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[摘要]目的：研究植物去屑组合物的最优提取工艺，以糠秕马拉色菌为供试菌，测定其的抑菌效果。方法：通过管碟法溅试抑菌效果，通过单因素试验和正交试验确定植物去屑组合物的最优提取工艺。结果：植物去屑组合物最优提取工艺为70%乙醇回流提取，提取料液比1：25，提取时间2h，提取温度65℃时，植物去屑组合物的抑菌效果最优。结论：植物去羁组合物醇提物对糠秕马拉色菌的抑菌活力为高度敏感。
[关键词]植物去屑组合物，糠秕马拉色菌，提取，抑菌
马拉色菌是形成头皮屑的重要因素之一，马拉色菌的消长与头皮屑的多少具有直接相关性。目前，抑制马拉色菌的药物研究主要以化学类的抗真菌制剂为主，如酮康唑、氯咪巴唑、吡硫翁锌等，但此类物质刺激性较大，而且容易产生耐药性。以常用去屑剂吡硫翁锌（ZPT）为例，张旋等研究证明ZPT对麦穗鱼、青鱂、直突摇蚊亚科2龄幼虫属剧毒物质。SarahD.等研究指出，ZPT可能导致人类角质形成细胞和黑素细胞的热休克并引起DNA损伤。虽然，早在1981年美国FDA就公布并认可ZPT在微量用于日用品成分的情况下对人体没有危害，但此类物质仍存在一定的安全风险。因此，研究复方植物去屑剂具有重要意义。
本研究复方中药植物添加剂采用大黄、苦参、白蒺藜、生黄精，合理配伍，相互协调，共奏去屑止痒之效。大黄，苦寒泄热，去瘀血，荡涤实热积滞；苦参，清热解毒、燥湿利尿、祛风杀虫；白蒺藜，祛风止痒，行气活血；生黄精，补肾益精，滋阴润煤，是多种复方滋补药剂的重要组分，复方中药合理配伍，共奏良效。
一、材料
1.受试中药提取物
植物去屑组合物，购白同仁堂国药店。
阳性对照ZPT，购自滨海明红精细化工有限公司。
溶剂，乙醇，丙二醇，丁二醇，购自国药集团化学试剂有限公司。
2.菌种
糠枇马拉色菌ATCC44344，购自广东微生物菌种保藏中心。
3.培养基
橄榄油培养基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母浸膏0.1g，单硬脂酸甘油酯2.5g，吐温-802mL，橄榄油40mL，琼脂18g，水1L。
4.仪器
RE-2000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SZCL-L型数显智能控温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），TELSTAR mini-V/PCR型超净工作台（西班牙泰事达丁ELSTAR），SHP-150型生化培养箱（上海森信实验仪器责任有限公司），LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅（上海华线医用核子仪器有限公司）。
二、方法
1.植物去屑组合物提取液的制备
植物去屑组合物，粉碎，称量10g植物去屑组合物粉末，装入500mL三口圆底烧瓶中，加入适量提取溶剂，在恒温水浴锅中回流提取，粗过滤，抽滤，旋转蒸发减压浓缩去除乙醇，加丙二醇复溶至0.2g·mL-1的植物去屑组合物提取液，灭菌保存，备用。
2.抑菌效果的测定
菌种的活化：菌种购买来时均为装入安瓿管中的冻干粉。实验时，用75%的酒精擦洗安瓿管，然后用酒精灯灼烧安瓿管的顶端，接着迅速滴加无菌水使其冷却，再用镊子敲掉安瓿管头部，用移液枪滴加0.1mL左右的液体培养基于安瓿管中，用手震荡摇匀，此时安瓿管中菌种冻干粉为黏稠状。接下来就可以用接菌环挑菌接入相对应的平板和斜面上进行活化，置于35℃恒温培养箱中培养48h。
菌悬液的制备：取活化好的菌种若干，在无菌条件下，分别挑取一环已活化好的菌种放入9m L无菌水中震荡摇匀、分级制成一系列菌悬液。麦氏比浊管制成菌悬液浓度为106cfu/mL。
抑菌实验（管碟法）：将预先熔化好、并灭菌处理过的培养基，轻轻摇匀后倾注平板，冷却凝固，每个平板15mL左右。取马拉色菌的菌悬液200μL于培养基中，均匀涂布，盖好平皿，置室温干燥5min。在每个培养皿上方均匀摆放3个牛津杯，3个牛津杯中每个注入260μL同种中药提取液，作为3个平行，以无菌水为阴性对照，同时选用常用抗真菌剂ZPT做阳性对照。将培养皿放入35℃培养箱培养72h，然后取出，观察，拍照，用游标卡尺测定抑菌圈直径。
体外抑菌定性结果的判定标准：抑菌圈直径小于8mm为不敏感（-），8～13mm为低度敏感（+），13～19mm为中度敏感（+），19mm以上为高度敏感（+++）。3次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格，阴性对照组无抑菌环产生，否则试验无效。
3.提取方法的选择
分别用水浴提取、回流提取、超声提取、微波提取、闪式提取5种提取方法提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取溶剂70%乙醇，提取时间60min，提取温度75℃。以糠秕马拉色菌为公试菌株，采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，通过比较5种提取方法对植物去屑组合物抑提取物的菌效果确定适合的提取方法。
