【摘 要】
：
目的:分别构建人透明带蛋白(zona pellucida,ZP)基因ZP1、ZP2、ZP3、ZP4与荧光蛋白基因的融合蛋白表达载体,并在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞和卵母细胞中表达这些荧光标记的重组融合蛋白.方法:设计合适的PCR引物,采用GeneArt Gibson Assembly克隆技术,将荧光蛋白基因与人透明带基因形成融合基因片段,用特定的双酶分别酶切中间载体pENTR1A(no ccdB)和融合基因片段后,用T4 DNA连接酶将融合基因片段连入中间载体,
【机 构】
：
上海交通大学附属第六人民医院生殖医学中心,上海 200233;中南大学湘雅三医院医学检验系,湖南 长沙 410013
论文部分内容阅读
目的:分别构建人透明带蛋白(zona pellucida,ZP)基因ZP1、ZP2、ZP3、ZP4与荧光蛋白基因的融合蛋白表达载体,并在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞和卵母细胞中表达这些荧光标记的重组融合蛋白.方法:设计合适的PCR引物,采用GeneArt Gibson Assembly克隆技术,将荧光蛋白基因与人透明带基因形成融合基因片段,用特定的双酶分别酶切中间载体pENTR1A(no ccdB)和融合基因片段后,用T4 DNA连接酶将融合基因片段连入中间载体,再通过Gateway克隆技术将中间载体上的融合基因转入表达载体pInducer20,并对产物进行DNA测序.验证融合基因构建成功后,将含透明带融合基因的质粒进行转化,筛选阳性克隆并扩增、抽提质粒.用脂质体转染法将含融合基因的表达载体转染入CHO细胞,采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR)检测透明带融合基因mRNA的表达,用蛋白印迹法检测透明带融合蛋白的表达,并在激光共聚焦显微镜下观察透明带融合蛋白在CHO细胞内的表达及分布.结果:成功构建所需载体并转染CHO细胞;经RTPCR检测证实人透明带ZP1、ZP2、ZP3、ZP4 mRNA在CHO细胞中表达;经蛋白印迹法检测证实CHO细胞中有重组融合蛋白质的表达;在激光共聚焦显微镜下观察到重组融合蛋白在CHO细胞内表达和定位.结论:本研究成功构建了人类透明带4个基因的荧光融合蛋白表达质粒,以此为实验工具,今后可用于诊断卵子异常导致不孕的病因机制研究.
其他文献
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种以肿瘤性浆细胞(tumor plasma cell,PC)在骨髓中异常增殖为特点的血液系统恶性肿瘤,患者可出现全身多处骨质破坏及多种临床表现.在过去的20年中,随着自体造血干细胞移植、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和免疫治疗(CD38单抗、双特异性抗体、嵌合抗原受体T 细胞治疗)等治疗手段的发展, MM患者的生存期得到了显著延长.但由于MM患者的生存异质性较大,部分患者可生存超过10年,而部分患者的中位生存时间仅为1～2年,故精准评估患者的预后是MM
目的:探讨经阴道宫颈弹性超声成像联合宫颈长度测量预测中孕期孕妇自发性早产(spontaneous preterm birth,sPTB)的应用价值.方法:纳入2019年1月1日至2020年12月31日在我院进行产前检查的单胎妊娠孕妇431名,依据早产定义分为病例组(31例早产)和对照组(400例足月产),所有孕妇于中孕期采用经阴道超声测量宫颈长度(cervical length,CL),同时进行宫颈弹性超声成像,利用宫颈机能智能定量分析软件获得弹性超声参数,即弹性对比指数(elasticity contr
目的:分析报道1例干燥综合征(Sj?gren syndrome,SS)继发隐球菌性脑膜脑炎(cryptococcal meningoen-cephalitis,CM)患者,结合文献探讨自身免疫病继发CM的临床、病理特征及诊治方法.方法:分析2019年上海交通大学附属第六人民医院收治的1例SS继发CM患者的临床资料,并在国内外数据库中检索相关文献,汇总分析自身免疫病继发CM病例的临床、病理特征和诊治方法.结果:本例患者有SS病史,本次以头痛、发热及颅内压升高起病,经脑脊液墨汁染色涂片明确诊断为CM.患者经抗
