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摘 要 为研究西瓜枯萎病菌的致病分子机理，开展了病原菌的转化子库构建工作。采用携带潮霉素抗性pTFCM双元载体的农杆菌AGL-1介导的ATMT转化方法，获得菌株FON-01的转化子，通过表型观察筛选突变体。结果表明：当乙酰丁香酮（AS）浓度为200 μmol/L、农杆菌OD600为0.4、分生孢子浓度为1×106个/mL时，于28 ℃共培养48 h转化效率高达（663.33±24.95）个/106个孢子。构建了总数为3 832个的转化子库并对其进行了质量评价，从2 201个转化子中筛选出菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个。病原菌转化子库的构建为进一步开展致病分子机理及相关基因克隆等方面研究奠定基础。
关键词 西瓜枯萎病菌；ATMT；转化子库
中图分类号 S432.1 文献标识码 A
Generation of a Transformant Library of Fusarium oxysporum.
f. sp. niveum by ATMT and It’s Quality Assessment
PEI Yueling，ZENG Fanyun，PENG Jun，LONG Haibo，GUO Jianrong﹡
Environment and Plant Protection Institute，CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on
Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical
Agricultural Pests，Haikou，Hainan 571101， China
Abstract In order to study the pathogenic molecular mechanism of Fusarium oxysporum. f. sp. Niveum，the transformant library was conducted. Agrobacterium strainAGL-1 containing the binary vector pTFCM was used for the transformation of strain FON-01，and the mutants were screened by penotype observation. Transformation efficiency was（663.33±24.95），when the acetosyringone concentration was 200 μmol/L，OD600 of AGL-1 was 0.4，conidia concehntration was 106/mL，co-culture time was 48 h and co-culture temperature was 28 ℃. 3 832 transformants were obtained and quality assessment to the library was finished. 73 mutants with variation of colony shape，growth speed and sporulation ability were screened from 2 201 transformants. The construction of transformants library would provide the foundation for further study of pathogenic molecular mechanism and related genes’cloning.
Key words Fusarium oxysporum. f. sp. niveum；ATMT；Transformant library
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.013
西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum & Nakai]是中国重要的水果之一，在中国农业经济中占有重要地位。中国是西瓜生产和消费大国，种植面积和产量均占世界一半以上（FAO）。与其它瓜菜类作物相比，种植西瓜的经济效益非常高，已经成为增加农户经济收入的重要途径。由尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fusarium oxyxporum Schl. f. sp. niveum（E. F. Smith）Snyder et Hansen]引起的西瓜枯萎病是一种世界性土传病害，是中国西瓜种植业中的重要病害，生产上防治困难，可造成30%以上的产量损失[1]。
