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摘 要: 研究对象、方法:利用细胞免疫组化的方法研究力竭运动后12 h成年雄性SD大鼠肝细胞凋亡 同肝细胞内的自由基水平和钙代谢之间的关系。结果:1)运动组与C组相比,凋亡细胞的数 量差异显著(p<0.05);运动组组间差异也具有显著意义(p<0.05)。2) ME、H E 组肝细胞内SOD活性与C组相比差异显著(p<0.05),但运动组组间差异不显著。3) ME 组肝细胞中MDA含量增加、GSH含量降低,且相对于对照组差异显著(p<0.05);HE组虽 有类似变化,但与其它各组相比无显著性差异。4) 运动组肝细胞中Ca2+含量较对照 组增加,差异显著(ME:p<0.01,HE:p<0.05),运动组组间差异显著(p<0.05 )。结论:1)力竭运动可导致肝细胞凋亡,氧化应激及钙离子超载是引起细胞凋亡的重要因 素,且前者可能发挥更重要作用。2)中等强度力竭运动更易于导致肝细胞凋亡,其原因可 能同长时间力竭运动引起中暑或严重缺水,进而导致恢复期内中性粒细胞发生呼吸爆发有关 。
关键词:肝细胞凋亡;氧化自由基;线粒体Ca2+
中图分类号:G804.2
文献标识码:A
文章编号 :1007-3612(2010)02-0059-05
A Study on the Hepatic Cells Apoptosis in Rats after 12 Hours of
Cessation of Different Intensity Exhaustive Exercise
CHEN Wei1,FAN Xinsheng1,ZHANG Tingyan1,LI Shanni2
(1. Department of Sport Medicine, Taishan Medicine University,
Taian 271021, Shandong China; 2.School of Biological Science and Technol ogy, Central China University, Changsha 410083, Hunan China)
Abstract:With the method of immunohistochemica, the paper attempts to ex plore the correlation among hepatic cell apoptosis, level of oxygen free radica ls and mitochondria calcium in ischemic/reperfusion hepatic cells of the male mo use. As a result, it is found that:1) in HE group and ME group, there are many
detec table apoptotic hepatic cells, which are significant compared with that in the c ontrol group. In addition, the difference of apoptotic cells between two exercis e groups is also significant(p<0.05). 2) The SOD activities in exercise grou ps decrease and their difference between control and exercise group are signific ant(p<0.05), but the difference between the exercise group is insignificant.
3) Compared with the control group, MDA content of ME group is increased signif icantly(p<0.05)and its GSH content decreases significantly(p<0.05). Al though the MDA and GSH content of the HE change similarly, the differences betwe en the control groups and ME group are insignificant. 4) Compared with that in c ontrol group, the mitochondrial Ca2+ is increased after ME and HE exercise , whic h both have significance(ME:p<0.01,HE:p<0.05). And the difference betwe en two exercise groups is also significant(p<0.05)In conclusion, 1) Exhaus tive exercise can lead to hepatic cell apoptosis, mitochondria calcium overload,
especially, the hepatocyte oxidative stress may be the important factors trigge ring the hepatic cell apoptosis. 2) Moderate intensity exhaustive exercise is mo re prone to trigger hepatocyte apoptosis. The reason may be that this exercise g oes on longer than high intensity exhaustive exercise and longer exercise time c an cause serious hydropenia or heat stroke which can incur neutrophil respirator y burst activity.
Key words: hepatic cell apoptosis; oxygen free radicals; mitochondrial c alcium
肝是对缺氧比较敏感的器官之一,引起肝缺血的任何生理、病理变化都有可能引起肝细 胞凋亡。肝脏在运动中、后分别处于缺血、再灌注状态,继而发生细胞凋亡。国内外不少研 究证明:随着运动强度的增加,肝细胞凋亡数量也随之增加。袁海平[1]、李雷
[2]、史亚丽[3]、Concordet[4]等人的研究发现,运动引起的肝细胞 中Ca2+紊乱和氧化应激是诱发大鼠肝细胞凋亡的重要因素。目前普遍认为运动性肝细 胞凋亡主要与氧自由基、Ca2+超载等因素有关。
运动同肝细胞凋亡的关系尽管已成为运动医学研究的热点,但大都针对于运动即刻肝细 胞的凋亡。本课题采用不同强度的力竭运动动物模型,研究力竭运动后12 h大鼠肝细胞凋 亡、自由基水平和钙代谢,探析运动性缺血/再灌注中自由基水平、钙离子浓度同肝细胞凋 亡的关系,寻求力竭运动与肝细胞凋亡的相关性,为进一步研究肝细胞凋亡与运动损伤、运 动性疲劳的关系提供实验依据。
