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摘要 目的：分析转移性结直肠癌（mCRC）中医治疗优势人群肠道菌群及TB淋巴细胞亚群分布特征及相关性。方法：选取2018年3月至2019年3月期间中国中医科学院西苑医院肿瘤科门诊或病房收治的mCRC患者40例作为研究对象，采用随机双盲、安慰剂对照临床研究方法，随机分为观察组与安慰剂组，治疗给予常规中医治疗加用祛邪胶囊，对照组在与观察组相同治疗基础上服用安慰剂胶囊。收集基线时患者的粪便样本及外周血样本并进行检测。根据入组患者3年随访的生存结局以及mCRC中医治疗优势人群判定标准，将患者分为中医治疗优势人群及非优势人群，分析2组间肠道菌群及TB淋巴细胞亚群的差异性及相关性。结果：肠道菌群Alpha多样性分析显示，中医治疗非优势人群相比优势人群具有更高的sobs指数且差异有统计学意义（115.17±19.25 vs.81.96±36.79，P=0.005），中医治疗优势人群具有更高比例的拟杆菌属（30.6% vs.23.9%，P=0.33）和普雷沃氏菌屬（5.7% vs.3.9%，P=0.69）;TB淋巴细胞亚群分析结果发现，中医治疗优势人群组较非优势人群组具有更高的双阴T细胞绝对值（89.6±82.0 vs.37.1±16.5，P=0.01）以及非HLA依赖细胞毒性T细胞（83.0±43.6 vs.28.4±18.3，P=0.01）;HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与粪厌氧棒状菌（Anaerostipes）呈显著负相关（P=0.04）。结论：mCRC中医治疗优势人群与非优势人群在肠道菌群分布以及TB淋巴细胞亚群特征方面存在显著差异且具有一定相关性，为进一步阐释中医优势人群特征及疗效机制提供了必要的科学依据。
关键词 转移性结直肠癌;中医药;优势人群;肠道菌群;淋巴细胞亚群
Analysis on Intestinal Flora and TB Lymphocyte Subsets of Traditional Chinese Medicine Beneficiaries in Metastatic Colorectal Cancer
YAN Yunzi1，2， SUN Lingyun2， XU Yuying1，2， CHEN Dongmei3， YAN Shaohua2，YANG Yufei2
（1 Graduate School， Beijing University of Chinese Medicine， Xiyuan Clinical Medical College， Beijing 10029， China; 2 Department of Oncology， Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Science， Beijing 100091， China; 3 China-Japan Friendship Hospital， Beijing 10029， China）
Abstract Objective：To analyze the distribution characteristics and correlation of intestinal flora and TB lymphocyte subpopulations in Chinese medicine beneficiaries of metastatic colorectal cancer（mCRC）. Methods：From March 2018 to March 2019， a total of 40 patients with mCRC admitted to the Oncology Department or Ward of Xiyuan Hospital of the Chinese Academy of Chinese Medical Sciences were selected as the research objects. A randomized double-blind， placebo-controlled clinical research method was used and the patients were randomly divided into a treatment groups and a placebo group. The treatment group was given conventional Chinese medicine treatment plus Quxie Capsules， and the control group was given placebo capsules on the basis of the same treatment as the treatment group. Stool samples and peripheral blood samples of patients at baseline were collected and tested. According to the survival outcome of the three-year follow-up of the enrolled patients and the criteria for determining the dominant group of Chinese medicine treatment of mCRC， the patients were divided into a dominant group and a non-dominant group of traditional Chinese medicine treatment. The difference and correlation of intestinal flora and TB lymphocyte subgroups between the 2 groups were analyzed.Results：The Alpha diversity analysis of the intestinal flora showed that the Chinese medicine in the treatment of non-beneficiaries populations had a higher SOBS index than the Chinese medicine beneficiaries populations group and there was a significant statistical difference （115.17±19.25 vs. 81.96±36.79， P=0.005）. Chinese medicine beneficiaries populations group had a higher proportion of Bacteroides （30.6% vs. 23.9%， P=0.33） and Prevotella （5.7% vs.3.9%， P=0.69）; the analysis of TB lymphocyte subsets found that the Chinese medicine beneficiaries populations group had a higher absolute value of double-negative T cells （89.6±82.0 vs. 37.1±16.5， P=0.01） and non-HLA dependent group than the other group （83.0±43.6 vs.28.4±18.3），P=0.01）; the absolute value of HLA-dependent cytotoxic T cells was significantly negatively correlated with Anaerostipes （P=0.04）. Conclusion：there are significant differences in the distribution of intestinal flora and the characteristics of TB lymphocyte subgroups between the dominant and non-advantaged groups of Chinese medicine treatment of mCRC， which provide a necessary scientific basis for further explaining the characteristics of the dominant group of traditional Chinese medicine and the mechanism of efficacy. Keywords Metastatic colorectal cancer; Traditional Chinese medicine; Dominant population; Intestinal flora; Lymphocyte subsets
中图分类号：R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.008
2021年国家癌症中心最新数据显示，2015年结直肠癌发病率为17.81%，居全部恶性肿瘤发病率第4位，结直肠癌死亡率为8.12%，居全部恶性肿瘤死亡率第5位，且发病率及死亡率呈上升趋势[1]。近十年来随着靶向治疗及免疫治疗的进展，转移性结直肠癌（Metastatic Colorectal Cancer，mCRC）患者的总生存期不断被延长，目前临床研究显示mCRC中位生存期可达3年[2]。尽管目前循证医学证据表明以化放疗、靶向及免疫治疗为基础的肿瘤规范化治疗能够为mCRC带来最大的临床获益，但上述现代医学治疗方法在带来疗效的同时，也增加了产生不良反应的风险，降低患者总体生命质量，带来个人及家庭经济负担，从而影响患者对治疗的依从性及耐受性。真实世界数据表明，RAS突变、右半结肠、高龄、体质差、经济状况差和治疗意愿不强的患者较难从西医规范治疗中获益，且这部分人群所占比例高达40%以上[3]。因此，临床试验及指南推荐与实际临床中所面临问题之间的差异是目前我国mCRC综合治疗领域中亟待正视与解决的困境之一。