4.提取溶剂的选择
分别用水、乙醇、丙二醇、丁二醇4种提取溶剂提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取时间60min，提取温度75℃。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，通过比较4种溶剂提取对植物去屑组合物的抑菌效果确定适合的提取溶剂。
5.单因素试验
通过单因素试验研究料液比、乙醇溶液体积分数、提取时间、提取温度对植物去屑组合物抑菌效果的影响。
1）乙醇体积分数对提取物抑菌效果的影响
分别用乙醇体积分数为10%、30%、50%、70%、90%回流提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取时间60min，提取温度75℃。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，确定适合的浓度。 2）提取时间对提取物抑菌效果的影响
分别按时间为0.5、1、1.5、2、3h回流提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取溶剂70%乙醇，提取温度75℃。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，确定适合的提取时间。
3）提取温度对提取物抑菌效果的影响
分别在温度为45、55、65、75、85℃的恒温电热加热套中回流提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取溶剂70%乙醇，提取时间60min。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，确定适合的提取温度。
4）料液比对提取物抑菌效果的影响
分别按料液比为1：5、1：10、1：15、1：20、1：25回流提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：提取溶剂70%乙醇，提取时间60min，提取温度75℃。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，确定适合的料液比。
6.提取工艺条件的优化
在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验，以料液比、乙醇溶液体积分数、提取时间、提取温度4个因素、3个水平进行正交试验，优化植物去屑组合物抑菌成分的提取工艺，因素水平设计见表1。
三、结果与分析
1.提取方法对植物去屑组合物抑菌效果的影响
考察5种提取方法对植物去屑组合物抑菌效果的影响，由表2可知，回流提取方法抑菌效果最好，因此确定回流提取为最终提取方法。
2.提取溶剂的选择
考察4种提取溶剂对植物去屑组合物抑菌效果的影响，由表3可知，乙醇溶液提取物的抑菌效果最好，因此确定乙醇作为提取溶剂。
3.乙醇体积分数对提取物抑菌效果的影响
由图3可知，随着乙醇溶液体积分数的提高，抑菌圈增大，体积分数在70%时抑菌效果最好。体积分数继续增大时，一些醇溶性杂质成分溶出，干扰因素增多，导致抑菌效果下降。因此，乙醇体积分数选择在70%较为适宜。
由图4可知，随着提取时间的延长，植物去屑组合物抑菌圈逐渐增大，但增加的幅度并不明显，当提取温度为2h时提取物抑菌效果最好。提取时间继续延长时，提取液抑菌效果降低。原因可能是长时间的加热提取提取破坏了部分抑菌活性物质。因此，提取时间选择在2h。
由图5可以看出，随着提取温度的提高，抑菌圈增大，温度在75℃时抑菌效果最好。温度继续增加时，抑菌活性下降，可能是高温破坏了一些抑菌成分。因此提取温度选择在75℃较为适宜。
6.料液比对提取物抑菌效果的影响
由图6可以看出，随着料液比的增大，抑菌效果增加不明显，在1：10～1：15时，抑菌效果最好。料液比继续增大时，抑菌活性下降，原因可能是溶剂量增加，水溶性杂质溶出率增加，导致抑菌效果下降。因此料液比选择1：10～1：15较为适宜。
7.提取工艺条件的优化
由表4极差R值可知，四个因素对抑菌率影响程度B>C>A>D，即乙醇体积分数>反应时间>料液比>反应温度，由正交实验K值可知，最佳提取条件为A3B2C2D1，与正交表中最优抑菌组合A3B2C2D1不相符，重复A3B2C2D1试验，抑菌圈直径23.08mm，大于A3B2C2D1的21.87mm。因此植物去屑组合物抑菌成分最优提取条件为A3B2C2D1，即料液比1：25，乙醇体积分数70%，提取时间2h，提取温度65℃。
由表5对试验结果进行方差分析可知，因素B即乙醇体积分数对结果有显著性影响。
四、结论