投稿日期:2009-10-15
作者简介:陈伟,讲师,硕士研究生,研究方向运动人体科学。 1 研究对象与方法
1.1 研究对象及运动方式 研究对象为成年雄性SD大鼠30 只,体重(215.2±16.8)g,月龄为8周龄,并随机将其分为对照组(C)、中等强度力竭运动 组(ME)、大强度力竭运动组(HE),每组10只;运动方式根据Berdford动物运动模型[1],采用电动跑台。运动组先进行适应性跑台练习然后按不同强度力竭运动进行实验,中等 强度力竭运动组初始速度为10 m/min,持续时间12 min,逐渐增加运动负荷,达到速度为19 .3 m/min(相当于76%V•O2max)、持续到力竭。坡度为10°。大强 度力竭运动组初始速度为26.8 m/min(相当于92.3% V•O2max),持 续到力竭。坡度为10°。
1.2 实验仪器与试剂
主要仪器:820轮转组织切片机、Nikon E600显微照相图像采集系统、722型光栅分光光 度计、PT动物跑台等。
主要试剂:原位末端标记细胞凋亡检测试剂盒、SOD,MDA,GSH,蛋白定量,Ca2+ 试剂盒(皆购于南京建成生物工程有限公司)等。
1.3 标本制备1.3.1 血清制备 大鼠断头颈部取血3 mL,室温静置、离心10 mi n,取上清液即血清。
1.3.2 组织取样 对照组与运动组大鼠分别于安静状态和运动后1 2 h断头处死,取肝左侧 叶,投入3.7%的福尔马林缓冲固定液中固定4～8 h后进行常规石蜡包埋。取样本0.2 g,剪 碎后加入9%的冰生理盐水,用电动匀浆机在冰水浴中进行匀浆,匀浆液离心后提取上清液。
1.4 检测指标
TUNEL标记切片用Nikon E600显微照相图像采集系统进行照相以检测细胞凋亡数量、HE 染色观察肝细胞的整体结构、采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性、采用硫代巴比妥酸(TBA)法 测定MDA含量、采用二硫代二硝基苯甲酸法,测定GSH(谷胱甘肽还原型) 的含量、采用甲基 百里香酚蓝比色法检测肝组织线粒体Ca2+浓度。
1.5 统计学分析
所有的数据用平均值±标准差(X±S)表示。组内差异比较,采用单侧t检验;组 间差异采用方差分析法,显著性水平为α=0.05。所有数据分析采用SPSS12.0软件。
2 结 果
2.1 力竭运动后12 h大鼠肝细胞的凋亡状况及肝组织的形态改变
2.1.1 TUNEL阳性标记肝细胞凋亡状况
细胞凋亡时,DNA双键断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端, 就可在TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase )的作用下,将脱氧核糖核苷酸和HRP (Peroxidase Horseradish 辣根过氧化物酶)形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,该物质与 DAB(diaminobenzidine 二胺基联苯胺)发生显色反应,使凋亡的细胞核呈现出棕色,而正常 的细胞核会被甲基绿复染为绿色(图1)。
表1 力竭运动后12 h大鼠肝细胞的凋亡状况
组别数量细胞凋亡指数对照组10
1.80±1.65中等强度力竭运动组10
35.60±8.41*#大强度力竭运动组10
14.65±3.75*
*代表运动组与安静组比,*p<0.05,**p<0.01;#代表中度强度运动组与大强度运动组比 ,#p<0.05, ##p<0.01。以下各表同。
(a)对照组大鼠肝细胞的TUNEL染色切片,
绿色的是正常的肝细胞核,×600
(b) 中等强度运动组大鼠肝细胞TUNEL染色切片,绿色的
是正常肝细胞核,棕色细胞核为凋亡细胞核,×600;
箭头表示凋亡小体 (c) 大强度运动组大鼠肝细胞TUNEL染色切片,绿色的是正常
肝细胞核,棕色细胞核为凋亡细胞核,×600;箭头表示凋亡小体
图1 大鼠肝细胞TUNEL染色 表1显示,对照组肝细胞未检测到TUNEL阳染细胞核;ME组恢复12 h后,肝细胞出现 了散在的TUNEL阳染细胞核,凋亡指数为35.60±8.41;恢复12 h后,HE组肝细胞中也检测 到细胞凋亡,凋亡指数为14.65±3.75;力竭运动组与C组相比,差异显著(p<0.05); 运动组间凋亡细胞的数量差异也具有显著意义(p<0.05)。
2.1.2 HE染色显示肝组织的形态变化
对肝组织横切片进行HE染色的结果显示,C组肝细胞结构完整,肝索清楚,核大,呈圆形;
ME组和HE组肝细胞明显肿胀,肝窦变窄甚至消失,核变小,深染,汇管区及小叶间血管扩张淤血 ,并见肝小叶轮廓改变等病理性变化。其中中等强度力竭组变化明显于大强度力竭组(图2 )。
(d)对照组大鼠肝细胞的HE染色切片,×600;
(e)中等强度运动组大鼠肝细胞的HE染色切片,×600;
箭头表示凋亡小体; 2.2 力竭运动后12 h肝细胞内SOD活性 ME组肝细胞SOD活 性与C组相比差异显著(p<0.05);HE组肝SOD活性下降,与C组相比差异显著(p<0 .05);不同强度力竭运动组组间差异无统计学意义(表2)。(f)大强度运动组大鼠肝细胞的HE染色切片,×600;箭头表示核深染、变小。图2 大鼠肝细胞HE染色 表2 力竭运动后12 h大鼠肝细胞内的SOD活性
组别数量SOD活性/U•mgprot-1对照组10
230.85±42.36中等强度力竭运动组10
123.32±51.23*大强度力竭运动组10
125.12±64.76*
2.3 力竭运动后12 h肝细胞内的MDA含量 运动组肝细胞中MDA含 量均增加。ME组肝细胞中MDA含量比对照组增加,差异显著(p<0.05);HE组肝细胞中M DA含量虽有增加,但与其它各组相比无显著性差异(表3)。
表3 力竭运动后12 h大鼠肝细胞内的MDA含量
组别数量MDA活性/nmol•mgprot-1对照组10
38.12±6.00中等强度力竭运动组10
45.42±8.32*大强度力竭运动组10
43.56±4.12 2.4 力竭运动后12 h肝细胞内GSH的含量
由表4可知,ME组肝细胞中GSH含量降低,与C组相比差异显著(p<0.05);HE组肝细胞 中GSH含量尽管也降低但较C组无显著差异;运动组组间差异不显著。
表4 力竭运动后12 h大鼠肝细胞的GSH含量
组别数量GSH活性/mg•gprot-1对照组10
785.35±546.69中等强度力竭运动组10
389.36±117.12*大强度力竭运动组10
621.32±242.38
2.5 力竭运动后12 h肝细胞线粒体内的Ca2+含量
表5显示,运动组肝细胞中Ca2+含量显著增加。ME组肝细胞中Ca2+含量较对照 组增加,差异显著(p<0.01);HE组肝细胞中Ca2+含量也较对照组增加,且差异 显著(p<0.05)。运动组组间差异显著(p<0.05)。
表5 力竭运动后12 h大鼠肝细胞线粒体内的Ca2+的含量
组别数量Ca2+含量/nmol•mgpro-1对照组10
