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摘要[目的]通过优化蜡样芽孢杆菌的发酵培养基，提高蜡样芽孢杆菌的生物量。[方法]在初始发酵培养基的基础上，通过单因素试验和正交试验确定蜡样芽孢杆菌发酵培养基的最适碳氮源和碳氮比。[结果]优化后的发酵培养基为：葡萄糖15.00 g/L，可溶性淀粉40.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，玉米浆干粉30.00 g/L，硫酸铵3.00 g/L，磷酸氢二钾5.00 g/L，磷酸二氢钠5.00 g/L，硫酸镁1.25 g/L，硫酸锰0.60 g/L，氯化钙2.00 g/L。优化后蜡样芽孢杆菌在50 L不锈钢发酵罐中的发酵液活菌数达1.6×1010cfu/mL，较优化前提高了1个数量级。[结论]优化后的蜡样芽孢杆菌发酵培养基大大提高了该菌的生物量，为工业化放大生产提供了参考。
关键词 蜡样芽孢杆菌；发酵培养基；优化
中图分类号S182文献标识码 A文章编号0517-6611（2016）30-0007-02
芽孢杆菌是一类兼性厌氧或好氧，革兰氏阳性杆菌的总称，产芽孢，生理特征丰富多样，分布极其广泛，是植物体表、根际以及土壤、空气的重要微生物种群。芽孢杆菌是一类产生大量不同化学结构的多肽抗菌物质的物种[1]。
蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，主要分布于尘埃、土壤、植物、水及空气中，能产生具有抗逆性内生芽孢，对紫外线、离子辐射、热和抗菌素及其他化学药品的抗性较高[2]。蜡样芽孢杆菌可产生多种有益生物活性物质，在医药保健、农业、食品和饲料等各领域有着极其广泛的应用，牧渔养殖业上用作饲料添加剂，农业上用作生防制剂[3-4]。
笔者通过单因素试验和正交试验对1株益生蜡样芽孢杆菌
发酵培养基进行了优化，并进行了50 L不锈钢发酵罐中试试验，以期为蜡样芽孢杆菌的工业化生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种。蜡样芽孢杆菌由广州市微生物研究所提供。
1.1.2培养基。種子和检测培养基采用LB培养基：胰蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，氯化钠5.00 g/L，pH 7.0，固体培养基加20.00 g/L琼脂粉。基础发酵培养基：葡萄糖30.00 g/L，酵母粉20.00 g/L，硫酸铵3.00 g/L，磷酸氢二钾5.00 g/L，磷酸二氢钠5.00 g/L，硫酸镁1.25 g/L，硫酸锰0.60 g/L，氯化钙2.00 g/L，pH 7.0。
1.1.3主要试剂。胰蛋白胨（英国Oxoid 公司）、琼脂粉（广东省广州环凯生物科技有限公司）、酵母粉（湖北安琪酵母股份有限公司）、蛋白胨（贵州新华生化科技发展有限公司）、玉米浆干粉（山东康源生物科技有限公司），其他试剂均为国产分析纯。
1.1.4主要仪器。生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、752N 型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、pHS-25 数显酸度计（上海雷磁仪器厂）、50 L不锈钢发酵罐（上海洋格生物工程设备有限公司）、DHZ-DA大容量全温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂）。
1.2方法
1.2.1蜡样芽孢杆菌生长曲线的绘制。将活化好的蜡样芽孢杆菌接种于发酵培养基中，每间隔3 h取样测定发酵液的pH和OD值，绘制菌体生长曲线。
1.2.2蜡样芽孢杆菌摇瓶发酵试验。
从新鲜种子斜面挑取1环菌体，接入装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，制成种子液；以1%的接种量将活化好的种子液接入装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振荡培养24 h，取样测定OD值。
1.2.3发酵过程参数测量。
1.2.3.1菌体生物量测定。测量经适当稀释后的发酵液在600 nm波长处的OD值。
1.2.3.2pH测定。用pHS-25数显酸度计测定。
1.2.3.3菌落计数。采用平板菌落计数法。
1.2.4最佳发酵培养基的确定。
1.2.4.1最佳碳源的确定。分别用30.00 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉替代基础培养基中的碳源，其余配方同基础发酵培养基，进行摇瓶发酵试验。