乙醇回流提取植物去屑组合物中的活性成分，不仅提取工艺简单，而且容易实现工业化。本实验研究探讨了不同提取方法、提取溶剂、提取料液比、提取时间、提取温度对植物去屑组合物抑菌效果的影响，通过单因素试验和正交试验确定了植物去屑组合物抑菌活性物质的最佳提取工艺条件为：料液比1：25，70%乙醇，时间2h，温度65℃。
[关键词]植物去屑组合物，糠秕马拉色菌，提取，抑菌
马拉色菌是形成头皮屑的重要因素之一，马拉色菌的消长与头皮屑的多少具有直接相关性。目前，抑制马拉色菌的药物研究主要以化学类的抗真菌制剂为主，如酮康唑、氯咪巴唑、吡硫翁锌等，但此类物质刺激性较大，而且容易产生耐药性。以常用去屑剂吡硫翁锌（ZPT）为例，张旋等研究证明ZPT对麦穗鱼、青鱂、直突摇蚊亚科2龄幼虫属剧毒物质。SarahD.等研究指出，ZPT可能导致人类角质形成细胞和黑素细胞的热休克并引起DNA损伤。虽然，早在1981年美国FDA就公布并认可ZPT在微量用于日用品成分的情况下对人体没有危害，但此类物质仍存在一定的安全风险。因此，研究复方植物去屑剂具有重要意义。
本研究复方中药植物添加剂采用大黄、苦参、白蒺藜、生黄精，合理配伍，相互协调，共奏去屑止痒之效。大黄，苦寒泄热，去瘀血，荡涤实热积滞；苦参，清热解毒、燥湿利尿、祛风杀虫；白蒺藜，祛风止痒，行气活血；生黄精，补肾益精，滋阴润煤，是多种复方滋补药剂的重要组分，复方中药合理配伍，共奏良效。
一、材料
1.受试中药提取物
植物去屑组合物，购白同仁堂国药店。
阳性对照ZPT，购自滨海明红精细化工有限公司。
溶剂，乙醇，丙二醇，丁二醇，购自国药集团化学试剂有限公司。
2.菌种
糠枇马拉色菌ATCC44344，购自广东微生物菌种保藏中心。
3.培养基
橄榄油培养基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母浸膏0.1g，单硬脂酸甘油酯2.5g，吐温-802mL，橄榄油40mL，琼脂18g，水1L。
4.仪器
RE-2000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SZCL-L型数显智能控温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），TELSTAR mini-V/PCR型超净工作台（西班牙泰事达丁ELSTAR），SHP-150型生化培养箱（上海森信实验仪器责任有限公司），LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅（上海华线医用核子仪器有限公司）。
二、方法
1.植物去屑组合物提取液的制备
植物去屑组合物，粉碎，称量10g植物去屑组合物粉末，装入500mL三口圆底烧瓶中，加入适量提取溶剂，在恒温水浴锅中回流提取，粗过滤，抽滤，旋转蒸发减压浓缩去除乙醇，加丙二醇复溶至0.2g·mL-1的植物去屑组合物提取液，灭菌保存，备用。
2.抑菌效果的测定
菌种的活化：菌种购买来时均为装入安瓿管中的冻干粉。实验时，用75%的酒精擦洗安瓿管，然后用酒精灯灼烧安瓿管的顶端，接着迅速滴加无菌水使其冷却，再用镊子敲掉安瓿管头部，用移液枪滴加0.1mL左右的液体培养基于安瓿管中，用手震荡摇匀，此时安瓿管中菌种冻干粉为黏稠状。接下来就可以用接菌环挑菌接入相对应的平板和斜面上进行活化，置于35℃恒温培养箱中培养48h。
菌悬液的制备：取活化好的菌种若干，在无菌条件下，分别挑取一环已活化好的菌种放入9m L无菌水中震荡摇匀、分级制成一系列菌悬液。麦氏比浊管制成菌悬液浓度为106cfu/mL。
抑菌实验（管碟法）：将预先熔化好、并灭菌处理过的培养基，轻轻摇匀后倾注平板，冷却凝固，每个平板15mL左右。取马拉色菌的菌悬液200μL于培养基中，均匀涂布，盖好平皿，置室温干燥5min。在每个培养皿上方均匀摆放3个牛津杯，3个牛津杯中每个注入260μL同种中药提取液，作为3个平行，以无菌水为阴性对照，同时选用常用抗真菌剂ZPT做阳性对照。将培养皿放入35℃培养箱培养72h，然后取出，观察，拍照，用游标卡尺测定抑菌圈直径。
体外抑菌定性结果的判定标准：抑菌圈直径小于8mm为不敏感（-），8～13mm为低度敏感（+），13～19mm为中度敏感（+），19mm以上为高度敏感（+++）。3次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格，阴性对照组无抑菌环产生，否则试验无效。
3.提取方法的选择
分别用水浴提取、回流提取、超声提取、微波提取、闪式提取5种提取方法提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取溶剂70%乙醇，提取时间60min，提取温度75℃。以糠秕马拉色菌为公试菌株，采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，通过比较5种提取方法对植物去屑组合物抑提取物的菌效果确定适合的提取方法。