0.23±0.12中等强度力竭运动组10
0.91±0.36**#大强度力竭运动组10
2.05±1.25*
3 讨 论
本研究发现运动组相对于C组均出现明显的细胞凋亡,且ME组的细胞凋亡更明显。原因可能 同运动性缺血再灌注引起的肝组织中氧自由基水平和钙离子浓度相关。
3.1 运动性缺血/再灌注引起的氧化应激同大鼠肝细胞凋亡的关系 近年来,运动诱发肝细胞凋亡机制的研究已成为运动医学研究的热点。国内外不少实验 证明[2-5]:运动性肝氧化应激是诱发大鼠肝细胞凋亡的重要因素之一。缺血/再灌 注中引起 肝组织内氧化应激的氧自由基 (oxygen free radicals, OFR)主要通过线粒体、黄嘌呤氧化 酶、激活的中性粒细胞呼吸爆发及儿茶酚胺的自身氧化途径产生。目前认为黄嘌呤氧化酶途 径[6]和中性粒细胞的呼吸爆发途径[7,8]是缺血/再灌注时OFR产生的主 要途径。
3.1.1 氧化应激中中性粒细胞的呼吸爆发
缺血期通过线粒体途径、黄嘌呤氧化酶、儿茶酚胺的自身氧化等途径(特别是黄嘌呤氧 化酶途径)产生一定量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),ROS是各种炎症诱发 因子如TNF-α[9]、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)[10,11]生成的 重要刺激物。新生 成的TNF-α同血管内皮细胞膜上的肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor
1,TNFR1)结合,导致核转录因子(nuclear factor-кβ,NF-кβ)激活。NF-κβ转位 至细胞核,同相应基因的启动子结合,促进包括内皮细胞粘附分子(endothelial cell adh esion molecule, ECAM)在内的多种基因的转录。近年的研究[12]也证明,血管内 皮细胞在 细胞因子作用下的激活都是通过NF-κβ信号传导途径。因为在E-S、VCAM、ICAM等基因的启 动子区域中存在NF-κβ的结合位点[13,14],一旦NF-κβ移位到细胞核,便使内 皮细胞从 头合成一系列同白细胞表面的抗原(如CD-11a、最后期抗原very later antigen,VLA-4,也 即α4β1)等相结合的配体,如CAMs(E-S、ICAM-1、VCAM)[15-17]。此外,在正 常生理状 态下,血管内皮细胞可以表达P选择素(P-selectin,P-S),它贮存于内皮细胞的Weibel Pa lade 小体内,内皮细胞活化时数分钟转移到细胞表面,但维持时间较短。P-S、E-S同中性 粒细胞表面的L选择素(L-selectin,L-S)结合可以实现中性粒细胞同内皮细胞的滚动式粘 附,而通常情况下,白细胞表面的整合素αLβ2(lymphocyte function-associated antig en, LFA-1,即CD11a/CD18)、αDβ2(CD11d/CD18)、αMβ2(Mac-1, 即CD11b/CD18)、 αXβ2(CD11c/CD18) α4β1、α9β1,处于未活化状态,只有被活化时,才能同内皮细胞 表达的ICAM、VCAM结合从而牢固地粘附在肝微静脉内皮上。
缺血再灌注初期产生的TNF可使贮存于内皮细胞的Weibel Palade 小体内的P-S迅速转移 到内皮细胞表面,通过识别与结合白细胞表面L-S糖链中的一定结构,实现白细胞的滚动式 粘附。在这种分离、粘附过程中,既可以活化白细胞表面的整合素[18],又可以使 内皮细胞进一步产生大量的趋化因子[20],继而诱导中性粒细胞的募集。这是因为 缺血/再灌注 期 间血管内皮细胞产生大量的趋化因子如IL-8和巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammator y proteins,MIPs)这些趋化因子通常同内皮细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖结合在一起,从 而使血浆中的趋化因子浓度越来越高,在白细胞同内皮细胞的粘附继而分离的过程中,趋化 因子同白细胞表面受体-G蛋白偶连受体(G protein-coupled receptors,GPCR)结合的 机会大大增加[19];一旦结合,会使白细胞表面的整和素由低活性状态变为高活性 状态,实 现整合素的激活。整合素活化后,同ICAM、VCAM-1的亲和力增加,白细胞尤其是中性粒细胞 牢固地粘附在肝微静脉内皮上,随之阻塞血管加重肝缺血或引起中性粒细胞的呼吸爆发,后 者产生大量的氧自由基,进而扩散进入肝组织。但是在肝血窦处,由于该处内皮上有许多窗 口,同时又不表达P-S[20],所以此处中性粒细胞迁移至肝组织不依赖粘附分子。 运动后肝脏处于再灌注期,粘附在肝血窦内膜上中性粒细胞进一步增多,产生的ROS更多。
通过线粒体途径、黄嘌呤氧化酶、中性粒细胞呼吸爆发等途径(特别是后两种途径)产 生的活性氧通过直接损伤DNA、攻击蛋白质、影响核基因转录、诱发脂质过氧化进而影响信 号转导系统等而诱导细胞凋亡。
本研究中,HE组大鼠由于运动强度大、力竭时间短(92.4±34.61)min,肝组织主要通 过线粒体途径、黄嘌呤氧化酶途径产生氧自由基,产生的量相对较少,所以导致HE组大鼠肝 组织内SOD活性下降、MDA含量增加、GSH含量降低,且后两者与C组相比差异不显著。尽管如 此,由于它们的叠加效应,最终导致HE组大鼠肝细胞凋亡同C组相比较显著。ME组大鼠由于 运动时间较长(234.6±60.05)min,通过线粒体途径产生的ROS较HE组多;力竭时体内ATP 水平较低,AMP较多,通过黄嘌呤氧化酶途径产生的ROS也较多;ME组可能发生中暑或严重缺 水,极有可能通过HE组大鼠不会发生的中性粒细胞呼吸爆发途径产生大量的ROS[21]。以上 因素最终决定了一方面ME组相对于C组,肝细胞中SOD活性下降,MDA含量上升,GSH含量下降 ,且均有显著意义;另一方面ME组相对于HE组,上述各指标也有类似的变化,尽管都无显著 意义;但是由于它们的叠加效应,导致ME组细胞凋亡数目增多,且有显著意义。
此外,ME组由于运动时间较长,还有可能发生葡萄糖耗竭。实验证明[22,23]:葡 萄糖 耗竭会诱导肝细胞凋亡。其机制已被初步阐明:在肝细胞线粒体膜上存在着由蛋白激酶、蛋 白磷酸化酶1(PP1)的催化单位、Wiskott—Aldrich家族蛋白WAVE-1(PKA的锚靠蛋白)和 葡萄糖激酶构成的全酶,且BAD就存在于该全酶复合中。BAD是构成该全酶所必须的,因为在 BAD缺少的肝细胞内,该复合体不存在,同时还伴随着线粒体内己糖激酶的活性降低,导致 线粒体内的呼吸作用对增加葡萄糖不敏感。实验证明:若断绝肝细胞的葡萄糖的供应,BAD 会发生去磷酸化并导致细胞凋亡的发生[24]。当肝细胞内葡萄糖充足时,己糖激酶 被激活, BAD被磷酸化,生成磷酸化的BAD。活化的己糖激酶进一步激活位于线粒体膜上电压阴离子通 道(VDAC)及腺苷酸易位酶(ANT),使ATP和ADP交换频率加快,ATP生成增加,同时它还会 阻止BAX与线粒体膜上的VDAX、ANT结合,从而避免了CytC和AIFS(凋亡起始因子)的释放 [ 25];后者即磷酸化的BAD可同细胞质内的14-3-3蛋白结合,维持其在细胞质的定位,避 免了 它同线粒体膜上的BCL-2蛋白家族的结合[26,27]。而当体内葡萄糖缺乏时,己糖 激酶处于 失活状态,BAD被激活,后者作用于BCL-2蛋白家族,使BCL-2失活,同时激活BAX,诱发肝细 胞凋亡[25]。