随着农业经济的发展，中国的西瓜种植业也呈现设施化、基地化、专业化的发展趋势，重茬现象非常普遍，为西瓜枯萎病的发生、发展和流行创造了极为有利的条件，导致该病严重发生。近年来，该病在中国各个西瓜种植区均有发生，一般病株率10%～20%，重者达80%～90%[2]，已经成为制约西瓜产业发展的主要因素之一。目前有关该病病原菌致病分子机理方面的研究还很少，严重制约了相关防控工作的进展。
国内郑肖兰等[3]和梁慎等[4]开展了病原菌转化方法的探索工作，获得了部分转化子，但缺少转化条件的优化和相应的分子鉴定等工作。国外还未见有关利用农杆菌介导该菌遗传转化的报道。本研究对根癌农杆菌介导的T-DNA的转化条件进行优化，建立了西瓜枯萎病菌1号小种的转化子库，并对其进行质量评价和突变体筛选工作，为进一步克隆致病相关基因和致病分子机理的研究奠定基础。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 西瓜枯萎病菌1号小种菌株FON-01由国家蔬菜工程技术研究中心许勇研究员惠赠。携带双元载体pTFCM（Kanr，含PtrpC：：hphB）的农杆菌AGL-1由华中农业大学姜道宏教授惠赠。
1.1.2 培养基及试剂 PDA和LB培养基分别用于培养西瓜枯萎病菌和AGL-1，配方参照《植病研究方法》[5]。MM和IM培养基均用于培养AGL-1，配方参照蔡志英等[6]。
乙酰丁香酮（AS）、2（N-马啉）乙基磺酸（MES）、头孢霉素、硫酸链霉素、利福平、卡那霉素等产品均购自Sigma公司；潮霉素B购自Roche公司；DNA片段胶回收试剂盒、pMD18-T载体和随机引物标记试剂盒购买自宝生物工程（大连）有限公司；Taq酶和dNTPs购买自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 FON-01转化条件的优化 菌株对抗生素的敏感性测定：将FON-01分别接种于含有不同浓度潮霉素的PDA平板上，观察其生长情况并评价其敏感性。
FON-01分生孢子液的制备：将菌株接种于液体PDA培养基上，以180 r/min、28 ℃培养5 d，用IM液体培养基调至所需浓度。
FON-01的转化： （1）将AGL-1（携带pTFCM）菌株在LB培养基平板（含50 mg/L利福平，50 mg/L卡那霉素）上划线，于28 ℃培养2 d。（2）挑取单菌落接种于10 mL MM培养基（含50 mg/L卡那霉素）上，以180 r/min，28 ℃培养2 d。（3）离心收集菌体，用IM培养基（含适量 AS）以 180 r/min、28 ℃培养5～6 h，用IM培养基将菌液OD600稀释至所需浓度，与FON-01孢子液按照1 ∶ 1（V ∶V）比例混合。（4）取0.2 mL混合液涂布于铺有硝酸纤维素膜的IM 平板上（含200 μmol/L的AS，直径9 cm），避光共培养后，用灭菌的手术刀将硝酸纤维滤膜切成宽度约为5 mm的条带，分别反铺于2个PDA平板上（含250 mg/L潮霉素、250 mg/L头孢霉素），于28 ℃培养5 d后将滤膜边缘的单菌落转接到PDA平板上（含250 mg/L潮霉素）进行复筛并保存，统计各处理转化子数并计算转化效率。其中AS浓度设为50、100、150、200、250、300、350 μmol/L，AGL-1（pTFCM）OD600值设为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，FON-01孢子液浓度设为1×104、1×105、1×106、1×107、1×108个/mL，共培养时间和温度分别设为24、36、48、60、72 h和16、24、26、28、30、32 ℃等。每处理5个平板，重复3次，计算平均数和标准差，并用SAS9.0软件进行差异显著性分析[7]。
1.2.2 FON-01转化子库的构建和质量评价 参照1.2.1中优化后的转化条件，进行转化子库的构建并对其进行质量评价。遗传稳定性评价：随机选取20个转化子接种于PDA平板，以28 ℃培养5 d后在菌落边缘挑取少量菌丝接种到一个新的PDA平板上，转接10次后接种到含250 mg/L潮霉素的PDA平板上，观察菌落生长情况。
PCR扩增：根据载体pTFCM潮霉素抗性基因编码区设计引物Hygst1（5′-TGAACTCACCGCGACGT
CTGT-3′）和Hygst2（5′-ACGGTGTCGTCCATCACAGT
-3′），2引物之间长度为498 nt。参照Xu等[8]的方法提取FON-01和20个转化子基因组DNA并进行PCR扩增，以无菌水为对照，将扩增产物克隆后进行测序验证。
Southern杂交验证：随机选取14个转化子，提取基因组DNA后，选用在载体pTFCM上没有识别位点的ApaⅠ进行充分酶切。以AGL-1（携带pTFCM）菌液为模板，用引物Hygst1和Hygst2进行PCR扩增，将产物回收、定量后参照曾凡云[9]的方法按照试剂盒说明书进行探针标记和Southern印迹杂交。
1.2.3 突变体的筛选 将FON-01和转化子分别接种于PDA平板中央（直径9 cm），于28 ℃培养7 d后观察菌落形态，采用十字交叉法测量菌落直径。待菌落长满整个PDA平板（直径9 cm）时，用10 mL无菌水将菌落表面的分生孢子洗下，镜检计数。每个转化子5个平板，重复3次并进行SAS分析[7]。
