目的联合应用自制生物凝胶和三维支架材料,建立组织工程种子细胞的三维支架双相接种技术,并对其构建生成组织工程关节软骨的效果进行初步观察.方法酶消化法分离幼兔关节软骨细胞,于培养瓶中接种、培养,收集第1代软骨细胞,以2.5×107/ml加入液态的自制生物凝胶液中充分混均,制成细胞-凝胶混悬液,接种于CPPf/ PLLA( calium polyphosphate fiber/ poly- L- lactic acid)三维支架材料中,经固化后形成工程化组织块,体外连续培养4周.行大体、倒置显微镜以及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察,二甲基亚甲蓝显色法定量检测硫酸糖胺多糖含量.结果(1)细胞-凝胶混悬液接种后完全充满CPPf/PLLA支架的孔隙,固化后三者很好地形成一个工程化组织整体.构建的工程化组织块在培养过程中不仅能够保持其初始外形,而且能保持种子细胞稳定的三维均相分布,无细胞脱落现象.同时,硬度亦不断增加,有弹性,表面湿润、光滑.(2)随着培养时间的延长,软骨组织的形成是由外周向中心进行.培养2周后,逐渐形成富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的成熟工程化软骨.同时,Ⅰ型胶原逐渐转为阴性,支架材料亦不断降解.4周时硫酸糖胺多糖含量平均为(15.70±2.00)mg/g(湿重),为天然关节软骨的30%以上.结论种子细胞的三维支架双相接种技术简便易行,不仅实现了种子细胞与支架材料的高效复合,而且能保持种子细胞在支架材料中稳定的三维均相分布,促进了工程化关节软骨组织的形成和成熟.