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【摘要】 目的 探討脊柱结核伴脊髓损害急诊手术后结核杆菌全身扩散的风险。方法 研究组（44例）为脊柱结核伴脊髓损害并进行急诊手术治疗的患者;对照组（59例）为脊柱结核伴脊髓损害进行择期手术治疗的患者。分别在术前1天、术后第1天和术后第7天抽取外周血提取结核分枝杆菌DNA（Mycobacterium tuberculosis DNA，MTBDNA），PCR扩增，进行MTBDNA即时荧光定量检测，经对比分析研究，评估脊柱结核伴脊髓损害急诊手术后结核杆菌全身扩散的风险。结果 术前1天、术后第1天和术后第7天外周血结核杆菌的DNA阳性率研究组分别为50.0%（22/44）、56.8%（25/44）和31.8%（14/44），对照组分别为49.1%（29/59）、52.5%（31/59）和33.9%（20/59）;其中，研究组术前1天、术后第1天和术后第7天外周血结核杆菌的含量变化差异无统计学意义（F=0.08，P=0.920）;对照组术前1天、术后第1天和术后第7天外周血结核杆菌的含量变化差异无统计学意义（F=1.29，P=0.084）;研究组和对照组术前1天、术后第1天和术后第7天的结核杆菌DNA含量组间比较差异无统计学意义（t值分别为1.415、0.158、0.144，P值分别为0.078、0.874、0.889）。结论 脊柱结核伴脊髓损害患者，术前没有结核杆菌耐药表现，术后正规抗结核治疗，急诊及择期手术前后外周血结核杆菌DNA含量测定无明显差异，提示脊柱结核伴脊髓损害患者急诊手术并没有造成结核杆菌全身外周血扩散的风险。
【关键词】 脊柱结核;脊髓损害;荧光定量聚合酶链反应;脱氧核糖核酸
中图分类号：R529.2 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.10031-383.2019.06.003
【Abstract】 Objective To study the risk of systemic diffusion of mycobacterium tuberculosis after emergency operation for spinal tuberculosis with spinal cord injury.Methods 44 cases of spinal tuberculosis with spinal cord lesion who underwent emergency operation were selected as research group，and 59 cases of spinal tuberculosis with spinal cord injury who underwent selective operation were selected as control group.Mycobacterium tuberculosis DNA（MTBDNA） was extracted from peripheral blood on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation，respectively.Realtime fluorescence quantitative detection of MTBDNA was carried out by PCR amplification.And the risk of systemic diffusion of mycobacterium tuberculosis after emergency surgery for spinal tuberculosis with spinal cord injury was evaluated by comparative analysis.Results The DNA positive rate of mycobacterium tuberculosis in peripheral blood was 50.0%（22/44），56.8%（25/44） and 31.8%（14/44） in the research group on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation，respectively，and 49.1%（29/59），52.5%（31/59） and 33.9%（20/59） in the control group，respectively.There was no statistically significant difference in the contents of mycobacterium tuberculosis