近年来多项研究表明中西医结合治疗在延长mCRC患者生存期的同時也能够改善其生命质量，因此我国所特有的中西并重方案有望能够帮助更多患者得到获益[4-5]。在这一过程中，积极探索中医治疗mCRC的优势人群并阐释其特征及疗效机制，才能够与现有临床指南及规范化治疗方案优势互补，从而形成精准、个体化的诊疗策略。本团队经过10余年来的不懈努力，通过前期随机对照试验（Randomized Controlled Trial，RCT）及队列研究初步明确mCRC中医治疗优势人群特征为：女性、KRAS基因突变、右半结肠以及高龄患者[6]。此外，本团队对基于真实世界注册研究基础上的120例mCRC患者进行长期随访，通过病例对照研究方法对其中具有明确基因分型的68例患者进行分析发现，中医优势人群与非优势人群在KPS、是否有黏液血便史、是否接受靶向治疗以及口服中药汤药时间长短方面差异有统计学意义[7]。通过上述研究我们得出结论，认为mCRC中医治疗优势人群特征与那些难以从西医规范化诊疗获益的人群具有一定重合性。这进一步说明在mCRC的中西并重诊疗体系中，中医药能够对更多的mCRC患者起到“雪中送炭”的宝贵作用。
在进一步探讨中医治疗mCRC优势人群的疗效机制过程中，肠道菌群与宿主免疫调节的平衡是本团队较为关注的研究方向[8]。现已有大量临床及实验研究证实结直肠癌发生发展与某些细菌菌株和肠道菌群失调有关[9]，如粪肠球菌、志贺菌、脆弱拟杆菌、核梭杆菌等能够产生毒素和超氧化物，增加宿主炎症反应、诱导癌症发生[10]。相反地，另一些细菌也具有保护作用，如双歧杆菌、乳酸菌、脆弱类杆菌等[11-12]，研究证明这些有益菌保护结直肠癌的机制是通过与病原菌的竞争、代谢和遗传调节等功能实现的[13]。而中药在人体内的吸收、代谢同样有赖于肠道菌群的作用，因此结直肠癌、中药、肠道菌群3者之间存在一定必然的联系[14]。前期研究显示，以祛邪胶囊为代表的中药复方能够通过FOXP3家族调控机体T辅助细胞，从而发挥抗肿瘤作用，其与肠道菌群间的相互关系有待进一步明确[15]。基于上述研究及理论基础，我团队依托2015年度国家自然科学基金面上项目，通过小样本中药干预RCT研究以及3年生存结局随访，希望从肠道菌群分布及宿主免疫特征角度分析mCRC中医治疗优势人群特征，为进一步阐释中医治疗mCRC的疗效机制以及优势人群的客观判别标准提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2018年3月至2019年3月期间在中国中医科学院西苑医院肿瘤科门诊或住院诊治的Ⅳ期结直肠癌患者40例作为研究对象。
1.2 诊断标准
参照中华人民共和国卫生部医政司《中国常见恶性肿瘤诊治规范》晚期结直肠癌诊断标准。临床分期采用国际公认的TNM分期[美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第八版]。
1.3 纳入标准 1）经病理学诊断明确的结直肠癌患者;2）经影像学或病理明确TNM分期诊断为Ⅳ期，且无法对转移病灶进行手术切除;3）年龄18～80岁，性别不限;4）已结束化疗、盆腔放疗、靶向治疗、免疫治疗至少1个月及以上;5）预计生存期大于半年;6）签署知情同意书，并且依从性好的患者。
1.4 排除标准 1）既往或合并其他原发恶性肿瘤病史;2）合并严重心血管系统并发症、严重肝肾功能异常;3）已出现肠梗阻不能口服药物治疗，需要静脉内高能营养;4）患有严重吸收不良或其他影响胃肠道吸收的疾病;5）在入组治疗开始前特定期间内接受下列任何治疗的受试者：a.在2周内曾接受抗生素口服或静脉输液治疗;b.正在接受肠道菌群调节剂（如培菲康、乳酸菌素片等）治疗。
1.5 研究方法
临床部分采取随机双盲安慰剂对照临床试验研究方法。临床研究方案于2016年6月通过了中国中医科学院西苑医院医学伦理委员会第一次伦理审查（伦理审批号：2016XLA122-1）。2018年3月8日提交伦理修正（修正临床研究方案版本号1.4，版本日期2018-03-01，修正知情同意书版本号1.4，版本日期2018-03-11，修正案会议伦理审批号：2016XLA122-4）。本研究最终方案已在中国临床试验注册中心完成注册（注册号：ChiCTR2000029599）。 观察组采用常规治疗加用祛邪胶囊，该药是由中国中医科学院西苑医院制剂科加工生产，每次0.05 g/kg体质量，2次/d口服，连服20 d，停用10 d，30 d为1个疗程。治疗1个疗程，赠药（祛邪胶囊）1个疗程。对照组在同观察组相同的常规治疗的基础上服用安慰剂胶囊。安慰剂胶囊由北京食品药物研究所加工生产，外观、重量、颜色与祛邪胶囊一致。每次0.05 g/kg体质量，2次/d口服，连服20 d，停用10 d，30 d为1个疗程。干预1个疗程，赠药（祛邪胶囊）1个疗程。
常规治疗包括单纯中医综合治疗和中西医结合综合治疗，后者是在中医综合治疗基础上加用西医对症治疗，包括止痛、营养治疗等。其中，中医综合治疗包括中药汤剂、口服中成药、静脉中成药等，治则治法以扶正为主。
患者入组后，在祛邪胶囊干预1个月及赠药1个月后进行随访，此后每3个月对所有入组患者进行电话、网络、门诊或住院随访，随访内容主要是患者生存结局情况。
1.6 中医治疗优势人群分组标准及根据随访结果的筛选
1）中医治疗优势人群与非优势人群分组标准。根据团队前期研究基础以及专家共识，对本研究“中医治疗优势人群”定义如下：口服中药≥3个月且截至患者死亡或最后一次随访时间达到较长的Ⅳ期生存期，其中基因全野生型>30个月;RAS突变型>24个月;BRAF突变型或未行基因检测>18个月。2）3年随访生存结局情况。截至2021年2月末次随访，40例入组晚期结直肠癌患者中位随访时间为（19.7±10.2）个月，其中出现结局事件（各种原因所致死亡）18例（占45%）。本研究根据上述定义以及入组患者基线资料、随访结果（Ⅳ期生存时间），进一步划分中医治疗优势人群及非优势人群。
1.7 观察指标
1.7.1 粪便样本采集及肠道菌群检测
患者入组开始治疗前采集新鲜粪便，要求患者在粪便采集前2周之内避免口服抗生素，采集3 d内避免进食酸奶及发酵食物。将患者新鲜粪便利用OMNIgene-GUT OME-200试管储存（DNA Genitek Inc.Ottawa，Canada，批号：22001702552108，该试管能够常温稳定DNA达60 d。粪便样本由中国上海美吉生物公司采用16srRNA分析方法进行质检及检测，具体过程：1）DNA抽提和PCR扩增：根据E.Z.N.A. soil试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量;用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR仪：ABI GeneAmp，型号：9700）。扩增体系为20 μL，4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mM dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。2）Illumina Miseq测序使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（Illumina MiSeq platform TruSeqTM DNA Sample Pre Kit Illumina，SanDiego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。构建文库步骤：1）连接“Y”字形接头;2）使用磁珠筛选去除接头自连片段;3）利用PCR扩增进行文库模板的富集;4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（Illumina MiSeq platform TruSeqTM DNA Sample Pre Kit Illumina，SanDiego，USA）。数据处理原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接：1）设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20 bp，从窗口前端位置截去该碱基后端所有序列，之后再去除质控后长度低于50 bp的序列;2）根据重叠碱基Overlap将两端序列进行拼接，拼接时Overlap之间的最大错配率为0.2，长度需大于10 bp。3）根据序列首尾两端的Barcode和引物将序列拆分至每个样本，Barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除存在模糊碱基的序列。使用UPARSE软件（Version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。
1.7.2 TB淋巴细胞亚群检测
患者入組开始治疗前取空腹静脉血5 mL，由中国中医科学院西苑医院血液实验室进行检测，具体过程：经标本处理后，进行免疫分子检测，T、B淋巴细胞亚群，Th1/Th2，NK细胞等。具体如下：在离心管内加入体积比为1∶2的淋巴细胞分离液和肝素化的新鲜稀释血液，离心20 min（400×g），吸取界面层（一层白膜）单个核细胞，Hanks液洗涤2次，每次离心10 min（500×g），逐层冷冻至-80 ℃，1 d后移入液氮保存待测。 1.7.3 其他信息采集 1）中医证型评分（中医脾虚量表）：基于前期研究基础及相关文献，制定结直肠癌中医脾虚量表，其中患者自评问题8项，程度从1至5。2）生命质量评分：采用埃德蒙顿症状评定量表（Edmonton Symptom Assessment Scale，ESAS），共包括11个问题，每个问题按程度分为0～10。
