【摘 要】
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目的:构建携带突变Kras基因,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入两种不同的肝细胞株中表达。方法:PCR扩增突变Kras目的基因,将该全长基因定向克
【机 构】
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中山大学附属中山医院肿瘤放疗科,中山大学肿瘤防治中心鼻咽科,
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目的:构建携带突变Kras基因,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入两种不同的肝细胞株中表达。方法:PCR扩增突变Kras目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。并利用脂质体转染人肝癌细胞株Huh7.5和鸡肝癌细胞株LMH,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察Kras-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;用Western Blotting方法验证Kras蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-Kras重组质粒构建正确,将EGFP报告基因融合在突变的Kras基因的3’端;在Huh 7.5和LMH中均观察到了绿色荧光,转染率分别为19%和53%;Western Blotting也检测到融合蛋白的表达。结论:通过基因克隆方法成功构建了pEGFP-N1-Kras重组质粒载体,并且在Huh7.5和LMH中均稳定表达,为下一步筛选针对突变Kras基因的靶向药物奠定了基础。
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