66～6.63μg范围内，Y=1.6659X+2.5421（r=0.9991），进样量常用对数与峰面积常用对数呈线性关系。
2.3.2 精密度 取同一份供试品溶液（190302）连续进样测定6次，每次15μL，测定其色谱峰面积值，RSD为1.58 %，结果表明精密度良好，结果见表1。
2.3.3 重现性 取同一批样品（190302），按2.1.1方法平行制备6份供试品溶液，依法进行测定，结果黄芪甲苷含量平均值为0.22 mg/g，RSD值为1.47 %。表明该方法重现性良好，结果见表2。
2.3.4 稳定性 取本品（190302）约5 g，按2.1.1方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、12、24 h进行测定，每次进样量15 μL，RSD为2.61 %，表明供试品溶液在24 h内稳定，结果见表3。
2.3.5 回收率 精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，设计3种不同浓度的对照品溶液（低、中、高浓度对照品溶液浓度分别为0.0061 mg/mL、0.0122 mg/mL、0.0183 mg/mL），每种浓度分别制备3份溶液进行测定，低、中、高浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比分别控制在0.5∶ 1，1∶ 1，1.5∶ 1左右。取本品（190302，含量0.22 mg/g）9份，每份约2.5 g，精密称定，分别精密加入低、中、高浓度对照品溶液50 mL，依法测定，回收率平均值为97.81 %，RSD为3.94 %，结果表明该方法准确度良好，结果见表4。
2.4 含量测定 取养血饮颗粒10批样品（批号180101、180102、180303、190101、190104、190302、090303、190304、190501、190502），按2.1.1方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液5 μL、10 μL，供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，以外标两点法计算黄芪甲苷含量，结果见表5。
3 讨论
3.1 样品的提取[11] 以甲醇为提取溶剂，考察超声提取、回流提取、索氏提取三种提取方法，结果回流提取和索氏提取测定结果无显著差异且明显高于超声提取测定结果，因此采用回流提取方法。并对提取时间和提取溶剂量进行了单因素考察;另外，黄芪中的某些皂苷类成分在碱性条件下可转化为黄芪甲苷（黄芪皂苷Ⅳ），因此在处理样品时，通常使用氨试液对供试品进行碱化，氨试液用量和洗涤次数在一定程度上影响黄芪甲苷测定结果。参考《中国药典》2015年版一部黄芪【含量测定】项下供试品制备方法，以氨试液每次用量为40 mL为基础，对洗涤次数进行考察，数据显示，氨试液洗涤2次和3次结果无显著差异且略高于洗涤1次测定结果，因此，采用氨试液洗涤2次的方法。
3.2 色谱条件的选择 参考《中国药典》2015年版一部黄芪【含量测定】流动相组成，以乙腈、水为流动相组成并对二者比例进行考察，结果乙腈∶ 水为38∶ 62时，黄芪甲苷色谱峰与其他杂峰分离度大于1.5，保留时间适中。因此，确定乙腈∶ 水（38∶ 62）为流动相，同时对流速、柱温、不同色谱柱等色谱条件进行了考察，确定流速为1.0mL/min，柱温为35 ℃，色谱柱为C18（4.6mm×250 mm，5μm），漂移管温度为50 ℃，结果表明本研究方法稳定、专属性强、灵敏度高[12]，适合用于养血饮颗粒中黄芪甲苷的含量测定。参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：302.
[2]国家药典委员会.国家药品标准（第83册）[S].北京：中国医药科技出版社，2011：29-31.
[3]卢仁宣，莫海玲，于灿华.养血饮口服液的质量标准研究[J].中成药，2009，31（8）：16-17.
[4]叶飞，王亚丽，魏娟娟，等.黄芪中黄芪甲苷含量测定的最新研究进展[J].宁夏师范学院学报，2018，39（4）：52-56.
[5]刘世军，赵海峰，唐志书，等.薄层扫描法测定补阳还五胶囊黄芪甲苷的含量[J].西部中医药，2016，29（1）：30-32.
[6]周晶.薄层扫描法测定六味补气胶囊中黄芪甲苷的含量[J].安徽医药，2013，17（1）：37-38.
[7]孙婉瑾，熊义涛，段雪云，等.脑脉通颗粒中黄芪甲苷的含量测定[J].山西医药杂志，2018，47（22）：2639-2641.
[8]罗静霞，何毅文.UPLC-ELSD法测定疏肝健脾颗粒中黄芪甲苷的含量[J].海峡药学，2019，31（8）：108-110.
[9]张丹，张红伟，杨飞.HPLC-ELSD法测定益肺健脾颗粒中黄芪甲苷含量[J].中国医药科学，2017，7（19）：41-43.
[10]王亚丽，田曼，李江，等.HPLC-DAD-ELSD法同时测定黄芪中10个成分的含量[J].中南药学，2018，16（9）：1268-1271.