2 研究结果
2.1 晚期结直肠癌中醫优势人群临床特征分布
40例入组患者均接受口服中药治疗>3个月，其中根据Ⅳ期生存时间或截至末次随访时间，判定出中医治疗优势人群28例，中医非优势人群12例。在中医优势人群中，符合Ⅳ期生存期，基因全野生型>30个月共8例，RAS突变型>24个月共9例，BRAF突变型或未行基因检测>18个月共11例。
2.1.1 肿瘤相关临床特征差异
40例晚期结直肠癌患者中，女性、年龄≥65岁、原发部位为右半结肠患者在中医治疗优势人群所占比例较高，且中医治疗优势人群中存在更少的死亡结局事件。见表1。
2.1.2 中医脾虚症状分布差异
在8项中医脾虚症状中，中医治疗优势人群较非优势人群存在更高“我吃凉东西后会肠鸣”（32% vs. 8%，P=0.17），“我有白天出汗、活动后加重的现象”（25% vs. 8%，P=0.6），“我感到没有力气说话”（18% vs. 0%，P=0.51）的出现频率;而中医治疗非优势人群较优势人群存在更高的“我感到食欲不好”（25% vs. 7%，P=0.25），“我吃饭后肚子胀”（17% vs. 11%，P=0.92）。见图1。
2.1.3 临床症状（ESAS量表症状）分布差异
在10项临床症状中，中医治疗优势人群较非优势人群存在更高“焦虑”（1.6±2.2 vs. 0.92±2.23，P=0.37）、“瘙痒”（1.79±2.17 vs. 0.83±2.04，P=0.2）程度;而中医治疗非优势人群较优势人群存在更高的“抑郁”（1.75±2.09 vs. 1.29±2.14，P=0.53）、“食欲差”（3.25±2.60 vs. 2.82±2.31，P=0.61）程度。见图2。
2.2 中医治疗优势与非优势人群肠道菌群分布差异
纳入分析40例患者中共39例完成了粪便样本采集，共包含4 022 818条DNA序列。利用美吉生物云平台（http：//cloud.majorbio.com）进行生物信息分析。OUT物种分析显示所有样本中共包含微生物物种门水平13种，纲水平21种，目水平37种，科水平74种，属水平246种，种水平552种，OUT水平863种。Rank-Abundance曲线提示，所有样本中种类较丰富。见图3。Pan/Core曲线分析提示曲线平滑，所观察样本量充足。见图4。
2.2.1 Alpha多样性
在OUT水平进行Alpha多样性分析显示，中医治疗非优势人群相比优势人群具有更高的sobs指数，且差异有统计学意义（115.17±19.25 vs. 81.96±36.79，P=0.005）。见图5。稀释曲线分析提示各种样本多样性指数变化曲线平滑，提示样本量充分。见图6。
2.2.2 物种组成分析
在属（Genus）水平对中医治疗优势及非优势人群进行物种组成韦恩图分析，结果显示2组共有196个共同菌种，中医治疗优势人群组具有26种特殊菌种、非优势人群具有24种特殊菌种。见图7。
对不同组间样本中优势物种组成及丰度利用群落Bar图进行比较分析，结果显示，各组样本中优势物种在属的水平均包含拟杆菌属（Bacteroids），厚壁菌属（Feacalibacterium），普雷沃属（Prevotella）以及志贺菌属（Escherichia-Shigella）。其中中医治疗优势人群较非优势人群具有更高比例的拟杆菌属（31.1%vs.24.8%），而非优势人群具有更高比例的志贺菌属（9.7% vs. 6.9%）。在门水平上，中医治疗优势人群厚壁菌门与拟杆菌门比值（F/B值）为0.84，中医治疗非优势人群F/B值为1.16。见图8。
2.2.3 Beta多样性
利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）对中医治疗优势及非优势人群肠道菌群β多样性进行分析，2组样本中物种第一主成分（PC1解释度为41.16%）出现一定程度的分离，而在第二主成分（PC2，解释度22.65%）分离不显著。见图9。
2.2.4 物种差异分析
进一步对中医治疗优势及非优势人群样本的物种差异性采用student-t检验进行显著性检验。结果显示，中医治疗优势人群具有更高比例的拟杆菌属（30.6% vs. 23.9%，P=0.33），普雷沃氏菌属（5.7% vs. 3.9%，P=0.69），而中医治疗非优势人群具有更高比例的志贺菌属（9.4% vs. 7.2%，P=0.74），Ruminococcaceae_UCG-014（2.1% vs. 0.5%，P=0.02）。见图10。
采用LEfSe多级物种差异性判别分析方法，从属水平到属水平分析不同组间菌群差异性，结果发现，真杆菌属（Eubacterium）在中医治疗优势人群组中较为优势，而放线菌门（Actinobacteria）、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）在中医治疗非优势人群组中较为优势。见图11。
2.3 中医治疗优势与非优势人群TB淋巴细胞亚群
2.3.1 TB淋巴细胞亚群分析
比较2组TB淋巴细胞亚群分析结果发现，中医治疗优势人群组较非优势人群组具有更高的双阴T细胞绝对值（89.6±82.0 vs. 37.1±16.5，P=0.01），以及非HLA依赖细胞毒性T细胞（83.0±43.6 vs. 28.4±18.3），P=0.01）。 2.3.2 TB淋巴细胞亚群与肠道菌群环境因子
为探讨不同组间肠道菌群物种分布是否与TB淋巴细胞亚群相关，将TB淋巴细胞亚群中DNT（CD4、CD8双阴性）T细胞、非HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值作为环境因子，在属（Genus）水平利用RDA分析法对环境因子与中医治疗优势、非优势人群样本及物种之间关系进行解释。结果显示，DNT、非HLA依赖细胞毒性T细胞与不同组间样本及物种之间的相关性显示差异无统计学意义（P=0.14，0.24），但具有相关性趋势。见图12。对DNT（CD4、CD8双阴性）T细胞、非HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与物种之间相关性进行属（Genus）水平的Heatmap分析，结果显示HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与粪厌氧棒状菌（Anaerostipes）显著负相关性（P=0.04）。见图13。
3 讨论
3.1 针对mCRC中医治疗优势人群特征及其概念的再探讨
本研究通过对本团队一项中药复方祛邪胶囊干预mCRC的RCT研究入组患者的3年随访以及中医治疗优势人群的划分，发现其主要临床特征包括女性、年龄≥65岁、肿瘤原发部位为右半结肠，且中医治疗优势人群中存在更少的死亡结局事件。此外，中医治疗优势人群与非优势人群在具体的症状负担及中医证型分布方面存在着一定的差异。上述结果与本团队前期在晚期结直肠癌中医优势人群特征的研究结果相一致，为中医治疗优势人群的判别提供了更进一步的临床特征依据，并再次提示中医对通过西医常规治疗难以获益的mCRC人群治疗中可能存在更为明显的优势，并能够帮助患者获得一定程度上的生存获益。
3.2 肠道菌群对mCRC中医治疗优势人群的预测价值和疗效机制阐释
研究结果发现中医优势人群及非优势人群在肠道菌群多样性、物种组成方面均存在一定的差异，如中医治疗优势人群与中医治疗非优势人群相比有更高比例的拟杆菌属，而非优势人群具有更高比例的志贺菌属。肠道菌群的组成和多样性受个体因素如年龄、性别、免疫系统和环境因素包括饮食习惯和药物使用的影响[16]。研究表明，与结直肠癌患者相比，健康人群中厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门占有更明显的优势，表明上述细菌物种是CRC的保護因素[17]。其中拟杆菌属是居住在人类胃肠道中最大的革兰阴性菌，在维持健康肠道平衡稳定、营养物质的吸收代谢等方面发挥重要的作用[18]。因此拟杆菌属的分布比例可能是mCRC中医治疗优势人群的特征性生物标志物，也可能是中药治疗晚期结直肠癌潜在治疗靶点。而非优势人群中所占比例较高的志贺菌属是革兰阴性、不活动兼厌氧病原体，与大肠杆菌密切相关且具有极强的毒性，是导致胃肠道感染和急性痢疾的主要病原体之一[19]。有研究表明，志贺菌属通过M细胞穿过结肠上皮层，从基底外侧面入侵结肠上皮细胞从而造成感染[20]，在穿过结肠黏膜时产生多种去调节机制导致促炎环境启动，伴随大量免疫细胞的死亡，包括巨噬细胞焦磷酸症以促进其在上皮内成活和沿结肠上皮扩散[21]。这一结果提示中医治疗非优势人群其肠道内仍存在炎症感染，且肠道内志贺菌属丰度上升可能与中药治疗干预疗效负相关。上述结果提示，通过16sRNA技术检测mCRC患者肠道中富集的菌株、进而分析特定菌群标志物，有可能为评估晚期结直肠癌患者是否能从中医治疗中获益提供客观评估和参考依据。
3.3 TB淋巴细胞与肠道菌群在中医治疗优势人群中的相互作用
在外周血TB淋巴细胞亚群分析结果发现，中医治疗优势人群组较非优势人群组具有更高比例的DNT细胞以及非HLA依赖细胞毒性T细胞。DNT细胞被认为是非传统的T细胞，近年来一些研究表明DNT有很强的抗肿瘤作用[22]，并且扩增的DNT在体外产生高水平的干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）[23]，对恶性肿瘤有积极的治疗作用。非HLA依赖细胞毒性T细胞是既表达自然杀伤细胞又表达T细胞相关受体的一类特殊的T淋巴细胞亚群，具有强大的抗肿瘤活性，可通过多种途径直接杀伤肿瘤细胞[24]，并且自然杀伤性T细胞（Natural Killer T Cell，NKT细胞）细胞激活后可分泌细胞因子，从而激活免疫细胞起到抗肿瘤免疫的作用[25]。恶性肿瘤患者外周血中I型NKT细胞比例增高与良好的治疗效果有关[26]，这与本研究的结果相一致。因此我们认为，中医药干预mCRC的疗效机制很可能与调控NKT细胞参与机体免疫功能调节相关，其比例的增高有可能是中医治疗优势人群治疗疗效的标志。对DNT细胞、非HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与物种之间相关性分析提示非HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与粪厌氧棒状菌（Anaerostipes）呈显著负相关性。目前已知粪厌氧棒状菌具有预防和治疗相关炎症疾病的作用，但其具体与NKT细胞的相关作用尚未有文献报道，还需进一步的研究探讨。