1.2.4.2最佳氮源的确定。在筛选出最佳碳源的基础上，分别用23.00 g/L的酵母粉、玉米浆干粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粕粉、硫酸铵替代基础发酵培养基中的氮源，其余配方同基础发酵培养基，进行摇瓶发酵试验。
1.2.4.3正交试验。采用4因素3水平L9（34）正交表进行优化试验，研究影响蜡样芽孢杆菌生长的主要因素：葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨和玉米浆干粉，求取最佳配比。正交试验因素与水平见表1。
1.2.5发酵中试试验。根据发酵培养基的优化结果，在50 L不锈钢发酵罐中进行扩大培养验证，发酵罐装液量为25 L。种子培养同摇瓶试验，接种量为4%，培养温度为37 ℃，通风量为10 m3/h，搅拌转速为200 r/min，罐压保持在0.04～0.06 MPa，发酵过程中pH保持在7.0左右。每2 h取样，测定发酵液的OD值，同时观察芽孢形成情况。
2结果与分析
2.1蜡样芽孢杆菌生长曲线
由图1可知，蜡样芽孢杆菌在0～3 h处于迟缓期，3 h以后进入对数生长期，OD值快速提高，至12 h OD值达到最高，进入稳定期，从18 h开始，蜡样芽孢杆菌进入衰亡期。在生产中通常使用对数期的菌体作为种子，此时菌体生长速率最快、代谢旺盛、酶系活跃、活细菌数和总细菌数大致接近、细胞的化学组成形态理化性质基本一致，所以选定蜡样芽孢杆菌的最佳种龄是12 h。 此外，随着培养时间的增加，pH逐渐上升，说明蜡样芽孢杆菌在增值过程中产生的代谢产物为碱性物质。
2.2最佳发酵培养基的确定
2.2.1最佳碳源。由图2可知，可溶性淀粉作为碳源时蜡样芽孢杆菌的生长明显优于其他碳源，OD值达14，所以最佳碳源为可溶性淀粉，其次是葡萄糖，最差的是玉米淀粉。但是考虑到可溶性淀粉是多糖，而葡萄糖作为速效碳源，能迅速启动菌体生长，缩短发酵周期，故选择葡萄糖和水溶性淀粉搭配使用作为复合碳源。
2.2.2最佳氮源。由图3可知，选用玉米浆干粉作为氮源时的OD值极显著高于其他组别，蛋白胨和牛肉膏次之。玉米浆干粉是以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干燥而成，其水溶性蛋白质保存完好，在微生物发酵过程中提供水溶性植物蛋白及水溶性维生素等营养元素。使用硫酸铵时，生物量显著低于其他组别，说明蜡样芽孢杆菌在有机氮源中的生长明显优于无机氮源。由于硫酸铵能促进芽孢的生成，所以保留硫酸铵作为无机氮源。同样考虑到速效氮源有利于菌体快速启动，缩短迟缓期，同时蛋白胨的成本远低于牛肉膏，故选择蛋白胨和玉米浆干粉搭配使用作为最佳氮源。
2.2.3正交试验结果。根据表2极差大小得出各因素对蜡样芽孢杆菌生物量影响的显著性顺序为玉米浆干粉>可溶性淀粉>蛋白胨>葡萄糖。最优培养基组合为A2B3C1D2，即1.5%葡萄糖、4.0%可溶性淀粉、1.0%蛋白胨、3.0%玉米浆干粉。在摇瓶中对优化后的培养基配方进行验证，测得OD值为52.335，与正交试验结果一致。
2.350 L不锈钢发酵罐中试试验结果
由图4可知，0～2 h为迟缓期，较摇瓶缩短了1 h，镜检菌体稀少；2～12 h为对数生长期，菌体
快速增值，12 h OD值达到最高，为61.505，高
于摇瓶正交试验结果，生物量最大，此时镜检菌体增大、增长，并开始形成芽孢，
這是因为发酵罐搅拌和溶氧量远高于摇瓶，更有利于菌体生长；12 h后进入稳定期，镜检菌体基本全部形成芽孢；20 h进入衰亡期，菌体明显变少，芽孢开始脱落。12 h发酵液活菌计数达1.6×1010cfu/mL，芽孢率为96%。
3结论
通过单因素试验和正交试验确定了蜡样芽孢杆菌最适发酵培养基为：葡萄糖15.00 g/L，可溶性淀粉40.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，玉米浆干粉30.00 g/L，硫酸铵3.00 g/L，磷酸氢二钾5.00 g/L，磷酸二氢钠5.00 g/L，硫酸镁1.25 g/L，硫酸锰0.60 g/L，氯化钙2.00 g/L。优化后摇瓶OD值达52.335，是优化前的4倍，50 L不锈钢发酵罐中试发酵的OD值为61.505，发酵液活菌数达1.6×1010cfu/mL，较优化前的发酵液活菌数提高了1个数量级，表明优化后的发酵培养基显著提高了蜡样芽孢杆菌的生物量，具有实际应用价值，可为今后规模化生产提供理论依据。
参考文献
[1]
STEIN T.Bacillus subtilis antibiotics：Structures，synthesis and specific functions[J].Mol Microbiol，2005，56（4）：845-857.