[11]王瑞芬，逯小萌.HPLC-ELSD测定艾附暖宫丸中黄芪甲苷的含量[J].海峡药学，2019，31（6）：58-59.
[12]牟佳佳，陳芳，陈党辉，等.黄芪中5种黄酮类成分的含量测定及其指纹图谱研究[J].药物评价研究，2019，42（5）：900-906.
（收稿日期：2019-12-25 编辑：程鹏飞）
【关键词】 养血饮颗粒;黄芪甲苷;含量测定;蒸发光检测器;质量标准
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）7-0027-04
Abstract：Objective A high performance liquid chromatography （HPLC） method was established for the determination of astragaloside glycoside in Yangxueyin Keli， and the quality standard of Yangxueyin granules was improved.Methods Adopt Agilent 1260 high performance liquid chromatography， Agilent evaporative light detector （low temperature type）; use acetonitrile-water （38∶ 62） as mobile phase; detection wavelength is 270nm; air generator is 0.4 MPa; drift tube temperature is 50 ℃， determination of astragaloside glycoside.Results Astragaloside glycoside has a good linear relationship in the range of 0.66 to 6.63 μg， and the recovery rate is 97.81% （RSD=3.94%， n=9）.The precision， stability， and reproducibility meet the requirements.Conclusion The method can be used for the determination of astragaloside glycoside in Yangxueyin Keli.
Keywords：Yangxueyin Keli;Astragaloside Glycoside;Content Determination;Evaporative Light detector;Quality Standard
养血饮颗粒由当归、黄芪、大枣、鹿角胶、阿胶五种药味组成，具有补气养血、益肾助脾的功效[1-3]，是吉林敖东集团力源制药股份有限公司生产的中药颗粒剂产品，现行养血饮颗粒剂标准中含量测定为薄层扫描法[4-6]测定养血饮颗粒中黄芪甲苷的含量，由于薄层扫描法含量测定结果精密度低，重复性差，专属性差，使质量标准陈旧，不能很好的对产品质量进行控制，严重影响制剂的生产和应用[7-10]，因此，確定养血饮颗粒黄芪甲苷含量测定的合适方法，提高养血饮颗粒的质量标准势在必行，本研究将采用高效液相色谱法，蒸发光检测器对养血饮颗粒中黄芪甲苷进行含量测定，提高养血饮颗粒质量标准，为该制剂后续研究提供理论依据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（Agilent 1260），蒸发光检测器（Agilent，低温型）;空气发生器（XWK-Ⅲ）;Phenomenex Luna C18 （4.6mm×250 mm，5μm）色谱柱;黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，110781-201717，纯度96.9%）;养血饮颗粒（吉林敖东集团力源制药股份有限公司，规格为5 g/袋，批号180101、180102、180303、190101、190104、190302、090303、190304、190501、190502）乙腈为色谱纯;水为超纯水;其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 供试品溶液制备 取本品，研细，取约5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加水30 mL，加热使溶解，用水饱合正丁醇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.1.2 对照品溶液制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。
2.1.3 阴性样品溶液制备 按比例取组方中除黄芪以外的其余药材，按照制备工艺制备阴性样品，取阴性样品5 g，按2.1.1方法制备阴性样品溶液。
2.2 色谱条件与系统性试验 以十八烷基键合硅胶为填充剂;以乙腈-水（32∶ 68）为流动相;蒸发光散射检测器检测，空气发生器0.4 MPa，漂移管50℃;检测波长270 nm;流速为1.0mL/min;柱温为35℃;理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于5000。精密吸取对照品溶液10 μL，供试品溶液和阴性样品溶液各15 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，结果供试品与黄芪甲苷对照品色谱图有相同保留时间的色谱峰，阴性无干扰，结果如图1、图2、图3所示。
2.3 方法验证试验