3.4 局限性与结论
本研究存在以下局限性：首先，研究中患者粪便标本均在基线采集，而在患者长期随访过程中其肠道菌群多样性及物种分布也可能发生一定的变化，因此下一步研究需将患者肠道菌群进行动态检测，从而能够为中医治疗优势的预测提供更为翔实的参考依据。其次，本研究患者均参与了RCT研究入组，尽管干预时间仅一个月，但仍存在祛邪胶囊观察组及安慰剂组之间的疗效与菌群调节差异[27]，需要在今后的研究中控制这些可能的影响因素。此外，肠道菌群宏基因组技术能够对不同组间患者肠道菌群的基因功能、基因组含量和差异进行分析，可为进一步明确微生物群在中医药治疗晚期结直肠癌患者治疗过程中的潜在作用机制提供更为深入的研究方法。目前研究基于外周血淋巴细胞亚群与肠道菌群多样性进行相关分析，并不能代表肠道菌群在结直肠固有层中遇到的全部淋巴细胞亚群，可通过动物实验设计对肠道局部菌群的标本进行采集和分析。另外，本研究是基于前期临床研究进行的随访且样本量较小，还需扩大样本量来进行相关验证，从而不断完善中医优势人群特征。尽管如此，研究首次提出mCRC中医治疗优势人群与非优势人群在肠道菌群分布以及TB淋巴细胞亚群特征方面存在显著差异且具有一定相关性，并为进一步阐释中医优势人群特征及疗效机制提供了必要的客观科学依据。 參考文献
[1]Zhang SW，Zheng RS，Zeng HM.Cancer incidence and mortality in China[J].JNCC，2020，1（1）：2-11.
[2]Dekker E，Tanis PJ，Vleugels J，et al.Colorectal cancer[J].Lancet，2019，394（10207）：1467-1480.
[3]Dienstmann R，Salazar R，Tabernero J.Molecular Subtypes and the Evolution of Treatment Decisions in Metastatic Colorectal Cancer[J].Am Soc Clin Oncol Educ Book，2018，38：231-238.
[4]Shao C，Zuo Q，Lin J，et al.Effect of Chinese Herbal Medicine on the Survival of Colorectal Cancer Patients With Liver-Limited Metastases：A Retrospective Cohort Study，2008 to 2017[J].Integr Cancer Ther，2019，18：1534735419883687.
[5]苗雯蓉，刘宁宁，朱惠蓉，等.中医药联合化疗治疗晚期大肠癌疗效Meta分析[J].中华中医药学刊，2018，36（5）：1119-1124.
[6]Zhang T，He WT，Zi MJ，et al.Cohort Study on Prognosis of Patients with Metastatic Colorectal Cancer Treated with Integrated Chinese and Western Medicine[J].Chin J Integr Med，2018，24（8）：573-578.
[7]徐钰莹，孙凌云，张长，等.晚期结直肠癌中医受益人群特征分析[J].中国中西医结合杂志，2019，39（7）：804-809.
[8]Shamekhi S，Lotfi H，Abdolalizadeh J，et al.An overview of yeast probiotics as cancer biotherapeutics：possible clinical application in colorectal cancer[J].Clin Transl Oncol，2020，22（8）：1227-1239.
[9]Lamichhane P，Maiolini M，Alnafoosi O，et al.Colorectal Cancer and Probiotics：Are Bugs Really Drugs？[J].Cancers（Basel），2020，12（5）：1162.
[10]Zou S，Fang L，Lee MH.Dysbiosis of gut microbiota in promoting the development of colorectal cancer[J].Gastroenterol Rep（Oxf），2018，6（1）：1-12.
[11]Wei H，Chen L，Lian G，et al.Antitumor mechanisms of bifidobacteria[J].Oncol Lett，2018，16（1）：3-8.
[12]Agah S，Alizadeh AM，Mosavi M，et al.More Protection of Lactobacillus acidophilus Than Bifidobacterium bifidum Probiotics on Azoxymethane-Induced Mouse Colon Cancer[J].Probiotics Antimicrob Proteins，2019，11（3）：857-864.
[13]Zhong L，Zhang X，Covasa M.Emerging roles of lactic acid bacteria in protection against colorectal cancer[J].World J Gastroenterol，2014，20（24）：7878-7886.
[14]Wu M，Wu Y，Deng B，et al.Isoliquiritigenin decreases the incidence of colitis-associated colorectal cancer by modulating the intestinal microbiota[J].Oncotarget，2016，7（51）：85318-85331.
[15]Chen D，Yang Y，Yang P.Quxie Capsule Inhibits Colon Tumor Growth Partially Through Foxo1-Mediated Apoptosis and Immune Modulation[J].Integr Cancer Ther，2019，18：1534735419846377.
[16]Si H，Yang Q，Hu H，et al.Colorectal cancer occurrence and treatment based on changes in intestinal flora[J].Semin Cancer Biol，2021，70：3-10. [17]Flint HJ，Scott KP，Louis P，et al.The role of the gut microbiota in nutrition and health[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2012，9（10）：577-589.
[18]Gibiino G，Lopetuso LR，Scaldaferri F，et al.Exploring Bacteroidetes：Metabolic key points and immunological tricks of our gut commensals[J].Dig Liver Dis，2018，50（7）：635-639.
[19]Ud-Din A，Wahid S.Relationship among Shigella spp.and enteroinvasive Escherichia coli（EIEC）and their differentiation[J].Braz J Microbiol，2014，45（4）：1131-1138.
[20]Phalipon A，Sansonetti PJ.Shigella′s ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system：a tool box for survival？[J].Immunol Cell Biol，2007，85（2）：119-129.
[21]Brunner K，Samassa F，Sansonetti PJ，et al.Shigella-mediated immunosuppression in the human gut：subversion extends from innate to adaptive immune responses[J].Hum Vaccin Immunother，2019，15（6）：1317-1325.
[22]Alnaggar M，Xu Y，Li J，et al.Allogenic Vγ9Vδ2 T cell as new potential immunotherapy drug for solid tumor：a case study for cholangiocarcinoma[J].J Immunother Cancer，2019，7（1）：36.
[23]Mou Z，Liu D，Okwor I，et al.MHC class Ⅱ restricted innate-like double negative T cells contribute to optimal primary and secondary immunity to Leishmania major[J].PLoS Pathog，2014，10（9）：e1004396.