3.2 运动性缺血/再灌注中线粒体Ca2+含量与肝细胞凋亡的关系
在生理情况下,肝细胞内液Ca2+浓度约为0.2 μmol/L,细胞外液Ca2+浓度为1.3
mmol/L左右,即肝细胞始终处于胞内外1万倍浓度梯度的内环境中,说明肝细胞有着强有力 的Ca2+稳态调节机制,即质膜Ca2+通道、胞质膜Ca2+泵、Na+/Ca2+ 交换系统。研究表明[28,29]:由于以上Ca2+稳态机制紊乱所造成的肝细 胞内游离钙浓度升高会诱导肝细胞凋亡。
本研究发现,运动组大鼠肝线粒体的Ca2+浓度均升高,细胞凋亡数目增加,且具有显 著意义;尤其ME组线粒体Ca2+浓度增加具有高度显著意义;HE组Ca2+浓度显著 高于ME组;但前者细胞凋亡数目却显著低于后者。
长时间的力竭运动导致缺氧、肝糖原耗竭,加之OFR损伤线粒体结构和功能,导致胞内AT P合成减少;力竭运动导致儿茶酚氨分泌增多,与工作细胞细胞膜上的G蛋白偶联受体接合, 激活了位于细胞膜内侧的效应器酶——磷酯酶、环一磷酸腺苷酶,后者通过各自的途径导致 细胞膜、内质网膜上的ca2+通道打开;引起内质网内ca2+的短暂释放。ATP缺 乏还导致胞膜Ca2+泵排Ca2+能力和内质网膜Ca2+-Mg2+-ATP酶摄C a2+能力下降,Ca2+滞留于胞内。氧化性应激引起胞膜Ca2+通道蛋白变构 、内质网Ca2+通道蛋白功能性巯基结构改变,导 致Ca2+大量异常释放,胞内Ca2+升高。胞质内钙离子的升高会刺激线粒体膜内 膜上的Ca2+泵,从而使线粒体摄ca2+能力增强,以减轻胞质ca2+增加对 运动能力的降低作用。进入线粒体内的ca2+一方面会抑制了丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶 和?-酮成二酸脱氢酶的活性[30],从而影响氧 化磷酸化;另一面会导致钙离子在线粒体内的积累,从而改变线粒体内膜的极化状态,干扰 氧化磷酸化偶联,这两个方面的因素均会导致ATP的生成量减少,导致细胞凋亡的发生。此 时如果胞质ca2+继续升高,大于10umol将会引起线粒体内ca2+超载,诱发PTP 开放[31],cyt C和凋亡蛋白起始因子释放进入胞质,引起细胞凋亡;PTP开放后,水分子进入线粒体导致其 肿张甚至崩溃,随之ca2+外溢,使细胞质ca2+突增,诱发细胞凋亡。钙离子还 与钙调蛋白(CaM)结合,并激活各种蛋白激酶,诱发细胞凋亡。
运动组组间Ca2+浓度差异的原因可能是:HE组由于运动强度大,缺血再灌注程度远远 超 过ME组。缺血期供氧不足,一方面导致细胞内ATP量急速下降,ATP依赖性 Na+-K+泵的 正常 功能受影响,胞内[Na+]增加;另一方面使糖酵解作用增强,细胞内[H+]升高。而 肝血流量减少同时引起随血液流出的H+减少,故肝细胞胞浆内H+持续升高。升高的[H +]会激活Na+-H+交换体,使细胞内的[Na+]升高,由于此时PH值较小,Na+-Ca 2+交换体的活性受抑制,故通过该交换体进入细胞内Ca2+的量较少。运动后再 灌注期,由于血流量增加,细胞外的[H+]很快被清除并恢复到正常水平,Na+-H+和 Na+-Ca2+转换体功能增强,使胞浆内的[Ca2+]进一步增加[32,33 ]以致于超载,如直接测量缺血再灌注后钙离子的浓度发现,缺血期内的Ca2+浓度 增加,再灌注期初期Ca2+的内流较缺血期显著增加并最终导致超载[34]。
尽管缺血再灌注中HE组Ca2+浓度显著高于ME组,但是前者细胞凋亡数目却显著低于后 者,表明肝细胞胞浆内的Ca2+突升仅仅是诱发细胞凋亡的一个因素,其它因素如肝细 胞氧化应激程度,可能是决定肝细胞凋亡的更重要因素。
4 结 论
1) 力竭运动可导致肝细胞凋亡,运动性缺血/再灌注引起的肝细胞氧化应激及钙离子超载是 导致肝细胞凋亡的重要因素。
2) 中等强度急性力竭运动更易于导致肝细胞凋亡,其原因可能同长时间力竭运动引起中暑 或严重缺水,进而导致恢复期内中性粒细胞呼吸爆发。
3) 相对于钙离子超载,运动性缺血/再灌注引起的肝细胞氧化应激可能是导致肝细胞凋亡的 更重要因素。
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关键词:肝细胞凋亡;氧化自由基;线粒体Ca2+
中图分类号:G804.2
文献标识码:A
文章编号 :1007-3612(2010)02-0059-05
A Study on the Hepatic Cells Apoptosis in Rats after 12 Hours of
Cessation of Different Intensity Exhaustive Exercise
CHEN Wei1,FAN Xinsheng1,ZHANG Tingyan1,LI Shanni2
(1. Department of Sport Medicine, Taishan Medicine University,
Taian 271021, Shandong China; 2.School of Biological Science and Technol ogy, Central China University, Changsha 410083, Hunan China)
Abstract:With the method of immunohistochemica, the paper attempts to ex plore the correlation among hepatic cell apoptosis, level of oxygen free radica ls and mitochondria calcium in ischemic/reperfusion hepatic cells of the male mo use. As a result, it is found that:1) in HE group and ME group, there are many
detec table apoptotic hepatic cells, which are significant compared with that in the c ontrol group. In addition, the difference of apoptotic cells between two exercis e groups is also significant(p<0.05). 2) The SOD activities in exercise grou ps decrease and their difference between control and exercise group are signific ant(p<0.05), but the difference between the exercise group is insignificant.
