【摘 要】
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目的 建立检测人血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)胶原结合活性(collagen-binding assay,CBA)的酶联免疫吸附测定法,验证后用于vWF纯化工艺的探索.方法 用微量滴
【机 构】
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武汉生物制品研究所有限责任公司血液制剂研究室,湖北武汉,430207
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目的 建立检测人血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)胶原结合活性(collagen-binding assay,CBA)的酶联免疫吸附测定法,验证后用于vWF纯化工艺的探索.方法 用微量滴定板做载体,以人Ⅲ型胶原包被酶标板,HRP标记的人抗vWF为检测抗体,通过筛选不同的包被条件、胶原质量浓度及检测抗体含量确定其反应参数,建立人vWF胶原结合活性检测方法,同时验证该方法的准确度、精密度、特异性、选择性及样品稳定性,并初步应用于vWF纯化工艺的探索.结果 使用pH 9.5碳酸盐缓冲液包被胶原,包被质量浓度为20 μg/mL,检测抗体稀释度为1:4000,国际标准品的线性范围为51.500 ～ 3.218 mIU/mL,R2≥0.999.定量上限为51.500 mIU/mL,回收率在81.60％～105.08％;定量下限为3.218 IU/mL,回收率在90.50％ ～ 108.18％,CV均≤5.0％;高、中、低浓度质控样品的回收率在80.3％～ 109.6％范围内;批内CV值≤8.0％,批间CV值≤6.4％.当NaCl浓度在55 ～ 350 mmol/L、CaCl2浓度≤125 mmol/L时,定量上限的活性回收率在80％～ 120％范围内;当vWF/FⅧ＞0.1时,质控样品准确度在100％±25％范围内;vWF标准品在室温放置2h的回收率在88.06％～ 87.21％,于-80 ℃反复冻融的回收率在80.55％ ～ 103.11％范围内,于-20℃反复冻融的回收率在55.28％ ～ 79.55％范围内.结论 建立了人vWF胶原结合实验,该方法具有良好的准确度、精密度、选择性和特异性,可用于vWF纯化工艺样品中vWF的胶原结合活性检测.
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