in peripheral blood in the research group on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation（F=0.08，P=0.920）.There was no statistically significant difference in the contents of mycobacterium tuberculosis in peripheral blood in the control group on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation（F=1.29，P=0.084）.In addition，there was no statistically significant difference in the contents of mycobacterium tuberculosis between the research group and the control group on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation（t=1.415，0.158，0.144，P=0.078，0.874，0.889，respectively）.Conclusion There was no drug resistance of mycobacterium tuberculosis in patients with spinal tuberculosis with spinal cord injury before operation，and regular antituberculosis treatment was performed after operation.Difference in the contents of mycobacterium tuberculosis in peripheral blood before and after emergency operation and selective operation was not significant，which shows that emergency operation in patients with spinal tuberculosis with spinal cord injury does not cause the risk of systemic diffusion of mycobacterium tuberculosis. 【Key words】 spinal tuberculosis;spinal cord injury;fluorescence quantitative polymerase chain reaction;deoxyribonucleic acid（DNA）
传统观点认为脊柱结核伴脊髓损害患者进行手术治疗要严格掌握手术时机，比如术前抗结核治疗不少于2周，而且脊柱局部疼痛减轻，食欲好转，一般情况较好，体温大致正常，血沉及血红蛋白接近正常等状态下手术则比较安全[1]。但临床治疗过程往往面临比较复杂的局面，如脊柱结核伴脊髓损害进行性加重的病例，结核病灶往往呈活动性表现，病灶处脓液比较多，未经手术清除病灶，血沉及C反应蛋白等难以降至正常，同时患者及家属又比较焦虑等社会心理因素，不能接受抗结核治疗至少2周及以上才能手术，那么对此类患者提早急诊手术是否安全？是否会导致术后结核杆菌在体内的播散？一直是临床医生期待解决的问题。随着抗痨药物及外科手术技术和内固定技术的提高，脊柱结核的外科治疗近年来取得较大进步[2～4]，目前一些学者在临床实践进行不少尝试[5]，但仍有很多争议[6]。应用聚合酶链反应（PCR）检测外周血中单个核细胞的结核分枝杆菌DNA（TBDNA）的技术不仅能反映感染的程度，还能判断治疗效果和预测预后的原理和优势[7～8]。鉴于此，本课题选择103例脊柱结核伴脊髓损害的患者在术前1天、术后第1天、术后第7天抽取外周血提取结核分枝杆菌DNA（Mycobacterium tuberculosis DNA，MTBDNA），PCR扩增，进行结核分枝杆菌DNA即时荧光定量检测，通过术前1天、术后第1天结核分枝杆菌DNA检测与对比分析研究，评估脊柱结核伴脊髓损害急诊手术的风险与安全性，以及术后结核杆菌全身扩散的风险，现总结如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象及材料
1.1.1 设计 非随机同期对照分析。
1.1.2 时间及地点 于2008年1月到2018年12月在右江民族医学院附属医院脊柱骨病外科和检验科完成。