目的:评估治疗前18氟-氟代脱氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucos,18F-FDG)正电子发射计算机体层显像(positron emission tomography and computed tomography,PET/CT)检查对结外自然杀伤细胞/T细胞淋巴瘤[extranodalnatural killer(NK)/T-cell lymphoma,ENKTL]的预后判断价值.方法:回顾分析60例新诊断为ENKTL并接受治疗前18FFDGPET/CT检查的患者.所有患者均采用基于培门
目的:探究人衰老关键蛋白1(Fibulin-1,FBLN1)作为血清标志物在结肠直肠癌(colorectal cancer,CRC)诊断中的价值.方法:选取81例CRC患者作为CRC组,50例结肠直肠息肉患者(息肉组)和50名健康体检者(健康组)作为对照,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测其血清FBLN1及癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)水平,并进行组间比较分析.结果:与血清CEA类似,CRC组的血
目的:比较磁共振全身扩散加权成像(whole body-diffusion weighted imaging,WB-DWI)结合T2WI抑脂序列(fat saturation T2-weighted imaging,FS-T2WI)及正电子发射计算机体层显像仪(positron emission tomography andcomputed tomography,PET/CT)在初发淋巴瘤分期诊断中的应用价值.方法:回顾性分析2014年5月至2020年9月上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科收治的初发、未
目的:探讨细支气管腺瘤的临床病理特征、诊断及鉴别诊断.方法:收集六安市人民医院2020年1月至12月收治的10例细支气管腺瘤病例,总结其临床资料、影像学检查结果、组织病理学特征及免疫组织化学(免疫组化)表型.结果:患者中男性4例,女性6例,发病年龄为49～79岁.大多患者均无明显临床症状,仅在胸部CT检查时发现肺部磨玻璃样结节.10例患者病灶均位于肺外周,切面大部分为灰白结节,质地中等或质地软,肿瘤与周围正常肺组织界限尚清楚.6例患者为近端型,4例患者为远端型.在光学显微镜下观察,肿瘤呈腺腔型、平坦型及乳
目的:对1例血型A wB亚型个体进行血清学鉴定和基因检测,探讨血型A wB亚型发生的分子学机制.方法:使用标准血清学实验方法对1例血型AwB亚型个体进行ABO血清学定型,并对其ABO基因7个外显子及其侧翼序列进行PCR扩增、基因克隆和测序分析;采用Chimera软件进行ABO基因编码糖基转移A酶(glycosyl trans-ferase A,GTA)突变体构建,用PyMOL软件作图并进行分析.结果:血清学鉴定结果显示该个体为AwB亚型.DNA克隆和基因测序分析结果显示,先证者的A基因为一个A1.02与A
目的:探讨胃神经鞘瘤(gastric schwannoma,GS)的临床病理学特征、诊断、鉴别诊断、治疗及预后.方法:2014年1月至2020年3月间,中国科学技术大学附属第一医院经病理确诊为各种类型胃肿瘤的手术标本共有17223例,其中GS有31例,约占0.18％,回顾性分析这31例GS患者的临床病理学特征和免疫表型,并复习相关文献,讨论GS的诊断、鉴别、治疗及预后.结果:31例GS患者中,男性为12例,女性为19例,年龄为22～70岁,中位年龄为51岁.其中20例患者术前影像学检查提示为胃肠道间质瘤(
目的:探讨超声检查在评估胎儿胸腺发育中的价值,同时观察母体服用优甲乐是否会影响胎儿胸腺发育.方法:收集2018年1月至2021年1月来我院超声科进行产前超声检查的健康孕妇311名(18～40周)(健康组),每名孕妇检查1次,另收集同期因甲状腺功能减退(甲减)而服用优甲乐治疗的孕妇31例(孕28周14例,孕34周17例)(优甲乐组).采用二维超声观察2组胎儿胸腺的形态、回声及大小,并测量胎儿胸腺前后径、横径、周长及面积.分析健康组各超声参数与胎龄间的相关性;比较2组胎儿胸腺相关参数的差异,探讨母体服用优甲乐