【摘 要】
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目的 构建人miRNA let-7a2真核表达质粒,检测其在肺癌细胞A549中的表达.方法 以人肺腺癌A549细胞总RNA为模板,将RT-PCR扩增let-7a2的前体(pre-let7a2)序列,克隆至pSilencer4.
【机 构】
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山东大学,医学院生物化学与分子生物学研究所,济南,250012;山东大学,附属省立医院耳鼻喉头颈外科,济南,250021;山东大学,附属省立医院内分泌科,济南,250021
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目的 构建人miRNA let-7a2真核表达质粒,检测其在肺癌细胞A549中的表达.方法 以人肺腺癌A549细胞总RNA为模板,将RT-PCR扩增let-7a2的前体(pre-let7a2)序列,克隆至pSilencer4.1-CMV neo表达载体中,构建pSilencer4.1-let7a2重组质粒,转染A549细胞,采用RT-PCR法检测pre-let7a2的表达;构建let-7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR-Report-let7a2T,与pSilencer4.1-let7a2质粒共转染A549细胞,测定相对荧光素酶活性,以检测成熟let7a2在A549细胞中的表达及作用;采用MTT比色法检测pSilencer4.1-let7a2转染对A549细胞增殖的影响.结果 构建的人let-7a2真核表达质粒pSilencer4.1-let7a2和let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR-Report-let7a2T经酶切及测序鉴定正确;pSilencer4.1-let7a2质粒转染A549细胞后,RT-PCR检测pre-let7a2表达较对照组明显增强;MTT比色法显示let-7a2对A549细胞增殖有抑制作用.pSilencer4.1-let7a2质粒和pMIR-Report-let7a2T质粒典转染A549细胞后,通过报告基因检测相对荧光素酶活性较对照纽降低,显示let-7a2表达质粒转染A549细胞后,可有效表达let-7a2并转变为成熟的具有生物学活性的let-7a2.结论 成功构建了人let-7a2真核表达质粒,并在肺腺癌细胞A549中有效表达.
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