1.1.3 对象 对2008年1月至2016年12月间在右江民族医学院附属医院诊治的103例结核性压迫性不完全性脊髓损害的患者进行研究。103例患者全部为男性，年龄18～55岁，平均（34.30±12.34）岁。其中颈椎结核14例，胸椎结核25例（胸1～胸10），胸腰段结核41例（胸11～腰1），腰椎结核23例（腰2～腰5）。所有患者都经过手术治疗。按是否急诊手术分为研究组（44例，急诊手术）和对照组（59例，非急诊手术），所有研究组患者均未接受抗结核治疗，此类患者都是来自经济欠发达的农村地区，求医意识不强，只有病重导致活动困难才来就医，即发病就出现脊髓神经损害症状且进行性加重表现，发病到急诊手术的时间均在48 h内。所有对照组患者都进行规范抗结核治疗，此类患者大部分分布在经济相对发达的县区和乡镇所在地，求医意识相对较强，虽然已经进行规范抗结核治疗，但疗效欠佳并出现脊髓神经损害症状但未进行性加重，从发病到手术的间隔时间在2 d～1周者31例，在1周以上者28例。两组脊柱结核患者均为压迫性不完全性脊髓损害，术前按Frankel分级：研究组B级18例，C级18例，D级8例;对照组B级10例，C级28例，D级21例。所有患者既往病史均无性功能障碍病史，术后随访10～20个月，平均（16.6±5.8）个月。
1.1.4 钢板材料 为钛合金脊柱内固定，理化性质稳定。购自苏州欣荣博尔特医疗器械有限公司（YZB/国1269《脊柱内固定器》）。经过测试，目前未见有细胞毒性的报道，血液及组织相容性问题未见有不良报道。理论使用寿命15～25年。
1.2 入选与排除标准
1.2.1 脊柱结核诊断标准[9～11] ①有结核病史或结核病接触史。②有低热、盗汗、乏力等结核中毒症状。③有脊柱局部疼痛、压痛和叩击痛或后突成角畸形、脊柱活动受限、拾物试验阳性等体征。④可有寒性脓肿形成或合并不完全性或完全性截瘫。⑤影像及实验室改变：脊椎X线及CT或MRI检查显示椎体不规则骨质破坏或有椎体塌陷、空洞，死骨形成，椎间隙变窄或消失或椎旁有寒性脓肿阴影或椎管内病变及脊髓受压;结核病变活动期血沉可增快。
1.2.2 脊柱结核手术适应证[12～13] ①脊柱结核椎体明显破坏或明显畸形，伴有椎旁较大寒性脓肿或大量死骨。②脊柱结核造成脊髓压迫引起神经体征。③脊柱稳定性有明显破坏。④必须植骨以恢复椎体高度者。⑤合并脊柱后凸畸形需矫正者。⑥保守治疗效果不佳的混合感染或病程较长者或窦道形成且合并感染者。⑦持续疼痛或血沉持续在高位。
1.2.3 纳入标准 ①符合脊柱結核诊断标准者。②有脊髓急性损害的表现。③均采用结核病灶清除、自体髂骨植骨、加或不加钢板内固定治疗者，痊愈出院并完整随访12～24个月（内固定的使用有严格的指征：绝对指征为术前或病灶清除术后脊柱明显不稳，脊柱严重或进行性后凸畸形[12]）。
1.2.4 排除标准 脊柱肿瘤与术后病理证实为非结核病的患者。
1.3 方法
1.3.1 治疗方式 均予结核病灶清除、自体髂骨植骨、加或不加钢板内固定治疗。其中内固定68例，无内固定35例。见图1A～H。
1.3.2 实验步骤
1.3.2.1 标本收集 在手术前1天及手术后第1天、术后第7天晨8点空腹采集103例脊柱结核患者外周血3 mL并用枸橼酸钠抗凝冻存备用。
1.3.2.2 DNA提取 按实验操作要求将浓度为2%的EDTA总体积的1/10加入到留有静脉血3 mL的试管中，摇匀;室温下，2000转/分离心20 min;将细胞层转移到含有5 mL红细胞裂解液（SACK）的离心管中，摇匀，冰上存放20 min;室温下，2000转/分再离心20 min;弃上清液，提取DNA（取50 μL TBDNA提取物加入上述沉淀物中，摇匀后超声处理5～7 min使细胞壁和细胞膜破坏，15 000转/分，离心10 min，留取含TBDNA的上清液备检）。 1.3.2.3 PCR扩增 按实验操作样品数n在1离心管中分别加入TB缓冲液n×18 μL，MgCl2 n×3 μL，TB荧光探针n×3 μL，Taq酶n×2 μL摇匀后在旋涡振荡器上再振荡10 s，低速离心数秒后按每管26 μL分装。处理上清液，在反应管中加入阴性对照品及校准品各4 μL，混匀后置于PCR 仪上，立即进行PCR扩增反应（条件：50℃预反应2 min，94℃预变性5 min，94℃5 s，60℃40 s，循环40次）。
1.3.2.4 结果判断 ①PCR产物：将1.5 μL 6×上样缓冲液与8 μL产物混合摇匀，加样于1%琼脂糖，电泳缓冲液为1×TBE，恒压100 V下电泳30 min，观察在紫外线下163 bp的DNA片段，有DNA带为阳性结果，无DNA带为阴性结果。②荧光定量产物：反应结束后，利用Sequence Detector V 6.3软件给予数据处理，按照每批实验中的阳性对应的报告荧光信号数值，建立标准曲线，通过测定每一个待测样品的循环数阈值（threshold cycle，Ct），应用标准曲线计算出检测样品中的扩增片段的拷贝数。