2 结果与分析
2.1 FON-01转化条件的优化
培养结果表明，当潮霉素浓度在250 mg/L以上时，菌株FON-01的生长完全受到抑制，因此在建库时用含有该浓度潮霉素的PDA平板进行转化子的筛选。
经过多次转化试验，发现用AS预处理AGL-1（携带pTFCM）时，当AS浓度在50 μmol/L时仅出现个别单菌落，AS浓度越高转化效率越高。当AS浓度为200 μmol/L时，转化效率为（620.67±20.98）个/106个孢子，平均每个平板上出现31.04个转化子（图1-A）。由于高浓度的AS会增加T-DNA片段插入的拷贝数，另外转化效率太高不利于生长缺陷突变体的挑取，因此选用200 μmol/L的AS进行转化。进一步的研究表明，AS浓度为200 μmol/L、农杆菌OD600为0.4、分生孢子浓度为1×106 个/mL时，于28 ℃共培养48 h转化效率最高，为（663.33±24.95）个/106个孢子（图1B-E）。
2.2 FON-01转化子库的构建和质量评价
参照2.1中转化条件的优化结果进行转化子库的构建，目前已获得3 832个转化子。 2.2.1 遗传稳定性评价 选取的20个转化子在不含潮霉素的PDA 平板上转接10次后再转接到含潮霉素的PDA 平板，均能正常生长，其菌落形态与初始培养物无明显差别，表明转化子所携带的外源片段能够稳定遗传。
2.2.2 PCR扩增 以FON-01和转化子的基因组DNA为模板，用引物Hygst1和Hygst2进行PCR扩增，结果20个转化子均获得约0.5 kb的扩增产物（图2）。随机选取转化子Fat38、Fat188和Fat648的扩增产物并进行回收、克隆后测序， 结果表明其和潮霉素抗性基因编码区序列完全一致。
2.2.3 Southern杂交验证 随机选取14个转化子进行southern杂交，结果转化子Fat38、Fat188、Fat648、Fat1420、 Fat1937、Fat2678、Fat2816和Fat3131均有1条信号带，转化子Fat849、Fat1287、Fat2897和Fat3428均有2条信号带，而Fat1348和Fat1672分别有3条和4条信号带（图3）。
2.3 突变体的筛选
通过菌落形态观察和产孢量统计，从2 201个转化子中初步筛选出菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个，其中菌落形态、生长速度和产孢量均变异的有8个，菌落形态和生长速度变异的有1个，生长速度和产孢量变异的有41个，仅菌落形态变异的有3个，仅生长速度变异的有9个，仅产孢量变异的有11个（表1和图4）。
3 讨论与结论
本研究利用携带双元载体pTFCM的农杆菌菌株AGL-1介导的遗传转化方法构建了总数为3 832个的西瓜枯萎病菌转化子库并对其进行了质量评价。从14个转化子的Southern杂交结果发现其中8个转化子只有一条信号带，估算单位点插入转化子比例约为57.14%。在对2 201个转化子的初步筛选中获得了在菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个。该病原菌转化子库的构建及部分突变体的获得，为进一步开展致病分子机理和相关基因克隆等研究奠定基础。
通过基因插入失活获得覆盖整个基因组的转化子库，从中筛选表型变异突变体，并利用外源插入片段作标记进行目的基因的克隆是当前功能基因组学研究的常用策略。限制性内切酶介导的REMI和农杆菌介导的ATMT是最常用的丝状真菌转化技术。和REMI技术相比，ATMT具有转化材料易得[10]、效率高[11-12]、外源片段插入比例高且多为单位点[13]以及转化子遗传稳定等优势[14-15]。1995年，Bundock等[16]首次采用该技术完成酿酒酵母的转化，随后该技术在曲霉[17]、稻瘟菌[18]、炭疽菌[19]等真菌转化中得到广泛应用。本研究也成功地利用该方法构建了西瓜枯萎病菌的转化子库。
研究表明，ATMT的转化效率受受体菌菌株[11]、农杆菌菌株及转化载体[20]等方面因素的影响。本研究发现当农杆菌OD600为0.4、分生孢子浓度为1×106个/mL，于28 ℃共培养48 h时转化效率最高，当AS浓度为200 μmol/L时，转化效率高达（663.33±24.95）个/106孢子，显著优于郑肖兰等[3]和梁慎等[4]的研究结果。郑肖兰等[3]的研究表明分生孢子浓度以（0.1～5.0）×106个/mL为宜，与本研究并不一致；另外，郑肖兰等[3]和梁慎等[4]所选用的双元载体、病原菌菌株以及菌株对潮霉素的抗性均与本研究不同，这可能是导致研究结果不同的原因之一。
丝状真菌中，单个基因的缺失常造成多个表型的变异。Hou等[21]发现MAPK途径中的MGV1基因缺失后，合谷镰刀菌的产孢量、育性以及侵染小麦的能力均发生了变异。Yang等[22]克隆到稻瘟菌致病相关基因Com1，该基因缺失后孢子形态发生变异，附着胞膨压下降并且丧失了致病性。西瓜枯萎病是一种土传病害，病原菌主要从根部侵入，破坏微管组织，然后造成植株萎蔫并最终死亡。病原菌致病相关突变体的筛选需要大量的人工接种试验，限制了致病性相关突变体的大规模筛选工作。本研究通过对转化子的表型观察和产孢能力评估，初步获得了73个突变体，但相关的缺失基因是否和病原菌的致病性相关，还需要开展进一步的研究。
