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【中图分类号】R730. 5【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2014）10
【摘要】目的：探讨姜黄素对P糖蛋白介导的胃癌多药耐药的逆转作用及其可能的分子机制。方法：采用二苯基溴化四氮唑蓝法检测人胃癌细胞株加药后的增殖，碘化丙啶染色法检测细胞凋亡率，Westernblot法检测P-AKT和 P-gp的表达量。结果： 姜黄素合用阿霉素处理细胞48h，阿霉素的浓度在0.05～5ug/ml 时，加入姜黄素25umol/l，耐药细胞生存率下降明显（P<0.05），尤以阿霉素0.25ug/ml和姜黄素25umol/l二者联合使用时耐药细胞生存率下降最明显。单用阿霉素组细胞的凋亡率为（13.2±1.9）%，采用在阿霉素基础上联合使用姜黄素后细胞凋亡率为（21.3±2.8）%，与单独使用阿霉素相比，阿霉素与姜黄素联合使用诱导细胞凋亡的作用显著增强（P<0.05）。与单用阿霉素0.25 ug/ml相比，联合使用姜黄素后p-Akt和 P-gp的表达量明显降低（P<0.01），2组间Akt的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。结论：姜黄素不增加阿霉素对SGC7901细胞毒性作用；对于SGC7901细胞株，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性；姜黄素明显抑制了p-Akt和 P-gp蛋白的表达。姜黄素可能通过抑制Akt信号通路降低 P-gp的表达进而逆转多药耐药。
【关键词】姜黄素；P糖蛋白；阿霉素；多药耐药；逆转
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位[1]，然而肿瘤多药耐药性的出现严重影响了胃癌的治疗效果，抑制或者逆转胃癌多药耐药对于胃癌的治疗具有重要意义[2]。研究肿瘤MDR及其预防与逆转是肿瘤化疗中函待解决的问题，亦是目前肿瘤研究的难点及热点领域。如何让化疗药物增效减毒是目前肿瘤化疗中函待解决的另一个问题。姜黄素前期研究发现，具有良好的抗肿瘤作用。
1材料与方法
1.1材料 姜黄素、二苯基溴化四氮唑蓝、二甲基亚砜均购自美国 Sigma公司，阿霉素购自深圳万乐药业公司。DMEM培养基购自 Gibco公司，胃癌耐药株K562/A02由上海拜力生物科技有限公司提供。细胞在37℃，5%CO2条件下培养，初始时在含0.5mg/l 浓度的阿霉素、10%胎牛血清的 DMEA培养基中培养，实验前2d换无药培养基培养。
1.2方法
1.2.1药物配制姜黄素溶解在DMSO后，采用无血清培养基配成药物浓度5×10mol/L储备液，使DMSO终浓度 <0.1%（V/V），贮存液置于 -20℃冰箱中避光保存。用 5%葡萄糖溶液将阿霉素配成10mg/ml的稀释液，置于 -4℃冰箱中保存，使用前用 10%小牛血清的RPMI1640培养基稀释成所需药物浓度。
1.2.2 MTT法 将对数生长期的细胞以 2×10个/mL浓度接种于96孔培养板中，每孔体积200 μg/L。培养箱中培养24h后，吸尽每孔培养液，实验组Ⅰ分别加入不同浓度的阿霉素，实验组Ⅱ在加入不同浓度的阿霉素后联合使用姜黄素。阿霉素终浓度分别为0.05，0.1，0.25，1.5，5ug/ml，姜黄素终浓度为25umol/l。对照组Ⅰ为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组Ⅱ为仅加细胞的阴性对照，培养48h后，每孔加入20μl的MTT 液（浓度为5mg/ml），继续培养4h后终止培养，吸弃上清液后，每孔加150μl的DMSO，振荡器上振荡10min 使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm 处的检测光吸收值（A），空白孔较零。以上各浓度组设3个复孔，取平均值，细胞存活率（IC）=实验组平均A值/阴性对照组平均A值。
1.2.3 Westernblot法 将处于对数生长期的SGC7901细胞调整细胞终浓度为1×10个/mL后，接种于25cm2培养瓶，分为2组：阿霉素组（0.25ug/ml）、阿霉素及姜黄素组（0.25ug/ml、25umol/l）培养48h后，收集2组细胞，用Westernblot法检测pAKT、Akt和 P-gp的表达量。
1.2.4凋亡的检测 将对数生长期的SGC7901细胞调整细胞浓度为 1×10个/mL后，接种在6孔板中，分组方法：一组加入阿霉素，使其终浓度为血浆峰值浓度2.5g/mL；另外一组加入0.25g/mL阿霉素和2.0mol/mL姜黄素，培养箱中培养48h。收集各组细胞，预冷75%乙醇固定，然后吹打成单细胞悬液，4℃放置30min后，在离心机上采用1000r/min离心20min；加磷酸盐缓冲液（PBS）离心，去除固定液，加入200LIRNaseA（1mg/mL）37℃水浴箱中孵育30min，然后每孔加入500ulPI（10g/mL）染色液，充分混匀，4℃条件下避光30min ，上机检测，记录激发波488nm 处红色荧光。用亚G1期法分析凋亡细胞，测定细胞的凋亡率，以Cell Quest 软件分析检测结果。公式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.3统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量数据以（x±s）表示，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1姜黄素合用阿霉素对细胞生长的影响作用 处理48h，阿霉素的浓度在0.05～5 ug/ml时，加入姜黄素25 umol/l，耐药细胞生存率下降明显（P<0.01），尤以阿霉素0.25 ug/ml和姜黄素25umol/l作用时耐药细胞生存率下降最明显，见图 1。