1.4 统计学方法 所有的统计学分析均使用SPSS 17.0统计数据软件包。数值变量采用均数±标准差（±s）进行统计描述，采用多个相关样本非参数检验（Friedman检验）比较研究组和对照组术前1天、术后第1天及术后第7天外周血结核杆菌含量变化的差异;采用重复测量的方差分析，比较两组患者在术前1天、术后第1天及术后第7天三个不同时间点结核杆菌含量的差异;采用χ2检验比较计数资料。检验水准：α=0.05，双侧检验。
2 结 果
2.1 提取的结核分枝杆菌DNA PCR扩增产物结果 扩增结果呈阳性表现，证实为结核杆菌核酸。见图2。
2.2 荧光定量PCR反应的特异性 脊柱结核患者外周血扩增结果均为阳性，说明该引物所扩增的靶序列是针对结核分枝杆菌的序列，本研究设计的引物是符合实验要求的。
2.3 荧光定量PCR反应的灵敏度 纯化的结核分枝杆菌染色体基因组DNA经过7530G型紫外分光光度计定量，从每μL 100 ng开始，10倍稀释到1 fg，并对结核分枝杆菌菌体进行10倍稀释，分别进行荧光定量PCR检测3次。结果显示荧光定量PCR的灵敏度可达10 fg DNA和1～5个菌体/mL。
2.4 脊柱结核患者外周血结核分枝杆菌DNA含量荧光定量PCR的檢测结果 术前1天、术后第1天和术后第7天外周血结核杆菌的DNA阳性率两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。阳性标准：外周血结核分枝杆菌DNA定量≥NX105 拷贝/mL为阳性。对原始数据进行数据转换后，采用多个相关样本非参数检验和重复测量的方差分析，结果见表2。
3 讨 论
目前，对于是否在脊柱结核进行性加重的情况下急诊手术解救脊髓功能一直是骨科专家争议的焦点，尚未形成统一的意见或见解[14～17]。然而，关注于在此条件下急诊手术是否会导致结核杆菌随血液全身扩散或是否会导致手术失败或是否会危及生命等研究较少[18～20]。脊柱结核作为一种部位特殊的骨关节结核及最常见的肺外结核，约占骨关节结核的95%，结核病灶清除、椎管减压、矫正畸形及重建脊柱稳定性[21～23]等外科手术仍是脊柱结核治疗的重要手段及措施，对避免出现脊柱严重破坏、畸形加重、严重压迫和损害脊髓等具有深远的意义。因此，本研究通过检测44例急诊手术和59例非急诊手术的脊柱结核患者术前1天、术后第1天和术后第7天外周血中单核细胞的结核杆菌DNA含量并比较两者的差异，有助于研究者进一步探索脊柱结核进行性加重情况下急诊手术解救脊髓功能的治疗方法和措施。
本课题组在研究借鉴同类患者的相关文献资料的基础上[24～26]，对部分患者的治疗作了初步的探索研究。结果显示，提取的结核杆菌DNA产物经PCR扩增后得到良好的结果。荧光定量PCR反应的特异性和灵敏度均达到了实验要求。研究组44例患者中，术前1天外周血中单核细胞的结核杆菌DNA含量结果为阳性的有22例，术后第1天为25例，术后第7天为14例。对照组59例患者中，术前1天、术后第1天、术后第7天外周血中单核细胞的结核杆菌DNA含量结果为阳性的分别有29例、31例、20例。从理论值上看，研究组急诊手术的脊柱结核患者术后第1天的阳性率仅比术前1天多1例，比术后第7天多11例;对照组非急诊手术的脊柱结核患者术后第1天的阳性率比术前1天多2例，比术后第7天多9例。这与结核分枝杆菌在体外的研究有相似的结果[27～31]。因此研究者认为两组脊柱结核患者术后并没有导致结核杆菌全身扩散等灾难性后果。
同时，本研究曾计划按术前和术后采血进行结核杆菌培养以对比手术是否增加血中的结核菌数量，但费时且结核杆菌计数困难，对指导抗结核治疗意义有限。而通过外周血结核分枝杆菌DNA定量检测能即时了解患者结核杆菌相对量及耐药分布情况。因此，本研究改用即时荧光定量PCR技术多点测定脊柱结核患者外周血结核杆菌DNA含量，观察患者术后结核杆菌分布情况。通过对两组患者术前术后3个不同时间点外周血中单核细胞的结核杆菌DNA含量变化对比研究，发现两组患者手术前后3个时间点外周血单核细胞结核杆菌DNA含量变化比较均无明显差异;而且两组患者3个时间点外周血单核细胞结核杆菌DNA含量比较亦无明显差异。从表1、表2结果看，两组术后第1天和术后第7天外周血单核细胞结核杆菌DNA含量阳性率并不明显增加反而呈下降趋势。说明研究组和对照组术后结核杆菌在血液全身扩散的风险并没有增加。