3) Compared with the control group, MDA content of ME group is increased signif icantly(p<0.05)and its GSH content decreases significantly(p<0.05). Al though the MDA and GSH content of the HE change similarly, the differences betwe en the control groups and ME group are insignificant. 4) Compared with that in c ontrol group, the mitochondrial Ca2+ is increased after ME and HE exercise , whic h both have significance(ME:p<0.01,HE:p<0.05). And the difference betwe en two exercise groups is also significant(p<0.05)In conclusion, 1) Exhaus tive exercise can lead to hepatic cell apoptosis, mitochondria calcium overload,
especially, the hepatocyte oxidative stress may be the important factors trigge ring the hepatic cell apoptosis. 2) Moderate intensity exhaustive exercise is mo re prone to trigger hepatocyte apoptosis. The reason may be that this exercise g oes on longer than high intensity exhaustive exercise and longer exercise time c an cause serious hydropenia or heat stroke which can incur neutrophil respirator y burst activity.
Key words: hepatic cell apoptosis; oxygen free radicals; mitochondrial c alcium
肝是对缺氧比较敏感的器官之一,引起肝缺血的任何生理、病理变化都有可能引起肝细 胞凋亡。肝脏在运动中、后分别处于缺血、再灌注状态,继而发生细胞凋亡。国内外不少研 究证明:随着运动强度的增加,肝细胞凋亡数量也随之增加。袁海平[1]、李雷
[2]、史亚丽[3]、Concordet[4]等人的研究发现,运动引起的肝细胞 中Ca2+紊乱和氧化应激是诱发大鼠肝细胞凋亡的重要因素。目前普遍认为运动性肝细 胞凋亡主要与氧自由基、Ca2+超载等因素有关。
运动同肝细胞凋亡的关系尽管已成为运动医学研究的热点,但大都针对于运动即刻肝细 胞的凋亡。本课题采用不同强度的力竭运动动物模型,研究力竭运动后12 h大鼠肝细胞凋 亡、自由基水平和钙代谢,探析运动性缺血/再灌注中自由基水平、钙离子浓度同肝细胞凋 亡的关系,寻求力竭运动与肝细胞凋亡的相关性,为进一步研究肝细胞凋亡与运动损伤、运 动性疲劳的关系提供实验依据。
投稿日期:2009-10-15
作者简介:陈伟,讲师,硕士研究生,研究方向运动人体科学。 1 研究对象与方法
1.1 研究对象及运动方式 研究对象为成年雄性SD大鼠30 只,体重(215.2±16.8)g,月龄为8周龄,并随机将其分为对照组(C)、中等强度力竭运动 组(ME)、大强度力竭运动组(HE),每组10只;运动方式根据Berdford动物运动模型[1],采用电动跑台。运动组先进行适应性跑台练习然后按不同强度力竭运动进行实验,中等 强度力竭运动组初始速度为10 m/min,持续时间12 min,逐渐增加运动负荷,达到速度为19 .3 m/min(相当于76%V•O2max)、持续到力竭。坡度为10°。大强 度力竭运动组初始速度为26.8 m/min(相当于92.3% V•O2max),持 续到力竭。坡度为10°。
1.2 实验仪器与试剂
主要仪器:820轮转组织切片机、Nikon E600显微照相图像采集系统、722型光栅分光光 度计、PT动物跑台等。
主要试剂:原位末端标记细胞凋亡检测试剂盒、SOD,MDA,GSH,蛋白定量,Ca2+ 试剂盒(皆购于南京建成生物工程有限公司)等。
1.3 标本制备1.3.1 血清制备 大鼠断头颈部取血3 mL,室温静置、离心10 mi n,取上清液即血清。
1.3.2 组织取样 对照组与运动组大鼠分别于安静状态和运动后1 2 h断头处死,取肝左侧 叶,投入3.7%的福尔马林缓冲固定液中固定4～8 h后进行常规石蜡包埋。取样本0.2 g,剪 碎后加入9%的冰生理盐水,用电动匀浆机在冰水浴中进行匀浆,匀浆液离心后提取上清液。
1.4 检测指标
TUNEL标记切片用Nikon E600显微照相图像采集系统进行照相以检测细胞凋亡数量、HE 染色观察肝细胞的整体结构、采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性、采用硫代巴比妥酸(TBA)法 测定MDA含量、采用二硫代二硝基苯甲酸法,测定GSH(谷胱甘肽还原型) 的含量、采用甲基 百里香酚蓝比色法检测肝组织线粒体Ca2+浓度。
