【摘 要】
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目的 克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异.方法 应用基因克隆的方法从慢性HBV感
【机 构】
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西安交通大学医学院第一附属医院传染科,陕西西安,710061
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目的 克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异.方法 应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;AnnexinV流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化.结果 成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)％和(0.805±0.013)％,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)％和未转染对照组(0.681±0.018)％,差异具有统计学意义(P＜0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)％及(21.34±2.16)％,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)％及未转染细胞对照组(11.37±1.58)％,差异具有统计学意义(P＜0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用.
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