本课题组研究表明对于此类脊柱结核特殊患者，如果出现脊髓进行性加重损害等，尽管抗结核治疗尚不足2周，血沉仍未降至40 mm/L或接近正常，在病情无其他生命危险等手术禁忌证的条件下进行急诊手术抢救脊髓功能是安全的。尽管相关结果是基于小样本基础上得出的初步结果，多中心、大样本的研究结果是否有相似的结果仍有待进一步研究，但对于此类患者进行急诊手术抢救脊髓功能仍有一定的借鉴意义。 基于以上小样本研究结果，本课题认为通过对比研究脊柱结核患者手术前后3个不同时间点外周血即时监测结核杆菌DNA含量的改变，并未发现术后结核杆菌随血液全身扩散的危险。因此对于脊柱结核特别是脊髓进行性加重的脊柱结核患者，尽管抗结核治疗不足2周或血沉未降至预期水平，为抢救可能进一步加重的脊髓功能，急診手术解除压迫和重建脊柱稳定有一定的临床借鉴意义，本结果仅仅是对此类患者治疗的初步探索研究，因此对这类病例要具体分析具体解决。但对于其他普通骨关节结核患者是否可按此方法进行治疗是本课题研究的另一方向。特别是术前术后多点外周血监测结核杆菌DNA含量将为此类患者提供更多数据和理论依据。
参 考 文 献
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（收稿日期：2019-03-04 修回日期：2019-04-26）
（编辑：潘明志）
【关键词】 脊柱结核;脊髓损害;荧光定量聚合酶链反应;脱氧核糖核酸
中图分类号：R529.2 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.10031-383.2019.06.003
【Abstract】 Objective To study the risk of systemic diffusion of mycobacterium tuberculosis after emergency operation for spinal tuberculosis with spinal cord injury.Methods 44 cases of spinal tuberculosis with spinal cord lesion who underwent emergency operation were selected as research group，and 59 cases of spinal tuberculosis with spinal cord injury who underwent selective operation were selected as control group.Mycobacterium tuberculosis DNA（MTBDNA） was extracted from peripheral blood on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation，respectively.Realtime fluorescence quantitative detection of MTBDNA was carried out by PCR amplification.And the risk of systemic diffusion of mycobacterium tuberculosis after emergency surgery for spinal tuberculosis with spinal cord injury was evaluated by comparative analysis.Results The DNA positive rate of mycobacterium tuberculosis in peripheral blood was 50.0%（22/44），56.8%（25/44） and 31.8%（14/44） in the research group on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation，respectively，and 49.1%（29/59），52.5%（31/59） and 33.9%（20/59） in the control group，respectively.There was no statistically significant difference in the contents of mycobacterium tuberculosis in peripheral blood in the research group on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation（F=0.08，P=0.920）.There was no statistically significant difference in the contents of mycobacterium tuberculosis in peripheral blood in the control group on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation（F=1.29，P=0.084）.In addition，there was no statistically