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摘 要：目的：对地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）LS-1的发酵条件进行优化，以提高发酵液中蛋白酶的产量。方法：在单因素实验的基础上，分析培养基pH、接种量、培养温度、培养时间对其产酶能力的影响，对发酵条件进行优化。结果：地衣芽孢杆菌LS-1在接种量4%，培养基初始pH12，培养温度40℃，培养时间48h时酶活最高，为307.3U/mL。
关键词：蛋白酶;地衣芽孢杆菌;发酵条件
中图分类号 Q939.97 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）24-0022-3
Abstract：Objective：The fermentation conditions were optimized for improve protease yield of strain LS-1（Baclicus lincheniformis）.Methods：Strain LS-1 was used as the starting strain，and single factor test was performed from four aspects including medium pH，inoculating quantity，culture temperature and culture time to explore its fermenting conditions，then orthogonal experimengts were carried out to optimize its fermenting conditions.Results：The best fermenting conditions were summed up as follows： the inoculation quantity was 4%，medium pH was 12，culture temperature was at 40℃，and culture time was 48h.Under optimized conditions ，the protease activity was up to 307.3U/mL.
Key words：Protease;Baclicus lincheniformis;Fermentation condition
蛋白酶（proteases，proteinases），也稱为肽酶（peptidases），是能水解蛋白质和多肽的一群酶类，它们可以催化蛋白质或肽类的肽键降解，广泛存在于动物、植物和微生物中，约占所有蛋白质的2%。来源不同的蛋白酶，执行的功能也不同，例如，胞内蛋白酶与细胞的催化和调节作用有关，胞外分泌的蛋白酶则在降解氮源或其他能源底物中扮演了重要角色。蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，约占世界酶类销售总额的60%，其在食品、医药、纺织、制革、洗涤剂、化妆品以及废物处理等行业都有着较好的应用前景[1]。
本实验室从高温酒曲中分离产蛋白酶菌株LS-1，经鉴定为地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）。本研究拟以该菌株为研究对象，对其发酵条件进行优化，为该蛋白酶资源的开发与利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验菌株 地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）LS-1，由本实验室分离、保藏。
1.1.2 主要试剂与仪器 试剂：酪蛋白、牛肉膏、琼脂粉等均为生物纯，北京奥博星;葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、 KH2PO4等均为分析纯，天津科密欧;酪氨酸，分析纯，sigma进口分装;Folin-酚试剂：上海国药。仪器：上海精宏DNP-9052电热恒温培养箱;上海智诚ZHWY-2102恒温培养振荡器;德国艾本德5430R高速台式冷冻离心机;上海跃进XMTD-204数显式恒温水浴锅;上海仪电雷磁PHS-3CpH计;上海舜宇恒平MP2002电子天平;申安LDZX-50KBS高压灭菌锅;奥林巴斯CX23双目光学显微镜;上海精科752N分光光度计。
1.1.3 培养基 种子培养基：酵母膏2.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，K2HPO4·7H2O 3.5g，KH2PO4 1.5g，NaCl 2.5g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。发酵培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。
1.2 方法
1.2.1 蛋白酶活力的测定[2]
1.2.1.1 酪氨酸标准曲线制作 配制10、20、30、40、50、60μg/mL的酪氨酸标准溶液，配制2%酪蛋白溶液;然后分别取上述溶液各1mL，各加0.55mol/L碳酸钠溶液5mL、Folin-酚试剂溶液1mL，振荡均匀，于40℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于680nm，不含酪氨酸的反应体系为空白，分别测其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.2.1.2 待测酶液蛋白酶活力测定 将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中，预热5min;取1mL粗酶液加入2mL预热好的酪蛋白溶液中混匀后放入40℃水浴中保温10min后加入1mL10%TCA终止反应，取1mL上清液加入0.55mol/LNa2CO3 5mL，加入1mLFolin-酚试剂至40℃水浴显色20min后于680nm下测定吸光值，以加热灭活的酶液反应体系为空白。酶活力单位定义：40℃下，每分钟水解酪蛋白底物产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。计算公式：