2.2阿霉素及姜黄素对SGC7901细胞凋亡率的影响 阿霉素及姜黄素对 SGC7901细胞凋亡率的影响见图2。结果显示，单用阿霉素组細胞的凋亡率为（13.2±1.9）%，采用在阿霉素基础上联合使用姜黄素后细胞凋亡率为（21.3±2.8）%，与单独使用阿霉素比，阿霉素与姜黄素联合使用诱导细胞凋亡的作用显著增强（P<0.05）。
2.3姜黄素对SGC7901细胞的p-Akt、Akt和P-gp表达的影响 姜黄素对SGC7901细胞的p-Akt、Akt和 P-gp表达的影响详见表1及图3。与单用阿霉素 0.25ug/ml相比，联合使用姜黄素后 p-Akt和P-gp的表达量明显降低（P<0.05），2组间 Akt的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。
3讨论
前期大量研究显示磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号转导通路，通过诱导肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、促进肿瘤血管的形成及拮抗放化疗等作用在肿瘤的演变过程中起着重要的作用，p-Akt在多种肿瘤组织中表达明显升高，靶向作用于Akt的药物对于肿瘤的治疗具有重要意义，本研究阐明了姜黄素逆转胃癌MDR可能的分子作用机制，为寻找安全、高效、低毒、天然的肿瘤靶向治疗药物提供重要实验依据，将为开拓姜黄素抗肿瘤治疗的新领域提供了新的思路，临床应用前景广阔。
[基金项目] 湖南省科技厅科研项目（项目编号：2013SK3278）
参考文献
[1]ZahediP，DeSouzaR，HuynhL，etal.Combinationdrugdeliverystrategyforthetreatmentofmultidrugresistantovariancancer[J].MolPharm，2011，8（1）：260-269.
[2]Adamusg，ChoiD，RaghunathA，etal.Signicance of Anti-retinal Autoantibodies in Cancer associatedRetinopathy with Gynecologicaical Cancers [J].JClin Expophthalmol，2013，4（6）：307.
【摘要】目的：探讨姜黄素对P糖蛋白介导的胃癌多药耐药的逆转作用及其可能的分子机制。方法：采用二苯基溴化四氮唑蓝法检测人胃癌细胞株加药后的增殖，碘化丙啶染色法检测细胞凋亡率，Westernblot法检测P-AKT和 P-gp的表达量。结果： 姜黄素合用阿霉素处理细胞48h，阿霉素的浓度在0.05～5ug/ml 时，加入姜黄素25umol/l，耐药细胞生存率下降明显（P<0.05），尤以阿霉素0.25ug/ml和姜黄素25umol/l二者联合使用时耐药细胞生存率下降最明显。单用阿霉素组细胞的凋亡率为（13.2±1.9）%，采用在阿霉素基础上联合使用姜黄素后细胞凋亡率为（21.3±2.8）%，与单独使用阿霉素相比，阿霉素与姜黄素联合使用诱导细胞凋亡的作用显著增强（P<0.05）。与单用阿霉素0.25 ug/ml相比，联合使用姜黄素后p-Akt和 P-gp的表达量明显降低（P<0.01），2组间Akt的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。结论：姜黄素不增加阿霉素对SGC7901细胞毒性作用；对于SGC7901细胞株，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性；姜黄素明显抑制了p-Akt和 P-gp蛋白的表达。姜黄素可能通过抑制Akt信号通路降低 P-gp的表达进而逆转多药耐药。
【关键词】姜黄素；P糖蛋白；阿霉素；多药耐药；逆转
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位[1]，然而肿瘤多药耐药性的出现严重影响了胃癌的治疗效果，抑制或者逆转胃癌多药耐药对于胃癌的治疗具有重要意义[2]。研究肿瘤MDR及其预防与逆转是肿瘤化疗中函待解决的问题，亦是目前肿瘤研究的难点及热点领域。如何让化疗药物增效减毒是目前肿瘤化疗中函待解决的另一个问题。姜黄素前期研究发现，具有良好的抗肿瘤作用。
1材料与方法
1.1材料 姜黄素、二苯基溴化四氮唑蓝、二甲基亚砜均购自美国 Sigma公司，阿霉素购自深圳万乐药业公司。DMEM培养基购自 Gibco公司，胃癌耐药株K562/A02由上海拜力生物科技有限公司提供。细胞在37℃，5%CO2条件下培养，初始时在含0.5mg/l 浓度的阿霉素、10%胎牛血清的 DMEA培养基中培养，实验前2d换无药培养基培养。
1.2方法
1.2.1药物配制姜黄素溶解在DMSO后，采用无血清培养基配成药物浓度5×10mol/L储备液，使DMSO终浓度 <0.1%（V/V），贮存液置于 -20℃冰箱中避光保存。用 5%葡萄糖溶液将阿霉素配成10mg/ml的稀释液，置于 -4℃冰箱中保存，使用前用 10%小牛血清的RPMI1640培养基稀释成所需药物浓度。