[24]Shekhar S，Joyee AG，Yang X.Dynamics of NKT-Cell Responses to Chlamydial Infection[J].Front Immunol，2015，6：233.
[25]Coquet JM，Kyparissoudis K，Pellicci DG，et al.IL-21 is produced by NKT cells and modulates NKT cell activation and cytokine production[J].J Immunol，2007，178（5）：2827-2834.
[26]郭偉春，梁俊青，贾绍昌.NKT细胞的生物特性及其在抗肿瘤免疫中的作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2019，26（8）：921-924.
[27]Sun L，Yan Y，Chen D，et al.Quxie Capsule Modulating Gut Microbiome and Its Association With T cell Regulation in Patients With Metastatic Colorectal Cancer：Result From a Randomized Controlled Clinical Trial[J].Integr Cancer Ther，2020，19：1534735420969820.
（2021-03-10收稿 责任编辑：徐颖）
关键词 转移性结直肠癌;中医药;优势人群;肠道菌群;淋巴细胞亚群
Analysis on Intestinal Flora and TB Lymphocyte Subsets of Traditional Chinese Medicine Beneficiaries in Metastatic Colorectal Cancer
YAN Yunzi1，2， SUN Lingyun2， XU Yuying1，2， CHEN Dongmei3， YAN Shaohua2，YANG Yufei2
（1 Graduate School， Beijing University of Chinese Medicine， Xiyuan Clinical Medical College， Beijing 10029， China; 2 Department of Oncology， Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Science， Beijing 100091， China; 3 China-Japan Friendship Hospital， Beijing 10029， China）
Abstract Objective：To analyze the distribution characteristics and correlation of intestinal flora and TB lymphocyte subpopulations in Chinese medicine beneficiaries of metastatic colorectal cancer（mCRC）. Methods：From March 2018 to March 2019， a total of 40 patients with mCRC admitted to the Oncology Department or Ward of Xiyuan Hospital of the Chinese Academy of Chinese Medical Sciences were selected as the research objects. A randomized double-blind， placebo-controlled clinical research method was used and the patients were randomly divided into a treatment groups and a placebo group. The treatment group was given conventional Chinese medicine treatment plus Quxie Capsules， and the control group was given placebo capsules on the basis of the same treatment as the treatment group. Stool samples and peripheral blood samples of patients at baseline were collected and tested. According to the survival outcome of the three-year follow-up of the enrolled patients and the criteria for determining the dominant group of Chinese medicine treatment of mCRC， the patients were divided into a dominant group and a non-dominant group of traditional Chinese medicine treatment. The difference and correlation of intestinal flora and TB lymphocyte subgroups between the 2 groups were analyzed.Results：The Alpha diversity analysis of the intestinal flora showed that the Chinese medicine in the treatment of non-beneficiaries populations had a higher SOBS index than the Chinese medicine beneficiaries populations group and there was a significant statistical difference （115.17±19.25 vs. 81.96±36.79， P=0.005）. Chinese medicine beneficiaries populations group had a higher proportion of Bacteroides （30.6% vs. 23.9%， P=0.33） and Prevotella （5.7% vs.3.9%， P=0.69）; the analysis of TB lymphocyte subsets found that the Chinese medicine beneficiaries populations group had a higher absolute value of double-negative T cells （89.6±82.0 vs. 37.1±16.5， P=0.01） and non-HLA dependent group than the other group （83.0±43.6 vs.28.4±18.3），P=0.01）; the absolute value of HLA-dependent cytotoxic T cells was significantly negatively correlated with Anaerostipes （P=0.04）. Conclusion：there are significant differences in the distribution of intestinal flora and the characteristics of TB lymphocyte subgroups between the dominant and non-advantaged groups of Chinese medicine treatment of mCRC， which provide a necessary scientific basis for further explaining the characteristics of the dominant group of traditional Chinese medicine and the mechanism of efficacy. Keywords Metastatic colorectal cancer; Traditional Chinese medicine; Dominant population; Intestinal flora; Lymphocyte subsets
中图分类号：R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.008
2021年国家癌症中心最新数据显示，2015年结直肠癌发病率为17.81%，居全部恶性肿瘤发病率第4位，结直肠癌死亡率为8.12%，居全部恶性肿瘤死亡率第5位，且发病率及死亡率呈上升趋势[1]。近十年来随着靶向治疗及免疫治疗的进展，转移性结直肠癌（Metastatic Colorectal Cancer，mCRC）患者的总生存期不断被延长，目前临床研究显示mCRC中位生存期可达3年[2]。尽管目前循证医学证据表明以化放疗、靶向及免疫治疗为基础的肿瘤规范化治疗能够为mCRC带来最大的临床获益，但上述现代医学治疗方法在带来疗效的同时，也增加了产生不良反应的风险，降低患者总体生命质量，带来个人及家庭经济负担，从而影响患者对治疗的依从性及耐受性。真实世界数据表明，RAS突变、右半结肠、高龄、体质差、经济状况差和治疗意愿不强的患者较难从西医规范治疗中获益，且这部分人群所占比例高达40%以上[3]。因此，临床试验及指南推荐与实际临床中所面临问题之间的差异是目前我国mCRC综合治疗领域中亟待正视与解决的困境之一。