1.5 统计学分析
所有的数据用平均值±标准差(X±S)表示。组内差异比较,采用单侧t检验;组 间差异采用方差分析法,显著性水平为α=0.05。所有数据分析采用SPSS12.0软件。
2 结 果
2.1 力竭运动后12 h大鼠肝细胞的凋亡状况及肝组织的形态改变
2.1.1 TUNEL阳性标记肝细胞凋亡状况
细胞凋亡时,DNA双键断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端, 就可在TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase )的作用下,将脱氧核糖核苷酸和HRP (Peroxidase Horseradish 辣根过氧化物酶)形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,该物质与 DAB(diaminobenzidine 二胺基联苯胺)发生显色反应,使凋亡的细胞核呈现出棕色,而正常 的细胞核会被甲基绿复染为绿色(图1)。
表1 力竭运动后12 h大鼠肝细胞的凋亡状况
组别数量细胞凋亡指数对照组10
1.80±1.65中等强度力竭运动组10
35.60±8.41*#大强度力竭运动组10
14.65±3.75*
*代表运动组与安静组比,*p<0.05,**p<0.01;#代表中度强度运动组与大强度运动组比 ,#p<0.05, ##p<0.01。以下各表同。
(a)对照组大鼠肝细胞的TUNEL染色切片,
绿色的是正常的肝细胞核,×600
(b) 中等强度运动组大鼠肝细胞TUNEL染色切片,绿色的
是正常肝细胞核,棕色细胞核为凋亡细胞核,×600;
箭头表示凋亡小体 (c) 大强度运动组大鼠肝细胞TUNEL染色切片,绿色的是正常
肝细胞核,棕色细胞核为凋亡细胞核,×600;箭头表示凋亡小体
图1 大鼠肝细胞TUNEL染色 表1显示,对照组肝细胞未检测到TUNEL阳染细胞核;ME组恢复12 h后,肝细胞出现 了散在的TUNEL阳染细胞核,凋亡指数为35.60±8.41;恢复12 h后,HE组肝细胞中也检测 到细胞凋亡,凋亡指数为14.65±3.75;力竭运动组与C组相比,差异显著(p<0.05); 运动组间凋亡细胞的数量差异也具有显著意义(p<0.05)。
2.1.2 HE染色显示肝组织的形态变化
对肝组织横切片进行HE染色的结果显示,C组肝细胞结构完整,肝索清楚,核大,呈圆形;
ME组和HE组肝细胞明显肿胀,肝窦变窄甚至消失,核变小,深染,汇管区及小叶间血管扩张淤血 ,并见肝小叶轮廓改变等病理性变化。其中中等强度力竭组变化明显于大强度力竭组(图2 )。
(d)对照组大鼠肝细胞的HE染色切片,×600;
(e)中等强度运动组大鼠肝细胞的HE染色切片,×600;
箭头表示凋亡小体; 2.2 力竭运动后12 h肝细胞内SOD活性 ME组肝细胞SOD活 性与C组相比差异显著(p<0.05);HE组肝SOD活性下降,与C组相比差异显著(p<0 .05);不同强度力竭运动组组间差异无统计学意义(表2)。(f)大强度运动组大鼠肝细胞的HE染色切片,×600;箭头表示核深染、变小。图2 大鼠肝细胞HE染色 表2 力竭运动后12 h大鼠肝细胞内的SOD活性
组别数量SOD活性/U•mgprot-1对照组10
230.85±42.36中等强度力竭运动组10
123.32±51.23*大强度力竭运动组10
125.12±64.76*
2.3 力竭运动后12 h肝细胞内的MDA含量 运动组肝细胞中MDA含 量均增加。ME组肝细胞中MDA含量比对照组增加,差异显著(p<0.05);HE组肝细胞中M DA含量虽有增加,但与其它各组相比无显著性差异(表3)。
表3 力竭运动后12 h大鼠肝细胞内的MDA含量
组别数量MDA活性/nmol•mgprot-1对照组10
38.12±6.00中等强度力竭运动组10
45.42±8.32*大强度力竭运动组10
43.56±4.12 2.4 力竭运动后12 h肝细胞内GSH的含量
由表4可知,ME组肝细胞中GSH含量降低,与C组相比差异显著(p<0.05);HE组肝细胞 中GSH含量尽管也降低但较C组无显著差异;运动组组间差异不显著。
表4 力竭运动后12 h大鼠肝细胞的GSH含量
组别数量GSH活性/mg•gprot-1对照组10
785.35±546.69中等强度力竭运动组10
389.36±117.12*大强度力竭运动组10
621.32±242.38
2.5 力竭运动后12 h肝细胞线粒体内的Ca2+含量
表5显示,运动组肝细胞中Ca2+含量显著增加。ME组肝细胞中Ca2+含量较对照 组增加,差异显著(p<0.01);HE组肝细胞中Ca2+含量也较对照组增加,且差异 显著(p<0.05)。运动组组间差异显著(p<0.05)。
表5 力竭运动后12 h大鼠肝细胞线粒体内的Ca2+的含量
组别数量Ca2+含量/nmol•mgpro-1对照组10
0.23±0.12中等强度力竭运动组10
0.91±0.36**#大强度力竭运动组10
2.05±1.25*
3 讨 论
本研究发现运动组相对于C组均出现明显的细胞凋亡,且ME组的细胞凋亡更明显。原因可能 同运动性缺血再灌注引起的肝组织中氧自由基水平和钙离子浓度相关。