[2] 秦玉昌，潘宝海，于荣，等.芽孢杆菌对畜禽生产性能的影响[J].中国饲料，2004（16）：8-10.
[3] 聂实践，林伯荃，朱桂茹，等.益生多（S-586）饲用微生态制剂的防病作用实验[J].饲料研究，1999（5）：27-28.
[4] 张惠云.微生态制剂在水产养殖中的应用[J].饲料博览，2000，21（6）：46-47.
关键词 蜡样芽孢杆菌；发酵培养基；优化
中图分类号S182文献标识码 A文章编号0517-6611（2016）30-0007-02
芽孢杆菌是一类兼性厌氧或好氧，革兰氏阳性杆菌的总称，产芽孢，生理特征丰富多样，分布极其广泛，是植物体表、根际以及土壤、空气的重要微生物种群。芽孢杆菌是一类产生大量不同化学结构的多肽抗菌物质的物种[1]。
蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，主要分布于尘埃、土壤、植物、水及空气中，能产生具有抗逆性内生芽孢，对紫外线、离子辐射、热和抗菌素及其他化学药品的抗性较高[2]。蜡样芽孢杆菌可产生多种有益生物活性物质，在医药保健、农业、食品和饲料等各领域有着极其广泛的应用，牧渔养殖业上用作饲料添加剂，农业上用作生防制剂[3-4]。
笔者通过单因素试验和正交试验对1株益生蜡样芽孢杆菌
发酵培养基进行了优化，并进行了50 L不锈钢发酵罐中试试验，以期为蜡样芽孢杆菌的工业化生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种。蜡样芽孢杆菌由广州市微生物研究所提供。
1.1.2培养基。種子和检测培养基采用LB培养基：胰蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，氯化钠5.00 g/L，pH 7.0，固体培养基加20.00 g/L琼脂粉。基础发酵培养基：葡萄糖30.00 g/L，酵母粉20.00 g/L，硫酸铵3.00 g/L，磷酸氢二钾5.00 g/L，磷酸二氢钠5.00 g/L，硫酸镁1.25 g/L，硫酸锰0.60 g/L，氯化钙2.00 g/L，pH 7.0。
1.1.3主要试剂。胰蛋白胨（英国Oxoid 公司）、琼脂粉（广东省广州环凯生物科技有限公司）、酵母粉（湖北安琪酵母股份有限公司）、蛋白胨（贵州新华生化科技发展有限公司）、玉米浆干粉（山东康源生物科技有限公司），其他试剂均为国产分析纯。
1.1.4主要仪器。生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、752N 型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、pHS-25 数显酸度计（上海雷磁仪器厂）、50 L不锈钢发酵罐（上海洋格生物工程设备有限公司）、DHZ-DA大容量全温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂）。
1.2方法
1.2.1蜡样芽孢杆菌生长曲线的绘制。将活化好的蜡样芽孢杆菌接种于发酵培养基中，每间隔3 h取样测定发酵液的pH和OD值，绘制菌体生长曲线。
1.2.2蜡样芽孢杆菌摇瓶发酵试验。
从新鲜种子斜面挑取1环菌体，接入装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，制成种子液；以1%的接种量将活化好的种子液接入装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振荡培养24 h，取样测定OD值。
1.2.3发酵过程参数测量。
1.2.3.1菌体生物量测定。测量经适当稀释后的发酵液在600 nm波长处的OD值。
1.2.3.2pH测定。用pHS-25数显酸度计测定。
1.2.3.3菌落计数。采用平板菌落计数法。
1.2.4最佳发酵培养基的确定。
1.2.4.1最佳碳源的确定。分别用30.00 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉替代基础培养基中的碳源，其余配方同基础发酵培养基，进行摇瓶发酵试验。
1.2.4.2最佳氮源的确定。在筛选出最佳碳源的基础上，分别用23.00 g/L的酵母粉、玉米浆干粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粕粉、硫酸铵替代基础发酵培养基中的氮源，其余配方同基础发酵培养基，进行摇瓶发酵试验。
1.2.4.3正交试验。采用4因素3水平L9（34）正交表进行优化试验，研究影响蜡样芽孢杆菌生长的主要因素：葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨和玉米浆干粉，求取最佳配比。正交试验因素与水平见表1。