significant difference in the contents of mycobacterium tuberculosis between the research group and the control group on one day before operation，the first day after operation and the seventh day after operation（t=1.415，0.158，0.144，P=0.078，0.874，0.889，respectively）.Conclusion There was no drug resistance of mycobacterium tuberculosis in patients with spinal tuberculosis with spinal cord injury before operation，and regular antituberculosis treatment was performed after operation.Difference in the contents of mycobacterium tuberculosis in peripheral blood before and after emergency operation and selective operation was not significant，which shows that emergency operation in patients with spinal tuberculosis with spinal cord injury does not cause the risk of systemic diffusion of mycobacterium tuberculosis. 【Key words】 spinal tuberculosis;spinal cord injury;fluorescence quantitative polymerase chain reaction;deoxyribonucleic acid（DNA）
传统观点认为脊柱结核伴脊髓损害患者进行手术治疗要严格掌握手术时机，比如术前抗结核治疗不少于2周，而且脊柱局部疼痛减轻，食欲好转，一般情况较好，体温大致正常，血沉及血红蛋白接近正常等状态下手术则比较安全[1]。但临床治疗过程往往面临比较复杂的局面，如脊柱结核伴脊髓损害进行性加重的病例，结核病灶往往呈活动性表现，病灶处脓液比较多，未经手术清除病灶，血沉及C反应蛋白等难以降至正常，同时患者及家属又比较焦虑等社会心理因素，不能接受抗结核治疗至少2周及以上才能手术，那么对此类患者提早急诊手术是否安全？是否会导致术后结核杆菌在体内的播散？一直是临床医生期待解决的问题。随着抗痨药物及外科手术技术和内固定技术的提高，脊柱结核的外科治疗近年来取得较大进步[2～4]，目前一些学者在临床实践进行不少尝试[5]，但仍有很多争议[6]。应用聚合酶链反应（PCR）检测外周血中单个核细胞的结核分枝杆菌DNA（TBDNA）的技术不仅能反映感染的程度，还能判断治疗效果和预测预后的原理和优势[7～8]。鉴于此，本课题选择103例脊柱结核伴脊髓损害的患者在术前1天、术后第1天、术后第7天抽取外周血提取结核分枝杆菌DNA（Mycobacterium tuberculosis DNA，MTBDNA），PCR扩增，进行结核分枝杆菌DNA即时荧光定量检测，通过术前1天、术后第1天结核分枝杆菌DNA检测与对比分析研究，评估脊柱结核伴脊髓损害急诊手术的风险与安全性，以及术后结核杆菌全身扩散的风险，现总结如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象及材料
1.1.1 设计 非随机同期对照分析。
1.1.2 时间及地点 于2008年1月到2018年12月在右江民族医学院附属医院脊柱骨病外科和检验科完成。
1.1.3 对象 对2008年1月至2016年12月间在右江民族医学院附属医院诊治的103例结核性压迫性不完全性脊髓损害的患者进行研究。103例患者全部为男性，年龄18～55岁，平均（34.30±12.34）岁。其中颈椎结核14例，胸椎结核25例（胸1～胸10），胸腰段结核41例（胸11～腰1），腰椎结核23例（腰2～腰5）。所有患者都经过手术治疗。按是否急诊手术分为研究组（44例，急诊手术）和对照组（59例，非急诊手术），所有研究组患者均未接受抗结核治疗，此类患者都是来自经济欠发达的农村地区，求医意识不强，只有病重导致活动困难才来就医，即发病就出现脊髓神经损害症状且进行性加重表现，发病到急诊手术的时间均在48 h内。所有对照组患者都进行规范抗结核治疗，此类患者大部分分布在经济相对发达的县区和乡镇所在地，求医意识相对较强，虽然已经进行规范抗结核治疗，但疗效欠佳并出现脊髓神经损害症状但未进行性加重，从发病到手术的间隔时间在2 d～1周者31例，在1周以上者28例。两组脊柱结核患者均为压迫性不完全性脊髓损害，术前按Frankel分级：研究组B级18例，C级18例，D级8例;对照组B级10例，C级28例，D级21例。所有患者既往病史均无性功能障碍病史，术后随访10～20个月，平均（16.6±5.8）个月。