参考文献
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关键词 西瓜枯萎病菌；ATMT；转化子库
中图分类号 S432.1 文献标识码 A
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f. sp. niveum by ATMT and It’s Quality Assessment
PEI Yueling，ZENG Fanyun，PENG Jun，LONG Haibo，GUO Jianrong﹡
Environment and Plant Protection Institute，CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on
Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical
Agricultural Pests，Haikou，Hainan 571101， China
Abstract In order to study the pathogenic molecular mechanism of Fusarium oxysporum. f. sp. Niveum，the transformant library was conducted. Agrobacterium strainAGL-1 containing the binary vector pTFCM was used for the transformation of strain FON-01，and the mutants were screened by penotype observation. Transformation efficiency was（663.33±24.95），when the acetosyringone concentration was 200 μmol/L，OD600 of AGL-1 was 0.4，conidia concehntration was 106/mL，co-culture time was 48 h and co-culture temperature was 28 ℃. 3 832 transformants were obtained and quality assessment to the library was finished. 73 mutants with variation of colony shape，growth speed and sporulation ability were screened from 2 201 transformants. The construction of transformants library would provide the foundation for further study of pathogenic molecular mechanism and related genes’cloning.
Key words Fusarium oxysporum. f. sp. niveum；ATMT；Transformant library
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.013
西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum & Nakai]是中国重要的水果之一，在中国农业经济中占有重要地位。中国是西瓜生产和消费大国，种植面积和产量均占世界一半以上（FAO）。与其它瓜菜类作物相比，种植西瓜的经济效益非常高，已经成为增加农户经济收入的重要途径。由尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fusarium oxyxporum Schl. f. sp. niveum（E. F. Smith）Snyder et Hansen]引起的西瓜枯萎病是一种世界性土传病害，是中国西瓜种植业中的重要病害，生产上防治困难，可造成30%以上的产量损失[1]。
随着农业经济的发展，中国的西瓜种植业也呈现设施化、基地化、专业化的发展趋势，重茬现象非常普遍，为西瓜枯萎病的发生、发展和流行创造了极为有利的条件，导致该病严重发生。近年来，该病在中国各个西瓜种植区均有发生，一般病株率10%～20%，重者达80%～90%[2]，已经成为制约西瓜产业发展的主要因素之一。目前有关该病病原菌致病分子机理方面的研究还很少，严重制约了相关防控工作的进展。