蛋白酶活力（U/mL）=A×K×4÷10×n
式中：A：粗酶液平行实验的OD值;K：吸光常数;n：蛋白酶的液的稀释倍数;4：反应试剂的总体积;10：反应时间10min;所得结果表示至整数 1.2.2 发酵条件优化
1.2.2.1 单因素试验 选择培养基初始pH、接种量、培养温度、培养时间为影响蛋白酶活性的主要因素，通过单因素试验考察以上因素对LS-1产蛋白酶的影响。培养完成后，将发酵液在4℃，6000r离心10min取上清液测定酶活。（1）培养基初始pH：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，分别利用1.0M HCl溶液和1.0M NaOH溶液调整培养基pH为4.0～11.0，每个pH做3个平行，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于摇床150r、37℃培养48h。（2）接种量：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液分别按照2%、4%、6%、8%、10%的接种量分别接入三角瓶内，每个接种量做3个平行，于摇床150r、37℃培养48h。（3）培养温度：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃5个温度摇床150r培养48h，每个温度做3个平行。（4）培养时间：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于摇床150r、37℃分别培养12h、24h、48h、60h、72h，每个时间点做3个平行。
1.2.2.2 正交试验 根据单因素试验的结果，选取对LS-1产酶影响较大的因素设计正交实验。
2 结果与分析
2.1 酪氨酸标准曲线 详见图1。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 培养基初始pH对LS-1产酶的影响 由图2可知，LS-1在碱性环境中产酶能力较高，当培养基初始pH为11时，其酶活可达362.2U/mL。
2.2.2 接种量对LS-1产酶的影响 由图3可知，LS-1所产蛋白酶的酶活在接种量为2%～10%无显著性差异，说明接种量对产酶影响不大。
2.2.3 培养温度对LS-1产酶的影响 由图4可知，LS-1在40℃培养时，蛋白酶酶活最高，为242.9U/mL;当培养温度为50℃时酶活仍然较高，达238.2U/mL。说明LS-1在20～50℃时均能生长并产生蛋白酶，在40～50℃温度范围具有一定耐热性。当培养温度为60℃时酶活明显下降，可能是温度过高不适宜菌株生长或者是高温下蛋白酶活力丧失所致。
2.2.4 培养时间对LS-1产酶的影响 由图5可知，随着培养时间的延长，LS-1产蛋白酶活力逐渐上升，48h时酶活最高为276.7U/mL;而当培养时间达到60h后，蛋白酶活力略有下降，可能是菌株生长进入衰退期，产蛋白酶能力有所下降。
2.3 正交实验结果 根据单因素实验结果比较分析得出，接种量对LS-1产蛋白酶活力无显著影响，而培养时间、培养温度、初始pH的影响较大，故设计L9（33）的正交实验（见表1、表2）。由表2可知，对菌株LS-1產酶影响的主次顺序为B（培养温度）>A（培养时间）>C（初始pH），通过优化得到的产酶最佳条件是A2B2C3，即培养基初始pH为12，40℃下培养48h，LS-1酶活最高，为307.3U/mL。
3 讨论
中国浓香型白酒的生产采用固态发酵模式，在其发酵过程中存在丰富的微生物种群，其中分泌蛋白酶的微生物，能将物料中的蛋白质分解成小分子有机物质氨基酸，这些氨基酸会被微生物利用代谢，同时会提供丰富的前体物质促进白酒中香味物质的产生[3]。曾德勇[4]等在酱香型高温大曲中筛出了高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。马特[5]等在白酒窖泥中初筛出8株可产蛋白酶的菌株，复筛出3种高产蛋白酶的菌株分别为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。王俊英[6]等使用牛奶平板从酒曲中分离出6株有明显水解圈的产蛋白酶的菌株，其中直径比最大的为芽孢杆菌，最适产酶温度为40℃。
本实验中菌株LS-1从高温酒曲中分离，所产蛋白酶活力较高，在50℃生长仍然能够生长并分泌胞外蛋白酶，说明该菌株和其分泌蛋白酶均具有一定耐热性。下一步将对其酶学性质进行研究，为该酶在实际生产中的应用提供理论支持。
参考文献
[1]Banik R M，Prakash M.Laundry detergent compatibility of the alkaline protease from Bacillus cereus[J].Microbiol Res.，2004，159：135-140.
[2]张彩莹，肖连冬.生物化学实验[M].北京：化学工业出版社，2009：10-67.
[3]刘晓光，谢和，屈直.酱香型白酒风味物质的形成与微生物关系的研究现状与进展[J].贵州农业科学，2007，35（2）：131-134.
[4]曾德勇，方镒，刘涛，等.酱香型高温大曲中高产蛋白酶细菌的分离及鉴定[J].酿酒科技，2015（3）：27-30.
[5]马特，宋连宝，赵辉.白酒窖泥中蛋白酶产生菌的筛选及复配[J].食品科学，2016，37（7）：146-151.