近年来多项研究表明中西医结合治疗在延长mCRC患者生存期的同時也能够改善其生命质量，因此我国所特有的中西并重方案有望能够帮助更多患者得到获益[4-5]。在这一过程中，积极探索中医治疗mCRC的优势人群并阐释其特征及疗效机制，才能够与现有临床指南及规范化治疗方案优势互补，从而形成精准、个体化的诊疗策略。本团队经过10余年来的不懈努力，通过前期随机对照试验（Randomized Controlled Trial，RCT）及队列研究初步明确mCRC中医治疗优势人群特征为：女性、KRAS基因突变、右半结肠以及高龄患者[6]。此外，本团队对基于真实世界注册研究基础上的120例mCRC患者进行长期随访，通过病例对照研究方法对其中具有明确基因分型的68例患者进行分析发现，中医优势人群与非优势人群在KPS、是否有黏液血便史、是否接受靶向治疗以及口服中药汤药时间长短方面差异有统计学意义[7]。通过上述研究我们得出结论，认为mCRC中医治疗优势人群特征与那些难以从西医规范化诊疗获益的人群具有一定重合性。这进一步说明在mCRC的中西并重诊疗体系中，中医药能够对更多的mCRC患者起到“雪中送炭”的宝贵作用。
在进一步探讨中医治疗mCRC优势人群的疗效机制过程中，肠道菌群与宿主免疫调节的平衡是本团队较为关注的研究方向[8]。现已有大量临床及实验研究证实结直肠癌发生发展与某些细菌菌株和肠道菌群失调有关[9]，如粪肠球菌、志贺菌、脆弱拟杆菌、核梭杆菌等能够产生毒素和超氧化物，增加宿主炎症反应、诱导癌症发生[10]。相反地，另一些细菌也具有保护作用，如双歧杆菌、乳酸菌、脆弱类杆菌等[11-12]，研究证明这些有益菌保护结直肠癌的机制是通过与病原菌的竞争、代谢和遗传调节等功能实现的[13]。而中药在人体内的吸收、代谢同样有赖于肠道菌群的作用，因此结直肠癌、中药、肠道菌群3者之间存在一定必然的联系[14]。前期研究显示，以祛邪胶囊为代表的中药复方能够通过FOXP3家族调控机体T辅助细胞，从而发挥抗肿瘤作用，其与肠道菌群间的相互关系有待进一步明确[15]。基于上述研究及理论基础，我团队依托2015年度国家自然科学基金面上项目，通过小样本中药干预RCT研究以及3年生存结局随访，希望从肠道菌群分布及宿主免疫特征角度分析mCRC中医治疗优势人群特征，为进一步阐释中医治疗mCRC的疗效机制以及优势人群的客观判别标准提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2018年3月至2019年3月期间在中国中医科学院西苑医院肿瘤科门诊或住院诊治的Ⅳ期结直肠癌患者40例作为研究对象。
1.2 诊断标准
参照中华人民共和国卫生部医政司《中国常见恶性肿瘤诊治规范》晚期结直肠癌诊断标准。临床分期采用国际公认的TNM分期[美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第八版]。
1.3 纳入标准 1）经病理学诊断明确的结直肠癌患者;2）经影像学或病理明确TNM分期诊断为Ⅳ期，且无法对转移病灶进行手术切除;3）年龄18～80岁，性别不限;4）已结束化疗、盆腔放疗、靶向治疗、免疫治疗至少1个月及以上;5）预计生存期大于半年;6）签署知情同意书，并且依从性好的患者。
1.4 排除标准 1）既往或合并其他原发恶性肿瘤病史;2）合并严重心血管系统并发症、严重肝肾功能异常;3）已出现肠梗阻不能口服药物治疗，需要静脉内高能营养;4）患有严重吸收不良或其他影响胃肠道吸收的疾病;5）在入组治疗开始前特定期间内接受下列任何治疗的受试者：a.在2周内曾接受抗生素口服或静脉输液治疗;b.正在接受肠道菌群调节剂（如培菲康、乳酸菌素片等）治疗。
1.5 研究方法
临床部分采取随机双盲安慰剂对照临床试验研究方法。临床研究方案于2016年6月通过了中国中医科学院西苑医院医学伦理委员会第一次伦理审查（伦理审批号：2016XLA122-1）。2018年3月8日提交伦理修正（修正临床研究方案版本号1.4，版本日期2018-03-01，修正知情同意书版本号1.4，版本日期2018-03-11，修正案会议伦理审批号：2016XLA122-4）。本研究最终方案已在中国临床试验注册中心完成注册（注册号：ChiCTR2000029599）。 观察组采用常规治疗加用祛邪胶囊，该药是由中国中医科学院西苑医院制剂科加工生产，每次0.05 g/kg体质量，2次/d口服，连服20 d，停用10 d，30 d为1个疗程。治疗1个疗程，赠药（祛邪胶囊）1个疗程。对照组在同观察组相同的常规治疗的基础上服用安慰剂胶囊。安慰剂胶囊由北京食品药物研究所加工生产，外观、重量、颜色与祛邪胶囊一致。每次0.05 g/kg体质量，2次/d口服，连服20 d，停用10 d，30 d为1个疗程。干预1个疗程，赠药（祛邪胶囊）1个疗程。
常规治疗包括单纯中医综合治疗和中西医结合综合治疗，后者是在中医综合治疗基础上加用西医对症治疗，包括止痛、营养治疗等。其中，中医综合治疗包括中药汤剂、口服中成药、静脉中成药等，治则治法以扶正为主。
患者入组后，在祛邪胶囊干预1个月及赠药1个月后进行随访，此后每3个月对所有入组患者进行电话、网络、门诊或住院随访，随访内容主要是患者生存结局情况。
1.6 中医治疗优势人群分组标准及根据随访结果的筛选
1）中医治疗优势人群与非优势人群分组标准。根据团队前期研究基础以及专家共识，对本研究“中医治疗优势人群”定义如下：口服中药≥3个月且截至患者死亡或最后一次随访时间达到较长的Ⅳ期生存期，其中基因全野生型>30个月;RAS突变型>24个月;BRAF突变型或未行基因检测>18个月。2）3年随访生存结局情况。截至2021年2月末次随访，40例入组晚期结直肠癌患者中位随访时间为（19.7±10.2）个月，其中出现结局事件（各种原因所致死亡）18例（占45%）。本研究根据上述定义以及入组患者基线资料、随访结果（Ⅳ期生存时间），进一步划分中医治疗优势人群及非优势人群。
1.7 观察指标
1.7.1 粪便样本采集及肠道菌群检测
患者入组开始治疗前采集新鲜粪便，要求患者在粪便采集前2周之内避免口服抗生素，采集3 d内避免进食酸奶及发酵食物。将患者新鲜粪便利用OMNIgene-GUT OME-200试管储存（DNA Genitek Inc.Ottawa，Canada，批号：22001702552108，该试管能够常温稳定DNA达60 d。粪便样本由中国上海美吉生物公司采用16srRNA分析方法进行质检及检测，具体过程：1）DNA抽提和PCR扩增：根据E.Z.N.A. soil试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量;用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR仪：ABI GeneAmp，型号：9700）。扩增体系为20 μL，4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mM dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。2）Illumina Miseq测序使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（Illumina MiSeq platform TruSeqTM DNA Sample Pre Kit Illumina，SanDiego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。构建文库步骤：1）连接“Y”字形接头;2）使用磁珠筛选去除接头自连片段;3）利用PCR扩增进行文库模板的富集;4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（Illumina MiSeq platform TruSeqTM DNA Sample Pre Kit Illumina，SanDiego，USA）。数据处理原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接：1）设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20 bp，从窗口前端位置截去该碱基后端所有序列，之后再去除质控后长度低于50 bp的序列;2）根据重叠碱基Overlap将两端序列进行拼接，拼接时Overlap之间的最大错配率为0.2，长度需大于10 bp。3）根据序列首尾两端的Barcode和引物将序列拆分至每个样本，Barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除存在模糊碱基的序列。使用UPARSE软件（Version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。
1.7.2 TB淋巴细胞亚群检测
患者入組开始治疗前取空腹静脉血5 mL，由中国中医科学院西苑医院血液实验室进行检测，具体过程：经标本处理后，进行免疫分子检测，T、B淋巴细胞亚群，Th1/Th2，NK细胞等。具体如下：在离心管内加入体积比为1∶2的淋巴细胞分离液和肝素化的新鲜稀释血液，离心20 min（400×g），吸取界面层（一层白膜）单个核细胞，Hanks液洗涤2次，每次离心10 min（500×g），逐层冷冻至-80 ℃，1 d后移入液氮保存待测。 1.7.3 其他信息采集 1）中医证型评分（中医脾虚量表）：基于前期研究基础及相关文献，制定结直肠癌中医脾虚量表，其中患者自评问题8项，程度从1至5。2）生命质量评分：采用埃德蒙顿症状评定量表（Edmonton Symptom Assessment Scale，ESAS），共包括11个问题，每个问题按程度分为0～10。
2 研究结果
2.1 晚期结直肠癌中醫优势人群临床特征分布
40例入组患者均接受口服中药治疗>3个月，其中根据Ⅳ期生存时间或截至末次随访时间，判定出中医治疗优势人群28例，中医非优势人群12例。在中医优势人群中，符合Ⅳ期生存期，基因全野生型>30个月共8例，RAS突变型>24个月共9例，BRAF突变型或未行基因检测>18个月共11例。
2.1.1 肿瘤相关临床特征差异
40例晚期结直肠癌患者中，女性、年龄≥65岁、原发部位为右半结肠患者在中医治疗优势人群所占比例较高，且中医治疗优势人群中存在更少的死亡结局事件。见表1。
2.1.2 中医脾虚症状分布差异