3.1 运动性缺血/再灌注引起的氧化应激同大鼠肝细胞凋亡的关系 近年来,运动诱发肝细胞凋亡机制的研究已成为运动医学研究的热点。国内外不少实验 证明[2-5]:运动性肝氧化应激是诱发大鼠肝细胞凋亡的重要因素之一。缺血/再灌 注中引起 肝组织内氧化应激的氧自由基 (oxygen free radicals, OFR)主要通过线粒体、黄嘌呤氧化 酶、激活的中性粒细胞呼吸爆发及儿茶酚胺的自身氧化途径产生。目前认为黄嘌呤氧化酶途 径[6]和中性粒细胞的呼吸爆发途径[7,8]是缺血/再灌注时OFR产生的主 要途径。
3.1.1 氧化应激中中性粒细胞的呼吸爆发
缺血期通过线粒体途径、黄嘌呤氧化酶、儿茶酚胺的自身氧化等途径(特别是黄嘌呤氧 化酶途径)产生一定量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),ROS是各种炎症诱发 因子如TNF-α[9]、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)[10,11]生成的 重要刺激物。新生 成的TNF-α同血管内皮细胞膜上的肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor
1,TNFR1)结合,导致核转录因子(nuclear factor-кβ,NF-кβ)激活。NF-κβ转位 至细胞核,同相应基因的启动子结合,促进包括内皮细胞粘附分子(endothelial cell adh esion molecule, ECAM)在内的多种基因的转录。近年的研究[12]也证明,血管内 皮细胞在 细胞因子作用下的激活都是通过NF-κβ信号传导途径。因为在E-S、VCAM、ICAM等基因的启 动子区域中存在NF-κβ的结合位点[13,14],一旦NF-κβ移位到细胞核,便使内 皮细胞从 头合成一系列同白细胞表面的抗原(如CD-11a、最后期抗原very later antigen,VLA-4,也 即α4β1)等相结合的配体,如CAMs(E-S、ICAM-1、VCAM)[15-17]。此外,在正 常生理状 态下,血管内皮细胞可以表达P选择素(P-selectin,P-S),它贮存于内皮细胞的Weibel Pa lade 小体内,内皮细胞活化时数分钟转移到细胞表面,但维持时间较短。P-S、E-S同中性 粒细胞表面的L选择素(L-selectin,L-S)结合可以实现中性粒细胞同内皮细胞的滚动式粘 附,而通常情况下,白细胞表面的整合素αLβ2(lymphocyte function-associated antig en, LFA-1,即CD11a/CD18)、αDβ2(CD11d/CD18)、αMβ2(Mac-1, 即CD11b/CD18)、 αXβ2(CD11c/CD18) α4β1、α9β1,处于未活化状态,只有被活化时,才能同内皮细胞 表达的ICAM、VCAM结合从而牢固地粘附在肝微静脉内皮上。
缺血再灌注初期产生的TNF可使贮存于内皮细胞的Weibel Palade 小体内的P-S迅速转移 到内皮细胞表面,通过识别与结合白细胞表面L-S糖链中的一定结构,实现白细胞的滚动式 粘附。在这种分离、粘附过程中,既可以活化白细胞表面的整合素[18],又可以使 内皮细胞进一步产生大量的趋化因子[20],继而诱导中性粒细胞的募集。这是因为 缺血/再灌注 期 间血管内皮细胞产生大量的趋化因子如IL-8和巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammator y proteins,MIPs)这些趋化因子通常同内皮细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖结合在一起,从 而使血浆中的趋化因子浓度越来越高,在白细胞同内皮细胞的粘附继而分离的过程中,趋化 因子同白细胞表面受体-G蛋白偶连受体(G protein-coupled receptors,GPCR)结合的 机会大大增加[19];一旦结合,会使白细胞表面的整和素由低活性状态变为高活性 状态,实 现整合素的激活。整合素活化后,同ICAM、VCAM-1的亲和力增加,白细胞尤其是中性粒细胞 牢固地粘附在肝微静脉内皮上,随之阻塞血管加重肝缺血或引起中性粒细胞的呼吸爆发,后 者产生大量的氧自由基,进而扩散进入肝组织。但是在肝血窦处,由于该处内皮上有许多窗 口,同时又不表达P-S[20],所以此处中性粒细胞迁移至肝组织不依赖粘附分子。 运动后肝脏处于再灌注期,粘附在肝血窦内膜上中性粒细胞进一步增多,产生的ROS更多。
通过线粒体途径、黄嘌呤氧化酶、中性粒细胞呼吸爆发等途径(特别是后两种途径)产 生的活性氧通过直接损伤DNA、攻击蛋白质、影响核基因转录、诱发脂质过氧化进而影响信 号转导系统等而诱导细胞凋亡。
本研究中,HE组大鼠由于运动强度大、力竭时间短(92.4±34.61)min,肝组织主要通 过线粒体途径、黄嘌呤氧化酶途径产生氧自由基,产生的量相对较少,所以导致HE组大鼠肝 组织内SOD活性下降、MDA含量增加、GSH含量降低,且后两者与C组相比差异不显著。尽管如 此,由于它们的叠加效应,最终导致HE组大鼠肝细胞凋亡同C组相比较显著。ME组大鼠由于 运动时间较长(234.6±60.05)min,通过线粒体途径产生的ROS较HE组多;力竭时体内ATP 水平较低,AMP较多,通过黄嘌呤氧化酶途径产生的ROS也较多;ME组可能发生中暑或严重缺 水,极有可能通过HE组大鼠不会发生的中性粒细胞呼吸爆发途径产生大量的ROS[21]。以上 因素最终决定了一方面ME组相对于C组,肝细胞中SOD活性下降,MDA含量上升,GSH含量下降 ,且均有显著意义;另一方面ME组相对于HE组,上述各指标也有类似的变化,尽管都无显著 意义;但是由于它们的叠加效应,导致ME组细胞凋亡数目增多,且有显著意义。