[6]王俊英，侯小歌，张杰，等.酒曲中高蛋白酶产生菌筛选及酶学性质研究[J].中国酿造，2012，31（4）：33-36.
（责编：张宏民）
关键词：蛋白酶;地衣芽孢杆菌;发酵条件
中图分类号 Q939.97 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）24-0022-3
Abstract：Objective：The fermentation conditions were optimized for improve protease yield of strain LS-1（Baclicus lincheniformis）.Methods：Strain LS-1 was used as the starting strain，and single factor test was performed from four aspects including medium pH，inoculating quantity，culture temperature and culture time to explore its fermenting conditions，then orthogonal experimengts were carried out to optimize its fermenting conditions.Results：The best fermenting conditions were summed up as follows： the inoculation quantity was 4%，medium pH was 12，culture temperature was at 40℃，and culture time was 48h.Under optimized conditions ，the protease activity was up to 307.3U/mL.
Key words：Protease;Baclicus lincheniformis;Fermentation condition
蛋白酶（proteases，proteinases），也稱为肽酶（peptidases），是能水解蛋白质和多肽的一群酶类，它们可以催化蛋白质或肽类的肽键降解，广泛存在于动物、植物和微生物中，约占所有蛋白质的2%。来源不同的蛋白酶，执行的功能也不同，例如，胞内蛋白酶与细胞的催化和调节作用有关，胞外分泌的蛋白酶则在降解氮源或其他能源底物中扮演了重要角色。蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，约占世界酶类销售总额的60%，其在食品、医药、纺织、制革、洗涤剂、化妆品以及废物处理等行业都有着较好的应用前景[1]。
本实验室从高温酒曲中分离产蛋白酶菌株LS-1，经鉴定为地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）。本研究拟以该菌株为研究对象，对其发酵条件进行优化，为该蛋白酶资源的开发与利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验菌株 地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）LS-1，由本实验室分离、保藏。
1.1.2 主要试剂与仪器 试剂：酪蛋白、牛肉膏、琼脂粉等均为生物纯，北京奥博星;葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、 KH2PO4等均为分析纯，天津科密欧;酪氨酸，分析纯，sigma进口分装;Folin-酚试剂：上海国药。仪器：上海精宏DNP-9052电热恒温培养箱;上海智诚ZHWY-2102恒温培养振荡器;德国艾本德5430R高速台式冷冻离心机;上海跃进XMTD-204数显式恒温水浴锅;上海仪电雷磁PHS-3CpH计;上海舜宇恒平MP2002电子天平;申安LDZX-50KBS高压灭菌锅;奥林巴斯CX23双目光学显微镜;上海精科752N分光光度计。
1.1.3 培养基 种子培养基：酵母膏2.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，K2HPO4·7H2O 3.5g，KH2PO4 1.5g，NaCl 2.5g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。发酵培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。
1.2 方法
1.2.1 蛋白酶活力的测定[2]
1.2.1.1 酪氨酸标准曲线制作 配制10、20、30、40、50、60μg/mL的酪氨酸标准溶液，配制2%酪蛋白溶液;然后分别取上述溶液各1mL，各加0.55mol/L碳酸钠溶液5mL、Folin-酚试剂溶液1mL，振荡均匀，于40℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于680nm，不含酪氨酸的反应体系为空白，分别测其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.2.1.2 待测酶液蛋白酶活力测定 将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中，预热5min;取1mL粗酶液加入2mL预热好的酪蛋白溶液中混匀后放入40℃水浴中保温10min后加入1mL10%TCA终止反应，取1mL上清液加入0.55mol/LNa2CO3 5mL，加入1mLFolin-酚试剂至40℃水浴显色20min后于680nm下测定吸光值，以加热灭活的酶液反应体系为空白。酶活力单位定义：40℃下，每分钟水解酪蛋白底物产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。计算公式：
