【摘 要】
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目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度。方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因
【机 构】
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河南中医学院药学院; 郑州大学医药科学研究院;
【基金项目】
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河南省教育厅自然科学研究项目(2010A360010);郑州市普通科技攻关计划(10PTGS485-1)
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目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度。方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化。结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15μL(1.25 U Taq DNA聚合酶,1.8 mmol.L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol.L-1),0.3μmol.L-1引物,5 ng模板。在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析。
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