1.2.5发酵中试试验。根据发酵培养基的优化结果，在50 L不锈钢发酵罐中进行扩大培养验证，发酵罐装液量为25 L。种子培养同摇瓶试验，接种量为4%，培养温度为37 ℃，通风量为10 m3/h，搅拌转速为200 r/min，罐压保持在0.04～0.06 MPa，发酵过程中pH保持在7.0左右。每2 h取样，测定发酵液的OD值，同时观察芽孢形成情况。
2结果与分析
2.1蜡样芽孢杆菌生长曲线
由图1可知，蜡样芽孢杆菌在0～3 h处于迟缓期，3 h以后进入对数生长期，OD值快速提高，至12 h OD值达到最高，进入稳定期，从18 h开始，蜡样芽孢杆菌进入衰亡期。在生产中通常使用对数期的菌体作为种子，此时菌体生长速率最快、代谢旺盛、酶系活跃、活细菌数和总细菌数大致接近、细胞的化学组成形态理化性质基本一致，所以选定蜡样芽孢杆菌的最佳种龄是12 h。 此外，随着培养时间的增加，pH逐渐上升，说明蜡样芽孢杆菌在增值过程中产生的代谢产物为碱性物质。
2.2最佳发酵培养基的确定
2.2.1最佳碳源。由图2可知，可溶性淀粉作为碳源时蜡样芽孢杆菌的生长明显优于其他碳源，OD值达14，所以最佳碳源为可溶性淀粉，其次是葡萄糖，最差的是玉米淀粉。但是考虑到可溶性淀粉是多糖，而葡萄糖作为速效碳源，能迅速启动菌体生长，缩短发酵周期，故选择葡萄糖和水溶性淀粉搭配使用作为复合碳源。
2.2.2最佳氮源。由图3可知，选用玉米浆干粉作为氮源时的OD值极显著高于其他组别，蛋白胨和牛肉膏次之。玉米浆干粉是以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干燥而成，其水溶性蛋白质保存完好，在微生物发酵过程中提供水溶性植物蛋白及水溶性维生素等营养元素。使用硫酸铵时，生物量显著低于其他组别，说明蜡样芽孢杆菌在有机氮源中的生长明显优于无机氮源。由于硫酸铵能促进芽孢的生成，所以保留硫酸铵作为无机氮源。同样考虑到速效氮源有利于菌体快速启动，缩短迟缓期，同时蛋白胨的成本远低于牛肉膏，故选择蛋白胨和玉米浆干粉搭配使用作为最佳氮源。
2.2.3正交试验结果。根据表2极差大小得出各因素对蜡样芽孢杆菌生物量影响的显著性顺序为玉米浆干粉>可溶性淀粉>蛋白胨>葡萄糖。最优培养基组合为A2B3C1D2，即1.5%葡萄糖、4.0%可溶性淀粉、1.0%蛋白胨、3.0%玉米浆干粉。在摇瓶中对优化后的培养基配方进行验证，测得OD值为52.335，与正交试验结果一致。
2.350 L不锈钢发酵罐中试试验结果
由图4可知，0～2 h为迟缓期，较摇瓶缩短了1 h，镜检菌体稀少；2～12 h为对数生长期，菌体
快速增值，12 h OD值达到最高，为61.505，高
于摇瓶正交试验结果，生物量最大，此时镜检菌体增大、增长，并开始形成芽孢，
這是因为发酵罐搅拌和溶氧量远高于摇瓶，更有利于菌体生长；12 h后进入稳定期，镜检菌体基本全部形成芽孢；20 h进入衰亡期，菌体明显变少，芽孢开始脱落。12 h发酵液活菌计数达1.6×1010cfu/mL，芽孢率为96%。
3结论
通过单因素试验和正交试验确定了蜡样芽孢杆菌最适发酵培养基为：葡萄糖15.00 g/L，可溶性淀粉40.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，玉米浆干粉30.00 g/L，硫酸铵3.00 g/L，磷酸氢二钾5.00 g/L，磷酸二氢钠5.00 g/L，硫酸镁1.25 g/L，硫酸锰0.60 g/L，氯化钙2.00 g/L。优化后摇瓶OD值达52.335，是优化前的4倍，50 L不锈钢发酵罐中试发酵的OD值为61.505，发酵液活菌数达1.6×1010cfu/mL，较优化前的发酵液活菌数提高了1个数量级，表明优化后的发酵培养基显著提高了蜡样芽孢杆菌的生物量，具有实际应用价值，可为今后规模化生产提供理论依据。
参考文献
[1]
STEIN T.Bacillus subtilis antibiotics：Structures，synthesis and specific functions[J].Mol Microbiol，2005，56（4）：845-857.
[2] 秦玉昌，潘宝海，于荣，等.芽孢杆菌对畜禽生产性能的影响[J].中国饲料，2004（16）：8-10.
[3] 聂实践，林伯荃，朱桂茹，等.益生多（S-586）饲用微生态制剂的防病作用实验[J].饲料研究，1999（5）：27-28.
[4] 张惠云.微生态制剂在水产养殖中的应用[J].饲料博览，2000，21（6）：46-47.