2.3.1 线性 精密称取黄芪甲苷对照品16.58 mg，加甲醇定容至25 mL量瓶中，得浓度为0.6632mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液，该溶液加甲醇等比稀释制成浓度为0.0663 mg/mL、0.0829 mg/mL、0.1658 mg/mL、0.3316 mg/mL对照品溶液，精密吸取上述5种不同浓度对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪。以对照品进样量（μg）的常用对数为横坐标，峰面积常用对数为纵坐标绘制标准曲线。结果黄芪甲苷在0.66～6.63μg范围内，Y=1.6659X+2.5421（r=0.9991），进样量常用对数与峰面积常用对数呈线性关系。
2.3.2 精密度 取同一份供试品溶液（190302）连续进样测定6次，每次15μL，测定其色谱峰面积值，RSD为1.58 %，结果表明精密度良好，结果见表1。
2.3.3 重现性 取同一批样品（190302），按2.1.1方法平行制备6份供试品溶液，依法进行测定，结果黄芪甲苷含量平均值为0.22 mg/g，RSD值为1.47 %。表明该方法重现性良好，结果见表2。
2.3.4 稳定性 取本品（190302）约5 g，按2.1.1方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、12、24 h进行测定，每次进样量15 μL，RSD为2.61 %，表明供试品溶液在24 h内稳定，结果见表3。
2.3.5 回收率 精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，设计3种不同浓度的对照品溶液（低、中、高浓度对照品溶液浓度分别为0.0061 mg/mL、0.0122 mg/mL、0.0183 mg/mL），每种浓度分别制备3份溶液进行测定，低、中、高浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比分别控制在0.5∶ 1，1∶ 1，1.5∶ 1左右。取本品（190302，含量0.22 mg/g）9份，每份约2.5 g，精密称定，分别精密加入低、中、高浓度对照品溶液50 mL，依法测定，回收率平均值为97.81 %，RSD为3.94 %，结果表明该方法准确度良好，结果见表4。
2.4 含量测定 取养血饮颗粒10批样品（批号180101、180102、180303、190101、190104、190302、090303、190304、190501、190502），按2.1.1方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液5 μL、10 μL，供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，以外标两点法计算黄芪甲苷含量，结果见表5。
3 讨论
3.1 样品的提取[11] 以甲醇为提取溶剂，考察超声提取、回流提取、索氏提取三种提取方法，结果回流提取和索氏提取测定结果无显著差异且明显高于超声提取测定结果，因此采用回流提取方法。并对提取时间和提取溶剂量进行了单因素考察;另外，黄芪中的某些皂苷类成分在碱性条件下可转化为黄芪甲苷（黄芪皂苷Ⅳ），因此在处理样品时，通常使用氨试液对供试品进行碱化，氨试液用量和洗涤次数在一定程度上影响黄芪甲苷测定结果。参考《中国药典》2015年版一部黄芪【含量测定】项下供试品制备方法，以氨试液每次用量为40 mL为基础，对洗涤次数进行考察，数据显示，氨试液洗涤2次和3次结果无显著差异且略高于洗涤1次测定结果，因此，采用氨试液洗涤2次的方法。
3.2 色谱条件的选择 参考《中国药典》2015年版一部黄芪【含量测定】流动相组成，以乙腈、水为流动相组成并对二者比例进行考察，结果乙腈∶ 水为38∶ 62时，黄芪甲苷色谱峰与其他杂峰分离度大于1.5，保留时间适中。因此，确定乙腈∶ 水（38∶ 62）为流动相，同时对流速、柱温、不同色谱柱等色谱条件进行了考察，确定流速为1.0mL/min，柱温为35 ℃，色谱柱为C18（4.6mm×250 mm，5μm），漂移管温度为50 ℃，结果表明本研究方法稳定、专属性强、灵敏度高[12]，适合用于养血饮颗粒中黄芪甲苷的含量测定。参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：302.
[2]国家药典委员会.国家药品标准（第83册）[S].北京：中国医药科技出版社，2011：29-31.
[3]卢仁宣，莫海玲，于灿华.养血饮口服液的质量标准研究[J].中成药，2009，31（8）：16-17.
[4]叶飞，王亚丽，魏娟娟，等.黄芪中黄芪甲苷含量测定的最新研究进展[J].宁夏师范学院学报，2018，39（4）：52-56.
[5]刘世军，赵海峰，唐志书，等.薄层扫描法测定补阳还五胶囊黄芪甲苷的含量[J].西部中医药，2016，29（1）：30-32.
[6]周晶.薄层扫描法测定六味补气胶囊中黄芪甲苷的含量[J].安徽医药，2013，17（1）：37-38.
[7]孙婉瑾，熊义涛，段雪云，等.脑脉通颗粒中黄芪甲苷的含量测定[J].山西医药杂志，2018，47（22）：2639-2641.
[8]罗静霞，何毅文.UPLC-ELSD法测定疏肝健脾颗粒中黄芪甲苷的含量[J].海峡药学，2019，31（8）：108-110.
[9]张丹，张红伟，杨飞.HPLC-ELSD法测定益肺健脾颗粒中黄芪甲苷含量[J].中国医药科学，2017，7（19）：41-43.
[10]王亚丽，田曼，李江，等.HPLC-DAD-ELSD法同时测定黄芪中10个成分的含量[J].中南药学，2018，16（9）：1268-1271.
[11]王瑞芬，逯小萌.HPLC-ELSD测定艾附暖宫丸中黄芪甲苷的含量[J].海峡药学，2019，31（6）：58-59.
[12]牟佳佳，陳芳，陈党辉，等.黄芪中5种黄酮类成分的含量测定及其指纹图谱研究[J].药物评价研究，2019，42（5）：900-906.
（收稿日期：2019-12-25 编辑：程鹏飞）