【摘 要】
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目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物（PS6B-TT）中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证。方法:采用脱氧胆酸钠-盐酸沉淀法（NaDC/HCl）,取不同浓度的载体蛋白破伤风
【基金项目】
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“十二五”国家高技术发展研究计划(863计划)疫苗研发关键技术及产品研发项目(2012AA02A401)
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目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物（PS6B-TT）中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证。方法:采用脱氧胆酸钠-盐酸沉淀法（NaDC/HCl）,取不同浓度的载体蛋白破伤风类毒素（TT）,加入1%NaDC溶液混匀,离心后用Lowrry法检测上清中蛋白含量,以确定载体蛋白沉淀范围;用不同离子强度的氯化钠溶液稀释游离多糖对照品与TT的混合物,NaDC沉淀并离心后以蒽酮-硫酸法测定上清中多糖含量、计算回收率,确定游离多糖的最佳分离条件;以NaDC/HCl沉淀6B型多糖测定标准品并绘制标准曲线,与未经NaDC/HCl沉淀的标准品相比较,确定NaDC对蒽酮硫酸法测定结果的影响;由此建立NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法测定6B型结合物中游离多糖含量的方法,并对方法的专属性、准确度及精密度进行验证。结果:此方法沉淀载体蛋白浓度应控制在500μg·mL-1以下;选择终浓度0.3 mol·L-1氯化钠溶液作为6B型肺炎球菌结合物中游离多糖测定的稀释液;NaDC/HCl沉淀法对蒽酮硫酸法测定多糖含量基本无影响;游离多糖对照品与载体蛋白TT混合物经建立的NaDC/HCl法沉淀后多糖及蛋白回收率分别为98.25%及0;游离糖添加试验回收率均在90%100%;3批结合物游离糖含量测定值其试验内及试验间CV值均在10%以下。结论:本试验建立的NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法可有效分离6B型游离多糖与多糖蛋白结合物,并能够准确、稳定地测定结合物中的游离多糖含量。
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