在8项中医脾虚症状中，中医治疗优势人群较非优势人群存在更高“我吃凉东西后会肠鸣”（32% vs. 8%，P=0.17），“我有白天出汗、活动后加重的现象”（25% vs. 8%，P=0.6），“我感到没有力气说话”（18% vs. 0%，P=0.51）的出现频率;而中医治疗非优势人群较优势人群存在更高的“我感到食欲不好”（25% vs. 7%，P=0.25），“我吃饭后肚子胀”（17% vs. 11%，P=0.92）。见图1。
2.1.3 临床症状（ESAS量表症状）分布差异
在10项临床症状中，中医治疗优势人群较非优势人群存在更高“焦虑”（1.6±2.2 vs. 0.92±2.23，P=0.37）、“瘙痒”（1.79±2.17 vs. 0.83±2.04，P=0.2）程度;而中医治疗非优势人群较优势人群存在更高的“抑郁”（1.75±2.09 vs. 1.29±2.14，P=0.53）、“食欲差”（3.25±2.60 vs. 2.82±2.31，P=0.61）程度。见图2。
2.2 中医治疗优势与非优势人群肠道菌群分布差异
纳入分析40例患者中共39例完成了粪便样本采集，共包含4 022 818条DNA序列。利用美吉生物云平台（http：//cloud.majorbio.com）进行生物信息分析。OUT物种分析显示所有样本中共包含微生物物种门水平13种，纲水平21种，目水平37种，科水平74种，属水平246种，种水平552种，OUT水平863种。Rank-Abundance曲线提示，所有样本中种类较丰富。见图3。Pan/Core曲线分析提示曲线平滑，所观察样本量充足。见图4。
2.2.1 Alpha多样性
在OUT水平进行Alpha多样性分析显示，中医治疗非优势人群相比优势人群具有更高的sobs指数，且差异有统计学意义（115.17±19.25 vs. 81.96±36.79，P=0.005）。见图5。稀释曲线分析提示各种样本多样性指数变化曲线平滑，提示样本量充分。见图6。
2.2.2 物种组成分析
在属（Genus）水平对中医治疗优势及非优势人群进行物种组成韦恩图分析，结果显示2组共有196个共同菌种，中医治疗优势人群组具有26种特殊菌种、非优势人群具有24种特殊菌种。见图7。
对不同组间样本中优势物种组成及丰度利用群落Bar图进行比较分析，结果显示，各组样本中优势物种在属的水平均包含拟杆菌属（Bacteroids），厚壁菌属（Feacalibacterium），普雷沃属（Prevotella）以及志贺菌属（Escherichia-Shigella）。其中中医治疗优势人群较非优势人群具有更高比例的拟杆菌属（31.1%vs.24.8%），而非优势人群具有更高比例的志贺菌属（9.7% vs. 6.9%）。在门水平上，中医治疗优势人群厚壁菌门与拟杆菌门比值（F/B值）为0.84，中医治疗非优势人群F/B值为1.16。见图8。
2.2.3 Beta多样性
利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）对中医治疗优势及非优势人群肠道菌群β多样性进行分析，2组样本中物种第一主成分（PC1解释度为41.16%）出现一定程度的分离，而在第二主成分（PC2，解释度22.65%）分离不显著。见图9。
2.2.4 物种差异分析
进一步对中医治疗优势及非优势人群样本的物种差异性采用student-t检验进行显著性检验。结果显示，中医治疗优势人群具有更高比例的拟杆菌属（30.6% vs. 23.9%，P=0.33），普雷沃氏菌属（5.7% vs. 3.9%，P=0.69），而中医治疗非优势人群具有更高比例的志贺菌属（9.4% vs. 7.2%，P=0.74），Ruminococcaceae_UCG-014（2.1% vs. 0.5%，P=0.02）。见图10。
采用LEfSe多级物种差异性判别分析方法，从属水平到属水平分析不同组间菌群差异性，结果发现，真杆菌属（Eubacterium）在中医治疗优势人群组中较为优势，而放线菌门（Actinobacteria）、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）在中医治疗非优势人群组中较为优势。见图11。
2.3 中医治疗优势与非优势人群TB淋巴细胞亚群
2.3.1 TB淋巴细胞亚群分析
比较2组TB淋巴细胞亚群分析结果发现，中医治疗优势人群组较非优势人群组具有更高的双阴T细胞绝对值（89.6±82.0 vs. 37.1±16.5，P=0.01），以及非HLA依赖细胞毒性T细胞（83.0±43.6 vs. 28.4±18.3），P=0.01）。 2.3.2 TB淋巴细胞亚群与肠道菌群环境因子
为探讨不同组间肠道菌群物种分布是否与TB淋巴细胞亚群相关，将TB淋巴细胞亚群中DNT（CD4、CD8双阴性）T细胞、非HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值作为环境因子，在属（Genus）水平利用RDA分析法对环境因子与中医治疗优势、非优势人群样本及物种之间关系进行解释。结果显示，DNT、非HLA依赖细胞毒性T细胞与不同组间样本及物种之间的相关性显示差异无统计学意义（P=0.14，0.24），但具有相关性趋势。见图12。对DNT（CD4、CD8双阴性）T细胞、非HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与物种之间相关性进行属（Genus）水平的Heatmap分析，结果显示HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与粪厌氧棒状菌（Anaerostipes）显著负相关性（P=0.04）。见图13。
3 讨论
3.1 针对mCRC中医治疗优势人群特征及其概念的再探讨
本研究通过对本团队一项中药复方祛邪胶囊干预mCRC的RCT研究入组患者的3年随访以及中医治疗优势人群的划分，发现其主要临床特征包括女性、年龄≥65岁、肿瘤原发部位为右半结肠，且中医治疗优势人群中存在更少的死亡结局事件。此外，中医治疗优势人群与非优势人群在具体的症状负担及中医证型分布方面存在着一定的差异。上述结果与本团队前期在晚期结直肠癌中医优势人群特征的研究结果相一致，为中医治疗优势人群的判别提供了更进一步的临床特征依据，并再次提示中医对通过西医常规治疗难以获益的mCRC人群治疗中可能存在更为明显的优势，并能够帮助患者获得一定程度上的生存获益。
3.2 肠道菌群对mCRC中医治疗优势人群的预测价值和疗效机制阐释
研究结果发现中医优势人群及非优势人群在肠道菌群多样性、物种组成方面均存在一定的差异，如中医治疗优势人群与中医治疗非优势人群相比有更高比例的拟杆菌属，而非优势人群具有更高比例的志贺菌属。肠道菌群的组成和多样性受个体因素如年龄、性别、免疫系统和环境因素包括饮食习惯和药物使用的影响[16]。研究表明，与结直肠癌患者相比，健康人群中厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门占有更明显的优势，表明上述细菌物种是CRC的保護因素[17]。其中拟杆菌属是居住在人类胃肠道中最大的革兰阴性菌，在维持健康肠道平衡稳定、营养物质的吸收代谢等方面发挥重要的作用[18]。因此拟杆菌属的分布比例可能是mCRC中医治疗优势人群的特征性生物标志物，也可能是中药治疗晚期结直肠癌潜在治疗靶点。而非优势人群中所占比例较高的志贺菌属是革兰阴性、不活动兼厌氧病原体，与大肠杆菌密切相关且具有极强的毒性，是导致胃肠道感染和急性痢疾的主要病原体之一[19]。有研究表明，志贺菌属通过M细胞穿过结肠上皮层，从基底外侧面入侵结肠上皮细胞从而造成感染[20]，在穿过结肠黏膜时产生多种去调节机制导致促炎环境启动，伴随大量免疫细胞的死亡，包括巨噬细胞焦磷酸症以促进其在上皮内成活和沿结肠上皮扩散[21]。这一结果提示中医治疗非优势人群其肠道内仍存在炎症感染，且肠道内志贺菌属丰度上升可能与中药治疗干预疗效负相关。上述结果提示，通过16sRNA技术检测mCRC患者肠道中富集的菌株、进而分析特定菌群标志物，有可能为评估晚期结直肠癌患者是否能从中医治疗中获益提供客观评估和参考依据。
3.3 TB淋巴细胞与肠道菌群在中医治疗优势人群中的相互作用
在外周血TB淋巴细胞亚群分析结果发现，中医治疗优势人群组较非优势人群组具有更高比例的DNT细胞以及非HLA依赖细胞毒性T细胞。DNT细胞被认为是非传统的T细胞，近年来一些研究表明DNT有很强的抗肿瘤作用[22]，并且扩增的DNT在体外产生高水平的干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）[23]，对恶性肿瘤有积极的治疗作用。非HLA依赖细胞毒性T细胞是既表达自然杀伤细胞又表达T细胞相关受体的一类特殊的T淋巴细胞亚群，具有强大的抗肿瘤活性，可通过多种途径直接杀伤肿瘤细胞[24]，并且自然杀伤性T细胞（Natural Killer T Cell，NKT细胞）细胞激活后可分泌细胞因子，从而激活免疫细胞起到抗肿瘤免疫的作用[25]。恶性肿瘤患者外周血中I型NKT细胞比例增高与良好的治疗效果有关[26]，这与本研究的结果相一致。因此我们认为，中医药干预mCRC的疗效机制很可能与调控NKT细胞参与机体免疫功能调节相关，其比例的增高有可能是中医治疗优势人群治疗疗效的标志。对DNT细胞、非HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与物种之间相关性分析提示非HLA依赖细胞毒性T细胞绝对值与粪厌氧棒状菌（Anaerostipes）呈显著负相关性。目前已知粪厌氧棒状菌具有预防和治疗相关炎症疾病的作用，但其具体与NKT细胞的相关作用尚未有文献报道，还需进一步的研究探讨。
3.4 局限性与结论
本研究存在以下局限性：首先，研究中患者粪便标本均在基线采集，而在患者长期随访过程中其肠道菌群多样性及物种分布也可能发生一定的变化，因此下一步研究需将患者肠道菌群进行动态检测，从而能够为中医治疗优势的预测提供更为翔实的参考依据。其次，本研究患者均参与了RCT研究入组，尽管干预时间仅一个月，但仍存在祛邪胶囊观察组及安慰剂组之间的疗效与菌群调节差异[27]，需要在今后的研究中控制这些可能的影响因素。此外，肠道菌群宏基因组技术能够对不同组间患者肠道菌群的基因功能、基因组含量和差异进行分析，可为进一步明确微生物群在中医药治疗晚期结直肠癌患者治疗过程中的潜在作用机制提供更为深入的研究方法。目前研究基于外周血淋巴细胞亚群与肠道菌群多样性进行相关分析，并不能代表肠道菌群在结直肠固有层中遇到的全部淋巴细胞亚群，可通过动物实验设计对肠道局部菌群的标本进行采集和分析。另外，本研究是基于前期临床研究进行的随访且样本量较小，还需扩大样本量来进行相关验证，从而不断完善中医优势人群特征。尽管如此，研究首次提出mCRC中医治疗优势人群与非优势人群在肠道菌群分布以及TB淋巴细胞亚群特征方面存在显著差异且具有一定相关性，并为进一步阐释中医优势人群特征及疗效机制提供了必要的客观科学依据。 參考文献
