【摘 要】
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目的:构建抗CD20嵌合抗体的真核表达载体并实现在真核细胞中的表达.方法:采用RT-PCR,从分泌鼠源抗人CD20抗体的杂交瘤细胞系1-28中钓取其轻、重链基因,连接至T载体,进行序列
【机 构】
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军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室
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目的:构建抗CD20嵌合抗体的真核表达载体并实现在真核细胞中的表达.方法:采用RT-PCR,从分泌鼠源抗人CD20抗体的杂交瘤细胞系1-28中钓取其轻、重链基因,连接至T载体,进行序列测定.还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗CD20单克隆抗体(mAb)1-28的轻、重链蛋白,切取轻链及重链条带,质谱测定氨基酸序列,Biolynx和pepeseq软件分析可信度.对比所测DNA序列与蛋白序列,确定所钓取基因的正确性.将mAb 1-28轻重链可变区基因,连接至表达载体pCMV-VH和pCMV-VL,构建成嵌合抗体C1-28的轻链真核表达载体C1-28L及重链真核表达载体C1-28H.PCR、酶切及序列测定以确定连入基因的正确性.脂质体介导法将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,RT-PCR检测mRNA水平的表达,夹心ELISA法检测蛋白表达量,Western blot检测目的蛋白的大小.结果:钓取到mAb1-28基因.mAb部分蛋白序列测定结果与根据所钓取基因推出的蛋白序列相对应.成功构建了嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达,表达量可达257 mg/L,其相对分子质量(Mr)与人IgG的Mr一致.结论:为后续研究嵌合抗CD20抗体对非霍奇金淋巴瘤的治疗提供了一定的依据.
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