1.2.2 MTT法 将对数生长期的细胞以 2×10个/mL浓度接种于96孔培养板中，每孔体积200 μg/L。培养箱中培养24h后，吸尽每孔培养液，实验组Ⅰ分别加入不同浓度的阿霉素，实验组Ⅱ在加入不同浓度的阿霉素后联合使用姜黄素。阿霉素终浓度分别为0.05，0.1，0.25，1.5，5ug/ml，姜黄素终浓度为25umol/l。对照组Ⅰ为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组Ⅱ为仅加细胞的阴性对照，培养48h后，每孔加入20μl的MTT 液（浓度为5mg/ml），继续培养4h后终止培养，吸弃上清液后，每孔加150μl的DMSO，振荡器上振荡10min 使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm 处的检测光吸收值（A），空白孔较零。以上各浓度组设3个复孔，取平均值，细胞存活率（IC）=实验组平均A值/阴性对照组平均A值。
1.2.3 Westernblot法 将处于对数生长期的SGC7901细胞调整细胞终浓度为1×10个/mL后，接种于25cm2培养瓶，分为2组：阿霉素组（0.25ug/ml）、阿霉素及姜黄素组（0.25ug/ml、25umol/l）培养48h后，收集2组细胞，用Westernblot法检测pAKT、Akt和 P-gp的表达量。
1.2.4凋亡的检测 将对数生长期的SGC7901细胞调整细胞浓度为 1×10个/mL后，接种在6孔板中，分组方法：一组加入阿霉素，使其终浓度为血浆峰值浓度2.5g/mL；另外一组加入0.25g/mL阿霉素和2.0mol/mL姜黄素，培养箱中培养48h。收集各组细胞，预冷75%乙醇固定，然后吹打成单细胞悬液，4℃放置30min后，在离心机上采用1000r/min离心20min；加磷酸盐缓冲液（PBS）离心，去除固定液，加入200LIRNaseA（1mg/mL）37℃水浴箱中孵育30min，然后每孔加入500ulPI（10g/mL）染色液，充分混匀，4℃条件下避光30min ，上机检测，记录激发波488nm 处红色荧光。用亚G1期法分析凋亡细胞，测定细胞的凋亡率，以Cell Quest 软件分析检测结果。公式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.3统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量数据以（x±s）表示，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1姜黄素合用阿霉素对细胞生长的影响作用 处理48h，阿霉素的浓度在0.05～5 ug/ml时，加入姜黄素25 umol/l，耐药细胞生存率下降明显（P<0.01），尤以阿霉素0.25 ug/ml和姜黄素25umol/l作用时耐药细胞生存率下降最明显，见图 1。
2.2阿霉素及姜黄素对SGC7901细胞凋亡率的影响 阿霉素及姜黄素对 SGC7901细胞凋亡率的影响见图2。结果显示，单用阿霉素组細胞的凋亡率为（13.2±1.9）%，采用在阿霉素基础上联合使用姜黄素后细胞凋亡率为（21.3±2.8）%，与单独使用阿霉素比，阿霉素与姜黄素联合使用诱导细胞凋亡的作用显著增强（P<0.05）。
2.3姜黄素对SGC7901细胞的p-Akt、Akt和P-gp表达的影响 姜黄素对SGC7901细胞的p-Akt、Akt和 P-gp表达的影响详见表1及图3。与单用阿霉素 0.25ug/ml相比，联合使用姜黄素后 p-Akt和P-gp的表达量明显降低（P<0.05），2组间 Akt的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。
3讨论
前期大量研究显示磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号转导通路，通过诱导肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、促进肿瘤血管的形成及拮抗放化疗等作用在肿瘤的演变过程中起着重要的作用，p-Akt在多种肿瘤组织中表达明显升高，靶向作用于Akt的药物对于肿瘤的治疗具有重要意义，本研究阐明了姜黄素逆转胃癌MDR可能的分子作用机制，为寻找安全、高效、低毒、天然的肿瘤靶向治疗药物提供重要实验依据，将为开拓姜黄素抗肿瘤治疗的新领域提供了新的思路，临床应用前景广阔。
[基金项目] 湖南省科技厅科研项目（项目编号：2013SK3278）
参考文献
[1]ZahediP，DeSouzaR，HuynhL，etal.Combinationdrugdeliverystrategyforthetreatmentofmultidrugresistantovariancancer[J].MolPharm，2011，8（1）：260-269.
[2]Adamusg，ChoiD，RaghunathA，etal.Signicance of Anti-retinal Autoantibodies in Cancer associatedRetinopathy with Gynecologicaical Cancers [J].JClin Expophthalmol，2013，4（6）：307.