此外,ME组由于运动时间较长,还有可能发生葡萄糖耗竭。实验证明[22,23]:葡 萄糖 耗竭会诱导肝细胞凋亡。其机制已被初步阐明:在肝细胞线粒体膜上存在着由蛋白激酶、蛋 白磷酸化酶1(PP1)的催化单位、Wiskott—Aldrich家族蛋白WAVE-1(PKA的锚靠蛋白)和 葡萄糖激酶构成的全酶,且BAD就存在于该全酶复合中。BAD是构成该全酶所必须的,因为在 BAD缺少的肝细胞内,该复合体不存在,同时还伴随着线粒体内己糖激酶的活性降低,导致 线粒体内的呼吸作用对增加葡萄糖不敏感。实验证明:若断绝肝细胞的葡萄糖的供应,BAD 会发生去磷酸化并导致细胞凋亡的发生[24]。当肝细胞内葡萄糖充足时,己糖激酶 被激活, BAD被磷酸化,生成磷酸化的BAD。活化的己糖激酶进一步激活位于线粒体膜上电压阴离子通 道(VDAC)及腺苷酸易位酶(ANT),使ATP和ADP交换频率加快,ATP生成增加,同时它还会 阻止BAX与线粒体膜上的VDAX、ANT结合,从而避免了CytC和AIFS(凋亡起始因子)的释放 [ 25];后者即磷酸化的BAD可同细胞质内的14-3-3蛋白结合,维持其在细胞质的定位,避 免了 它同线粒体膜上的BCL-2蛋白家族的结合[26,27]。而当体内葡萄糖缺乏时,己糖 激酶处于 失活状态,BAD被激活,后者作用于BCL-2蛋白家族,使BCL-2失活,同时激活BAX,诱发肝细 胞凋亡[25]。
3.2 运动性缺血/再灌注中线粒体Ca2+含量与肝细胞凋亡的关系
在生理情况下,肝细胞内液Ca2+浓度约为0.2 μmol/L,细胞外液Ca2+浓度为1.3
mmol/L左右,即肝细胞始终处于胞内外1万倍浓度梯度的内环境中,说明肝细胞有着强有力 的Ca2+稳态调节机制,即质膜Ca2+通道、胞质膜Ca2+泵、Na+/Ca2+ 交换系统。研究表明[28,29]:由于以上Ca2+稳态机制紊乱所造成的肝细 胞内游离钙浓度升高会诱导肝细胞凋亡。
本研究发现,运动组大鼠肝线粒体的Ca2+浓度均升高,细胞凋亡数目增加,且具有显 著意义;尤其ME组线粒体Ca2+浓度增加具有高度显著意义;HE组Ca2+浓度显著 高于ME组;但前者细胞凋亡数目却显著低于后者。
长时间的力竭运动导致缺氧、肝糖原耗竭,加之OFR损伤线粒体结构和功能,导致胞内AT P合成减少;力竭运动导致儿茶酚氨分泌增多,与工作细胞细胞膜上的G蛋白偶联受体接合, 激活了位于细胞膜内侧的效应器酶——磷酯酶、环一磷酸腺苷酶,后者通过各自的途径导致 细胞膜、内质网膜上的ca2+通道打开;引起内质网内ca2+的短暂释放。ATP缺 乏还导致胞膜Ca2+泵排Ca2+能力和内质网膜Ca2+-Mg2+-ATP酶摄C a2+能力下降,Ca2+滞留于胞内。氧化性应激引起胞膜Ca2+通道蛋白变构 、内质网Ca2+通道蛋白功能性巯基结构改变,导 致Ca2+大量异常释放,胞内Ca2+升高。胞质内钙离子的升高会刺激线粒体膜内 膜上的Ca2+泵,从而使线粒体摄ca2+能力增强,以减轻胞质ca2+增加对 运动能力的降低作用。进入线粒体内的ca2+一方面会抑制了丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶 和?-酮成二酸脱氢酶的活性[30],从而影响氧 化磷酸化;另一面会导致钙离子在线粒体内的积累,从而改变线粒体内膜的极化状态,干扰 氧化磷酸化偶联,这两个方面的因素均会导致ATP的生成量减少,导致细胞凋亡的发生。此 时如果胞质ca2+继续升高,大于10umol将会引起线粒体内ca2+超载,诱发PTP 开放[31],cyt C和凋亡蛋白起始因子释放进入胞质,引起细胞凋亡;PTP开放后,水分子进入线粒体导致其 肿张甚至崩溃,随之ca2+外溢,使细胞质ca2+突增,诱发细胞凋亡。钙离子还 与钙调蛋白(CaM)结合,并激活各种蛋白激酶,诱发细胞凋亡。
运动组组间Ca2+浓度差异的原因可能是:HE组由于运动强度大,缺血再灌注程度远远 超 过ME组。缺血期供氧不足,一方面导致细胞内ATP量急速下降,ATP依赖性 Na+-K+泵的 正常 功能受影响,胞内[Na+]增加;另一方面使糖酵解作用增强,细胞内[H+]升高。而 肝血流量减少同时引起随血液流出的H+减少,故肝细胞胞浆内H+持续升高。升高的[H +]会激活Na+-H+交换体,使细胞内的[Na+]升高,由于此时PH值较小,Na+-Ca 2+交换体的活性受抑制,故通过该交换体进入细胞内Ca2+的量较少。运动后再 灌注期,由于血流量增加,细胞外的[H+]很快被清除并恢复到正常水平,Na+-H+和 Na+-Ca2+转换体功能增强,使胞浆内的[Ca2+]进一步增加[32,33 ]以致于超载,如直接测量缺血再灌注后钙离子的浓度发现,缺血期内的Ca2+浓度 增加,再灌注期初期Ca2+的内流较缺血期显著增加并最终导致超载[34]。
尽管缺血再灌注中HE组Ca2+浓度显著高于ME组,但是前者细胞凋亡数目却显著低于后 者,表明肝细胞胞浆内的Ca2+突升仅仅是诱发细胞凋亡的一个因素,其它因素如肝细 胞氧化应激程度,可能是决定肝细胞凋亡的更重要因素。
4 结 论
1) 力竭运动可导致肝细胞凋亡,运动性缺血/再灌注引起的肝细胞氧化应激及钙离子超载是 导致肝细胞凋亡的重要因素。
2) 中等强度急性力竭运动更易于导致肝细胞凋亡,其原因可能同长时间力竭运动引起中暑 或严重缺水,进而导致恢复期内中性粒细胞呼吸爆发。
3) 相对于钙离子超载,运动性缺血/再灌注引起的肝细胞氧化应激可能是导致肝细胞凋亡的 更重要因素。
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