蛋白酶活力（U/mL）=A×K×4÷10×n
式中：A：粗酶液平行实验的OD值;K：吸光常数;n：蛋白酶的液的稀释倍数;4：反应试剂的总体积;10：反应时间10min;所得结果表示至整数 1.2.2 发酵条件优化
1.2.2.1 单因素试验 选择培养基初始pH、接种量、培养温度、培养时间为影响蛋白酶活性的主要因素，通过单因素试验考察以上因素对LS-1产蛋白酶的影响。培养完成后，将发酵液在4℃，6000r离心10min取上清液测定酶活。（1）培养基初始pH：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，分别利用1.0M HCl溶液和1.0M NaOH溶液调整培养基pH为4.0～11.0，每个pH做3个平行，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于摇床150r、37℃培养48h。（2）接种量：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液分别按照2%、4%、6%、8%、10%的接种量分别接入三角瓶内，每个接种量做3个平行，于摇床150r、37℃培养48h。（3）培养温度：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃5个温度摇床150r培养48h，每个温度做3个平行。（4）培养时间：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于摇床150r、37℃分别培养12h、24h、48h、60h、72h，每个时间点做3个平行。
1.2.2.2 正交试验 根据单因素试验的结果，选取对LS-1产酶影响较大的因素设计正交实验。
2 结果与分析
2.1 酪氨酸标准曲线 详见图1。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 培养基初始pH对LS-1产酶的影响 由图2可知，LS-1在碱性环境中产酶能力较高，当培养基初始pH为11时，其酶活可达362.2U/mL。
2.2.2 接种量对LS-1产酶的影响 由图3可知，LS-1所产蛋白酶的酶活在接种量为2%～10%无显著性差异，说明接种量对产酶影响不大。
2.2.3 培养温度对LS-1产酶的影响 由图4可知，LS-1在40℃培养时，蛋白酶酶活最高，为242.9U/mL;当培养温度为50℃时酶活仍然较高，达238.2U/mL。说明LS-1在20～50℃时均能生长并产生蛋白酶，在40～50℃温度范围具有一定耐热性。当培养温度为60℃时酶活明显下降，可能是温度过高不适宜菌株生长或者是高温下蛋白酶活力丧失所致。
2.2.4 培养时间对LS-1产酶的影响 由图5可知，随着培养时间的延长，LS-1产蛋白酶活力逐渐上升，48h时酶活最高为276.7U/mL;而当培养时间达到60h后，蛋白酶活力略有下降，可能是菌株生长进入衰退期，产蛋白酶能力有所下降。
2.3 正交实验结果 根据单因素实验结果比较分析得出，接种量对LS-1产蛋白酶活力无显著影响，而培养时间、培养温度、初始pH的影响较大，故设计L9（33）的正交实验（见表1、表2）。由表2可知，对菌株LS-1產酶影响的主次顺序为B（培养温度）>A（培养时间）>C（初始pH），通过优化得到的产酶最佳条件是A2B2C3，即培养基初始pH为12，40℃下培养48h，LS-1酶活最高，为307.3U/mL。
3 讨论
中国浓香型白酒的生产采用固态发酵模式，在其发酵过程中存在丰富的微生物种群，其中分泌蛋白酶的微生物，能将物料中的蛋白质分解成小分子有机物质氨基酸，这些氨基酸会被微生物利用代谢，同时会提供丰富的前体物质促进白酒中香味物质的产生[3]。曾德勇[4]等在酱香型高温大曲中筛出了高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。马特[5]等在白酒窖泥中初筛出8株可产蛋白酶的菌株，复筛出3种高产蛋白酶的菌株分别为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。王俊英[6]等使用牛奶平板从酒曲中分离出6株有明显水解圈的产蛋白酶的菌株，其中直径比最大的为芽孢杆菌，最适产酶温度为40℃。
本实验中菌株LS-1从高温酒曲中分离，所产蛋白酶活力较高，在50℃生长仍然能够生长并分泌胞外蛋白酶，说明该菌株和其分泌蛋白酶均具有一定耐热性。下一步将对其酶学性质进行研究，为该酶在实际生产中的应用提供理论支持。
参考文献
[1]Banik R M，Prakash M.Laundry detergent compatibility of the alkaline protease from Bacillus cereus[J].Microbiol Res.，2004，159：135-140.
[2]张彩莹，肖连冬.生物化学实验[M].北京：化学工业出版社，2009：10-67.
[3]刘晓光，谢和，屈直.酱香型白酒风味物质的形成与微生物关系的研究现状与进展[J].贵州农业科学，2007，35（2）：131-134.
[4]曾德勇，方镒，刘涛，等.酱香型高温大曲中高产蛋白酶细菌的分离及鉴定[J].酿酒科技，2015（3）：27-30.
[5]马特，宋连宝，赵辉.白酒窖泥中蛋白酶产生菌的筛选及复配[J].食品科学，2016，37（7）：146-151.
[6]王俊英，侯小歌，张杰，等.酒曲中高蛋白酶产生菌筛选及酶学性质研究[J].中国酿造，2012，31（4）：33-36.
（责编：张宏民）