4.提取溶剂的选择
分别用水、乙醇、丙二醇、丁二醇4种提取溶剂提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取时间60min，提取温度75℃。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，通过比较4种溶剂提取对植物去屑组合物的抑菌效果确定适合的提取溶剂。
5.单因素试验
通过单因素试验研究料液比、乙醇溶液体积分数、提取时间、提取温度对植物去屑组合物抑菌效果的影响。
1）乙醇体积分数对提取物抑菌效果的影响
分别用乙醇体积分数为10%、30%、50%、70%、90%回流提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取时间60min，提取温度75℃。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，确定适合的浓度。 2）提取时间对提取物抑菌效果的影响
分别按时间为0.5、1、1.5、2、3h回流提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取溶剂70%乙醇，提取温度75℃。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，确定适合的提取时间。
3）提取温度对提取物抑菌效果的影响
分别在温度为45、55、65、75、85℃的恒温电热加热套中回流提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：料液比1：10，提取溶剂70%乙醇，提取时间60min。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，确定适合的提取温度。
4）料液比对提取物抑菌效果的影响
分别按料液比为1：5、1：10、1：15、1：20、1：25回流提取植物去屑组合物中的功效成分，试验条件为：提取溶剂70%乙醇，提取时间60min，提取温度75℃。采用管碟法对植物去屑组合物抑菌活性进行测定，确定适合的料液比。
6.提取工艺条件的优化
在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验，以料液比、乙醇溶液体积分数、提取时间、提取温度4个因素、3个水平进行正交试验，优化植物去屑组合物抑菌成分的提取工艺，因素水平设计见表1。
三、结果与分析
1.提取方法对植物去屑组合物抑菌效果的影响
考察5种提取方法对植物去屑组合物抑菌效果的影响，由表2可知，回流提取方法抑菌效果最好，因此确定回流提取为最终提取方法。
2.提取溶剂的选择
考察4种提取溶剂对植物去屑组合物抑菌效果的影响，由表3可知，乙醇溶液提取物的抑菌效果最好，因此确定乙醇作为提取溶剂。
3.乙醇体积分数对提取物抑菌效果的影响
由图3可知，随着乙醇溶液体积分数的提高，抑菌圈增大，体积分数在70%时抑菌效果最好。体积分数继续增大时，一些醇溶性杂质成分溶出，干扰因素增多，导致抑菌效果下降。因此，乙醇体积分数选择在70%较为适宜。
由图4可知，随着提取时间的延长，植物去屑组合物抑菌圈逐渐增大，但增加的幅度并不明显，当提取温度为2h时提取物抑菌效果最好。提取时间继续延长时，提取液抑菌效果降低。原因可能是长时间的加热提取提取破坏了部分抑菌活性物质。因此，提取时间选择在2h。
由图5可以看出，随着提取温度的提高，抑菌圈增大，温度在75℃时抑菌效果最好。温度继续增加时，抑菌活性下降，可能是高温破坏了一些抑菌成分。因此提取温度选择在75℃较为适宜。
6.料液比对提取物抑菌效果的影响
由图6可以看出，随着料液比的增大，抑菌效果增加不明显，在1：10～1：15时，抑菌效果最好。料液比继续增大时，抑菌活性下降，原因可能是溶剂量增加，水溶性杂质溶出率增加，导致抑菌效果下降。因此料液比选择1：10～1：15较为适宜。
7.提取工艺条件的优化
由表4极差R值可知，四个因素对抑菌率影响程度B>C>A>D，即乙醇体积分数>反应时间>料液比>反应温度，由正交实验K值可知，最佳提取条件为A3B2C2D1，与正交表中最优抑菌组合A3B2C2D1不相符，重复A3B2C2D1试验，抑菌圈直径23.08mm，大于A3B2C2D1的21.87mm。因此植物去屑组合物抑菌成分最优提取条件为A3B2C2D1，即料液比1：25，乙醇体积分数70%，提取时间2h，提取温度65℃。
由表5对试验结果进行方差分析可知，因素B即乙醇体积分数对结果有显著性影响。
四、结论
乙醇回流提取植物去屑组合物中的活性成分，不仅提取工艺简单，而且容易实现工业化。本实验研究探讨了不同提取方法、提取溶剂、提取料液比、提取时间、提取温度对植物去屑组合物抑菌效果的影响，通过单因素试验和正交试验确定了植物去屑组合物抑菌活性物质的最佳提取工艺条件为：料液比1：25，70%乙醇，时间2h，温度65℃。