1.1.4 钢板材料 为钛合金脊柱内固定，理化性质稳定。购自苏州欣荣博尔特医疗器械有限公司（YZB/国1269《脊柱内固定器》）。经过测试，目前未见有细胞毒性的报道，血液及组织相容性问题未见有不良报道。理论使用寿命15～25年。
1.2 入选与排除标准
1.2.1 脊柱结核诊断标准[9～11] ①有结核病史或结核病接触史。②有低热、盗汗、乏力等结核中毒症状。③有脊柱局部疼痛、压痛和叩击痛或后突成角畸形、脊柱活动受限、拾物试验阳性等体征。④可有寒性脓肿形成或合并不完全性或完全性截瘫。⑤影像及实验室改变：脊椎X线及CT或MRI检查显示椎体不规则骨质破坏或有椎体塌陷、空洞，死骨形成，椎间隙变窄或消失或椎旁有寒性脓肿阴影或椎管内病变及脊髓受压;结核病变活动期血沉可增快。
1.2.2 脊柱结核手术适应证[12～13] ①脊柱结核椎体明显破坏或明显畸形，伴有椎旁较大寒性脓肿或大量死骨。②脊柱结核造成脊髓压迫引起神经体征。③脊柱稳定性有明显破坏。④必须植骨以恢复椎体高度者。⑤合并脊柱后凸畸形需矫正者。⑥保守治疗效果不佳的混合感染或病程较长者或窦道形成且合并感染者。⑦持续疼痛或血沉持续在高位。
1.2.3 纳入标准 ①符合脊柱結核诊断标准者。②有脊髓急性损害的表现。③均采用结核病灶清除、自体髂骨植骨、加或不加钢板内固定治疗者，痊愈出院并完整随访12～24个月（内固定的使用有严格的指征：绝对指征为术前或病灶清除术后脊柱明显不稳，脊柱严重或进行性后凸畸形[12]）。
1.2.4 排除标准 脊柱肿瘤与术后病理证实为非结核病的患者。
1.3 方法
1.3.1 治疗方式 均予结核病灶清除、自体髂骨植骨、加或不加钢板内固定治疗。其中内固定68例，无内固定35例。见图1A～H。
1.3.2 实验步骤
1.3.2.1 标本收集 在手术前1天及手术后第1天、术后第7天晨8点空腹采集103例脊柱结核患者外周血3 mL并用枸橼酸钠抗凝冻存备用。
1.3.2.2 DNA提取 按实验操作要求将浓度为2%的EDTA总体积的1/10加入到留有静脉血3 mL的试管中，摇匀;室温下，2000转/分离心20 min;将细胞层转移到含有5 mL红细胞裂解液（SACK）的离心管中，摇匀，冰上存放20 min;室温下，2000转/分再离心20 min;弃上清液，提取DNA（取50 μL TBDNA提取物加入上述沉淀物中，摇匀后超声处理5～7 min使细胞壁和细胞膜破坏，15 000转/分，离心10 min，留取含TBDNA的上清液备检）。 1.3.2.3 PCR扩增 按实验操作样品数n在1离心管中分别加入TB缓冲液n×18 μL，MgCl2 n×3 μL，TB荧光探针n×3 μL，Taq酶n×2 μL摇匀后在旋涡振荡器上再振荡10 s，低速离心数秒后按每管26 μL分装。处理上清液，在反应管中加入阴性对照品及校准品各4 μL，混匀后置于PCR 仪上，立即进行PCR扩增反应（条件：50℃预反应2 min，94℃预变性5 min，94℃5 s，60℃40 s，循环40次）。
1.3.2.4 结果判断 ①PCR产物：将1.5 μL 6×上样缓冲液与8 μL产物混合摇匀，加样于1%琼脂糖，电泳缓冲液为1×TBE，恒压100 V下电泳30 min，观察在紫外线下163 bp的DNA片段，有DNA带为阳性结果，无DNA带为阴性结果。②荧光定量产物：反应结束后，利用Sequence Detector V 6.3软件给予数据处理，按照每批实验中的阳性对应的报告荧光信号数值，建立标准曲线，通过测定每一个待测样品的循环数阈值（threshold cycle，Ct），应用标准曲线计算出检测样品中的扩增片段的拷贝数。
1.4 统计学方法 所有的统计学分析均使用SPSS 17.0统计数据软件包。数值变量采用均数±标准差（±s）进行统计描述，采用多个相关样本非参数检验（Friedman检验）比较研究组和对照组术前1天、术后第1天及术后第7天外周血结核杆菌含量变化的差异;采用重复测量的方差分析，比较两组患者在术前1天、术后第1天及术后第7天三个不同时间点结核杆菌含量的差异;采用χ2检验比较计数资料。检验水准：α=0.05，双侧检验。
2 结 果
2.1 提取的结核分枝杆菌DNA PCR扩增产物结果 扩增结果呈阳性表现，证实为结核杆菌核酸。见图2。
2.2 荧光定量PCR反应的特异性 脊柱结核患者外周血扩增结果均为阳性，说明该引物所扩增的靶序列是针对结核分枝杆菌的序列，本研究设计的引物是符合实验要求的。