国内郑肖兰等[3]和梁慎等[4]开展了病原菌转化方法的探索工作，获得了部分转化子，但缺少转化条件的优化和相应的分子鉴定等工作。国外还未见有关利用农杆菌介导该菌遗传转化的报道。本研究对根癌农杆菌介导的T-DNA的转化条件进行优化，建立了西瓜枯萎病菌1号小种的转化子库，并对其进行质量评价和突变体筛选工作，为进一步克隆致病相关基因和致病分子机理的研究奠定基础。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 西瓜枯萎病菌1号小种菌株FON-01由国家蔬菜工程技术研究中心许勇研究员惠赠。携带双元载体pTFCM（Kanr，含PtrpC：：hphB）的农杆菌AGL-1由华中农业大学姜道宏教授惠赠。
1.1.2 培养基及试剂 PDA和LB培养基分别用于培养西瓜枯萎病菌和AGL-1，配方参照《植病研究方法》[5]。MM和IM培养基均用于培养AGL-1，配方参照蔡志英等[6]。
乙酰丁香酮（AS）、2（N-马啉）乙基磺酸（MES）、头孢霉素、硫酸链霉素、利福平、卡那霉素等产品均购自Sigma公司；潮霉素B购自Roche公司；DNA片段胶回收试剂盒、pMD18-T载体和随机引物标记试剂盒购买自宝生物工程（大连）有限公司；Taq酶和dNTPs购买自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 FON-01转化条件的优化 菌株对抗生素的敏感性测定：将FON-01分别接种于含有不同浓度潮霉素的PDA平板上，观察其生长情况并评价其敏感性。
FON-01分生孢子液的制备：将菌株接种于液体PDA培养基上，以180 r/min、28 ℃培养5 d，用IM液体培养基调至所需浓度。
FON-01的转化： （1）将AGL-1（携带pTFCM）菌株在LB培养基平板（含50 mg/L利福平，50 mg/L卡那霉素）上划线，于28 ℃培养2 d。（2）挑取单菌落接种于10 mL MM培养基（含50 mg/L卡那霉素）上，以180 r/min，28 ℃培养2 d。（3）离心收集菌体，用IM培养基（含适量 AS）以 180 r/min、28 ℃培养5～6 h，用IM培养基将菌液OD600稀释至所需浓度，与FON-01孢子液按照1 ∶ 1（V ∶V）比例混合。（4）取0.2 mL混合液涂布于铺有硝酸纤维素膜的IM 平板上（含200 μmol/L的AS，直径9 cm），避光共培养后，用灭菌的手术刀将硝酸纤维滤膜切成宽度约为5 mm的条带，分别反铺于2个PDA平板上（含250 mg/L潮霉素、250 mg/L头孢霉素），于28 ℃培养5 d后将滤膜边缘的单菌落转接到PDA平板上（含250 mg/L潮霉素）进行复筛并保存，统计各处理转化子数并计算转化效率。其中AS浓度设为50、100、150、200、250、300、350 μmol/L，AGL-1（pTFCM）OD600值设为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，FON-01孢子液浓度设为1×104、1×105、1×106、1×107、1×108个/mL，共培养时间和温度分别设为24、36、48、60、72 h和16、24、26、28、30、32 ℃等。每处理5个平板，重复3次，计算平均数和标准差，并用SAS9.0软件进行差异显著性分析[7]。
1.2.2 FON-01转化子库的构建和质量评价 参照1.2.1中优化后的转化条件，进行转化子库的构建并对其进行质量评价。遗传稳定性评价：随机选取20个转化子接种于PDA平板，以28 ℃培养5 d后在菌落边缘挑取少量菌丝接种到一个新的PDA平板上，转接10次后接种到含250 mg/L潮霉素的PDA平板上，观察菌落生长情况。
PCR扩增：根据载体pTFCM潮霉素抗性基因编码区设计引物Hygst1（5′-TGAACTCACCGCGACGT
CTGT-3′）和Hygst2（5′-ACGGTGTCGTCCATCACAGT
-3′），2引物之间长度为498 nt。参照Xu等[8]的方法提取FON-01和20个转化子基因组DNA并进行PCR扩增，以无菌水为对照，将扩增产物克隆后进行测序验证。
Southern杂交验证：随机选取14个转化子，提取基因组DNA后，选用在载体pTFCM上没有识别位点的ApaⅠ进行充分酶切。以AGL-1（携带pTFCM）菌液为模板，用引物Hygst1和Hygst2进行PCR扩增，将产物回收、定量后参照曾凡云[9]的方法按照试剂盒说明书进行探针标记和Southern印迹杂交。
1.2.3 突变体的筛选 将FON-01和转化子分别接种于PDA平板中央（直径9 cm），于28 ℃培养7 d后观察菌落形态，采用十字交叉法测量菌落直径。待菌落长满整个PDA平板（直径9 cm）时，用10 mL无菌水将菌落表面的分生孢子洗下，镜检计数。每个转化子5个平板，重复3次并进行SAS分析[7]。
2 结果与分析
2.1 FON-01转化条件的优化
培养结果表明，当潮霉素浓度在250 mg/L以上时，菌株FON-01的生长完全受到抑制，因此在建库时用含有该浓度潮霉素的PDA平板进行转化子的筛选。