[1]Zhang SW，Zheng RS，Zeng HM.Cancer incidence and mortality in China[J].JNCC，2020，1（1）：2-11.
[2]Dekker E，Tanis PJ，Vleugels J，et al.Colorectal cancer[J].Lancet，2019，394（10207）：1467-1480.
[3]Dienstmann R，Salazar R，Tabernero J.Molecular Subtypes and the Evolution of Treatment Decisions in Metastatic Colorectal Cancer[J].Am Soc Clin Oncol Educ Book，2018，38：231-238.
[4]Shao C，Zuo Q，Lin J，et al.Effect of Chinese Herbal Medicine on the Survival of Colorectal Cancer Patients With Liver-Limited Metastases：A Retrospective Cohort Study，2008 to 2017[J].Integr Cancer Ther，2019，18：1534735419883687.
[5]苗雯蓉，刘宁宁，朱惠蓉，等.中医药联合化疗治疗晚期大肠癌疗效Meta分析[J].中华中医药学刊，2018，36（5）：1119-1124.
[6]Zhang T，He WT，Zi MJ，et al.Cohort Study on Prognosis of Patients with Metastatic Colorectal Cancer Treated with Integrated Chinese and Western Medicine[J].Chin J Integr Med，2018，24（8）：573-578.
[7]徐钰莹，孙凌云，张长，等.晚期结直肠癌中医受益人群特征分析[J].中国中西医结合杂志，2019，39（7）：804-809.
[8]Shamekhi S，Lotfi H，Abdolalizadeh J，et al.An overview of yeast probiotics as cancer biotherapeutics：possible clinical application in colorectal cancer[J].Clin Transl Oncol，2020，22（8）：1227-1239.
[9]Lamichhane P，Maiolini M，Alnafoosi O，et al.Colorectal Cancer and Probiotics：Are Bugs Really Drugs？[J].Cancers（Basel），2020，12（5）：1162.
[10]Zou S，Fang L，Lee MH.Dysbiosis of gut microbiota in promoting the development of colorectal cancer[J].Gastroenterol Rep（Oxf），2018，6（1）：1-12.
[11]Wei H，Chen L，Lian G，et al.Antitumor mechanisms of bifidobacteria[J].Oncol Lett，2018，16（1）：3-8.
[12]Agah S，Alizadeh AM，Mosavi M，et al.More Protection of Lactobacillus acidophilus Than Bifidobacterium bifidum Probiotics on Azoxymethane-Induced Mouse Colon Cancer[J].Probiotics Antimicrob Proteins，2019，11（3）：857-864.
[13]Zhong L，Zhang X，Covasa M.Emerging roles of lactic acid bacteria in protection against colorectal cancer[J].World J Gastroenterol，2014，20（24）：7878-7886.
[14]Wu M，Wu Y，Deng B，et al.Isoliquiritigenin decreases the incidence of colitis-associated colorectal cancer by modulating the intestinal microbiota[J].Oncotarget，2016，7（51）：85318-85331.
[15]Chen D，Yang Y，Yang P.Quxie Capsule Inhibits Colon Tumor Growth Partially Through Foxo1-Mediated Apoptosis and Immune Modulation[J].Integr Cancer Ther，2019，18：1534735419846377.
[16]Si H，Yang Q，Hu H，et al.Colorectal cancer occurrence and treatment based on changes in intestinal flora[J].Semin Cancer Biol，2021，70：3-10. [17]Flint HJ，Scott KP，Louis P，et al.The role of the gut microbiota in nutrition and health[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2012，9（10）：577-589.
[18]Gibiino G，Lopetuso LR，Scaldaferri F，et al.Exploring Bacteroidetes：Metabolic key points and immunological tricks of our gut commensals[J].Dig Liver Dis，2018，50（7）：635-639.
[19]Ud-Din A，Wahid S.Relationship among Shigella spp.and enteroinvasive Escherichia coli（EIEC）and their differentiation[J].Braz J Microbiol，2014，45（4）：1131-1138.
[20]Phalipon A，Sansonetti PJ.Shigella′s ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system：a tool box for survival？[J].Immunol Cell Biol，2007，85（2）：119-129.
[21]Brunner K，Samassa F，Sansonetti PJ，et al.Shigella-mediated immunosuppression in the human gut：subversion extends from innate to adaptive immune responses[J].Hum Vaccin Immunother，2019，15（6）：1317-1325.
[22]Alnaggar M，Xu Y，Li J，et al.Allogenic Vγ9Vδ2 T cell as new potential immunotherapy drug for solid tumor：a case study for cholangiocarcinoma[J].J Immunother Cancer，2019，7（1）：36.
[23]Mou Z，Liu D，Okwor I，et al.MHC class Ⅱ restricted innate-like double negative T cells contribute to optimal primary and secondary immunity to Leishmania major[J].PLoS Pathog，2014，10（9）：e1004396.
[24]Shekhar S，Joyee AG，Yang X.Dynamics of NKT-Cell Responses to Chlamydial Infection[J].Front Immunol，2015，6：233.
[25]Coquet JM，Kyparissoudis K，Pellicci DG，et al.IL-21 is produced by NKT cells and modulates NKT cell activation and cytokine production[J].J Immunol，2007，178（5）：2827-2834.
[26]郭偉春，梁俊青，贾绍昌.NKT细胞的生物特性及其在抗肿瘤免疫中的作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2019，26（8）：921-924.
[27]Sun L，Yan Y，Chen D，et al.Quxie Capsule Modulating Gut Microbiome and Its Association With T cell Regulation in Patients With Metastatic Colorectal Cancer：Result From a Randomized Controlled Clinical Trial[J].Integr Cancer Ther，2020，19：1534735420969820.
（2021-03-10收稿 责任编辑：徐颖）