2.3 荧光定量PCR反应的灵敏度 纯化的结核分枝杆菌染色体基因组DNA经过7530G型紫外分光光度计定量，从每μL 100 ng开始，10倍稀释到1 fg，并对结核分枝杆菌菌体进行10倍稀释，分别进行荧光定量PCR检测3次。结果显示荧光定量PCR的灵敏度可达10 fg DNA和1～5个菌体/mL。
2.4 脊柱结核患者外周血结核分枝杆菌DNA含量荧光定量PCR的檢测结果 术前1天、术后第1天和术后第7天外周血结核杆菌的DNA阳性率两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。阳性标准：外周血结核分枝杆菌DNA定量≥NX105 拷贝/mL为阳性。对原始数据进行数据转换后，采用多个相关样本非参数检验和重复测量的方差分析，结果见表2。
3 讨 论
目前，对于是否在脊柱结核进行性加重的情况下急诊手术解救脊髓功能一直是骨科专家争议的焦点，尚未形成统一的意见或见解[14～17]。然而，关注于在此条件下急诊手术是否会导致结核杆菌随血液全身扩散或是否会导致手术失败或是否会危及生命等研究较少[18～20]。脊柱结核作为一种部位特殊的骨关节结核及最常见的肺外结核，约占骨关节结核的95%，结核病灶清除、椎管减压、矫正畸形及重建脊柱稳定性[21～23]等外科手术仍是脊柱结核治疗的重要手段及措施，对避免出现脊柱严重破坏、畸形加重、严重压迫和损害脊髓等具有深远的意义。因此，本研究通过检测44例急诊手术和59例非急诊手术的脊柱结核患者术前1天、术后第1天和术后第7天外周血中单核细胞的结核杆菌DNA含量并比较两者的差异，有助于研究者进一步探索脊柱结核进行性加重情况下急诊手术解救脊髓功能的治疗方法和措施。
本课题组在研究借鉴同类患者的相关文献资料的基础上[24～26]，对部分患者的治疗作了初步的探索研究。结果显示，提取的结核杆菌DNA产物经PCR扩增后得到良好的结果。荧光定量PCR反应的特异性和灵敏度均达到了实验要求。研究组44例患者中，术前1天外周血中单核细胞的结核杆菌DNA含量结果为阳性的有22例，术后第1天为25例，术后第7天为14例。对照组59例患者中，术前1天、术后第1天、术后第7天外周血中单核细胞的结核杆菌DNA含量结果为阳性的分别有29例、31例、20例。从理论值上看，研究组急诊手术的脊柱结核患者术后第1天的阳性率仅比术前1天多1例，比术后第7天多11例;对照组非急诊手术的脊柱结核患者术后第1天的阳性率比术前1天多2例，比术后第7天多9例。这与结核分枝杆菌在体外的研究有相似的结果[27～31]。因此研究者认为两组脊柱结核患者术后并没有导致结核杆菌全身扩散等灾难性后果。
同时，本研究曾计划按术前和术后采血进行结核杆菌培养以对比手术是否增加血中的结核菌数量，但费时且结核杆菌计数困难，对指导抗结核治疗意义有限。而通过外周血结核分枝杆菌DNA定量检测能即时了解患者结核杆菌相对量及耐药分布情况。因此，本研究改用即时荧光定量PCR技术多点测定脊柱结核患者外周血结核杆菌DNA含量，观察患者术后结核杆菌分布情况。通过对两组患者术前术后3个不同时间点外周血中单核细胞的结核杆菌DNA含量变化对比研究，发现两组患者手术前后3个时间点外周血单核细胞结核杆菌DNA含量变化比较均无明显差异;而且两组患者3个时间点外周血单核细胞结核杆菌DNA含量比较亦无明显差异。从表1、表2结果看，两组术后第1天和术后第7天外周血单核细胞结核杆菌DNA含量阳性率并不明显增加反而呈下降趋势。说明研究组和对照组术后结核杆菌在血液全身扩散的风险并没有增加。
本课题组研究表明对于此类脊柱结核特殊患者，如果出现脊髓进行性加重损害等，尽管抗结核治疗尚不足2周，血沉仍未降至40 mm/L或接近正常，在病情无其他生命危险等手术禁忌证的条件下进行急诊手术抢救脊髓功能是安全的。尽管相关结果是基于小样本基础上得出的初步结果，多中心、大样本的研究结果是否有相似的结果仍有待进一步研究，但对于此类患者进行急诊手术抢救脊髓功能仍有一定的借鉴意义。 基于以上小样本研究结果，本课题认为通过对比研究脊柱结核患者手术前后3个不同时间点外周血即时监测结核杆菌DNA含量的改变，并未发现术后结核杆菌随血液全身扩散的危险。因此对于脊柱结核特别是脊髓进行性加重的脊柱结核患者，尽管抗结核治疗不足2周或血沉未降至预期水平，为抢救可能进一步加重的脊髓功能，急診手术解除压迫和重建脊柱稳定有一定的临床借鉴意义，本结果仅仅是对此类患者治疗的初步探索研究，因此对这类病例要具体分析具体解决。但对于其他普通骨关节结核患者是否可按此方法进行治疗是本课题研究的另一方向。特别是术前术后多点外周血监测结核杆菌DNA含量将为此类患者提供更多数据和理论依据。
参 考 文 献
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（收稿日期：2019-03-04 修回日期：2019-04-26）
（编辑：潘明志）