经过多次转化试验，发现用AS预处理AGL-1（携带pTFCM）时，当AS浓度在50 μmol/L时仅出现个别单菌落，AS浓度越高转化效率越高。当AS浓度为200 μmol/L时，转化效率为（620.67±20.98）个/106个孢子，平均每个平板上出现31.04个转化子（图1-A）。由于高浓度的AS会增加T-DNA片段插入的拷贝数，另外转化效率太高不利于生长缺陷突变体的挑取，因此选用200 μmol/L的AS进行转化。进一步的研究表明，AS浓度为200 μmol/L、农杆菌OD600为0.4、分生孢子浓度为1×106 个/mL时，于28 ℃共培养48 h转化效率最高，为（663.33±24.95）个/106个孢子（图1B-E）。
2.2 FON-01转化子库的构建和质量评价
参照2.1中转化条件的优化结果进行转化子库的构建，目前已获得3 832个转化子。 2.2.1 遗传稳定性评价 选取的20个转化子在不含潮霉素的PDA 平板上转接10次后再转接到含潮霉素的PDA 平板，均能正常生长，其菌落形态与初始培养物无明显差别，表明转化子所携带的外源片段能够稳定遗传。
2.2.2 PCR扩增 以FON-01和转化子的基因组DNA为模板，用引物Hygst1和Hygst2进行PCR扩增，结果20个转化子均获得约0.5 kb的扩增产物（图2）。随机选取转化子Fat38、Fat188和Fat648的扩增产物并进行回收、克隆后测序， 结果表明其和潮霉素抗性基因编码区序列完全一致。
2.2.3 Southern杂交验证 随机选取14个转化子进行southern杂交，结果转化子Fat38、Fat188、Fat648、Fat1420、 Fat1937、Fat2678、Fat2816和Fat3131均有1条信号带，转化子Fat849、Fat1287、Fat2897和Fat3428均有2条信号带，而Fat1348和Fat1672分别有3条和4条信号带（图3）。
2.3 突变体的筛选
通过菌落形态观察和产孢量统计，从2 201个转化子中初步筛选出菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个，其中菌落形态、生长速度和产孢量均变异的有8个，菌落形态和生长速度变异的有1个，生长速度和产孢量变异的有41个，仅菌落形态变异的有3个，仅生长速度变异的有9个，仅产孢量变异的有11个（表1和图4）。
3 讨论与结论
本研究利用携带双元载体pTFCM的农杆菌菌株AGL-1介导的遗传转化方法构建了总数为3 832个的西瓜枯萎病菌转化子库并对其进行了质量评价。从14个转化子的Southern杂交结果发现其中8个转化子只有一条信号带，估算单位点插入转化子比例约为57.14%。在对2 201个转化子的初步筛选中获得了在菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个。该病原菌转化子库的构建及部分突变体的获得，为进一步开展致病分子机理和相关基因克隆等研究奠定基础。
通过基因插入失活获得覆盖整个基因组的转化子库，从中筛选表型变异突变体，并利用外源插入片段作标记进行目的基因的克隆是当前功能基因组学研究的常用策略。限制性内切酶介导的REMI和农杆菌介导的ATMT是最常用的丝状真菌转化技术。和REMI技术相比，ATMT具有转化材料易得[10]、效率高[11-12]、外源片段插入比例高且多为单位点[13]以及转化子遗传稳定等优势[14-15]。1995年，Bundock等[16]首次采用该技术完成酿酒酵母的转化，随后该技术在曲霉[17]、稻瘟菌[18]、炭疽菌[19]等真菌转化中得到广泛应用。本研究也成功地利用该方法构建了西瓜枯萎病菌的转化子库。
研究表明，ATMT的转化效率受受体菌菌株[11]、农杆菌菌株及转化载体[20]等方面因素的影响。本研究发现当农杆菌OD600为0.4、分生孢子浓度为1×106个/mL，于28 ℃共培养48 h时转化效率最高，当AS浓度为200 μmol/L时，转化效率高达（663.33±24.95）个/106孢子，显著优于郑肖兰等[3]和梁慎等[4]的研究结果。郑肖兰等[3]的研究表明分生孢子浓度以（0.1～5.0）×106个/mL为宜，与本研究并不一致；另外，郑肖兰等[3]和梁慎等[4]所选用的双元载体、病原菌菌株以及菌株对潮霉素的抗性均与本研究不同，这可能是导致研究结果不同的原因之一。
丝状真菌中，单个基因的缺失常造成多个表型的变异。Hou等[21]发现MAPK途径中的MGV1基因缺失后，合谷镰刀菌的产孢量、育性以及侵染小麦的能力均发生了变异。Yang等[22]克隆到稻瘟菌致病相关基因Com1，该基因缺失后孢子形态发生变异，附着胞膨压下降并且丧失了致病性。西瓜枯萎病是一种土传病害，病原菌主要从根部侵入，破坏微管组织，然后造成植株萎蔫并最终死亡。病原菌致病相关突变体的筛选需要大量的人工接种试验，限制了致病性相关突变体的大规模筛选工作。本研究通过对转化子的表型观察和产孢能力评估，初步获得了73个突变体，但相关的缺失基因是否和病原菌的致病性相关，还需要开展进一步的研究。
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