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摘 要：為测定不同脱水程度金丝李（Garcinia paucinervis）种子的萌发情况及其复水后的吸水率、脱水过程中抗性生理指标的变化以及不同贮藏方式下种子的萌发情况，该文研究了金丝李种子的脱水敏感性和储藏特性。结果表明：（1）金丝李种子初始含水量为45.29%，室内通风处放置35 d失水率即达45%。（2）种子失水率低于18%时，萌发率和复水后的吸水率变化不显著;失水率超过18%时，萌发率和复水后吸水率均显著下降，失水率为42%时萌发率为0。其种子的临界含水量为27.29%，半致死含水量为12.72%。（3）随着种子脱水程度的加深，相对电导率、可溶性糖及脯氨酸含量逐步上升;丙二醛含量在失水率低于24%时变化不大，高于24%时显著提高;SOD和POD的活性均呈波动性变化，失水率为18%时活性均最高。（4）室温干藏1个月和-1、-20 ℃下湿藏1个月的种子均不能萌发;水浸贮藏1个月的种子萌发率显著降低;4 ℃湿藏1、3和6个月均显著延缓种子萌发，但对萌发率无显著影响。表明金丝李种子在失水率低于18%时，种子可通过抗性调节维持细胞的正常代谢，能忍受一定程度的脱水和低温;当失水率超过18%时，种子代谢失衡发生劣变直至死亡，属于低度的顽拗性种子。4 ℃湿沙藏（含水量7.5%）是短期贮藏其种子的较好方法。
关键词：种子含水量，萌发率，脱水敏感性，顽拗性种子，种子贮藏
Abstract：We studied the dehydration sensitivity and storage characteristics of G. paucinervis seeds by measuring the germination of seeds with different dehydration extents and the water absorption after rehydration，the change of physiological indices of resistance in the process of dehydration as well as the seed germination under different storage methods. The results were as follows：（1） The initial moisture content of G. paucinervis seeds was 45.29%. The dehydration rate was up to 45% when placed after 35 d in the indoor ventilated place. （2） When the dehydration rate was less than 18%，germination percentage（GP） and the water absorption rate after rewatering were not significantly different from those of fresh seeds. However，when the dehydration rate exceeded 18%，GP and the water absorption rate after rewatering were significantly decreased，and GP was 0 at dehydration rate 42%. The critical moisture content of seeds was 27.29%，and the lethal moisture content of 50% was 12.72%. （3） The relative conductivity，the contents of soluble sugar and proline were increased gradually with the deepening of seed dehydration. The content of malondialdehyde （MDA） changed little when the dehydration rate was less than 24%，and increased significantly when exceeding 24%. Both activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） showed a trend of fluctuation and peaked at dehydration rate 18%. （4） Seeds with desiccation storage for one month at room temperature，and all the seeds with storage in damp sand at -1 ℃ and -20 ℃ for one month could not germinate. GP of seeds with water immersion for one month dropped significantly. Germination processes of seeds with storage in damp sand for one month，three months or six months at 4 ℃ were delayed，but there was no significant effect on GP. It indicates that when the dehydration rate of G. paucinervis is less than 18%，seeds can regulate resistance to maintain normal metabolism of cells. The seeds can endure a certain degree of dehydration and low temperature. When the dehydration rate exceeds 18%，the metabolism of seeds is unba-lanced，and then deteriorated until death，which belong to minimally recalcitrant seeds. It also indicates that storage in damp sand at 4 ℃ （moisture content 7.5%） is a good method for short-term storage of G. paucinervis seeds. Key words：moisture content of seeds， germination percentage， dehydration sensitivity， recalcitrant seeds，seed storage
了解植物种子的贮藏特性对植物种质资源保存、引种及迁地保护至关重要（Costa et al.，2018;Wyse et al.，2017）。Roberts（1973）根据种子的贮藏行为将种子分为顽拗性（recalcitrant）种子与正常性（orthodox）种子。顽拗性种子在脱离母株时没经历成熟脱水，其含水量通常高达30%～60%，对脱水和低温敏感，干燥至含水量为15%～20%时大多死亡，在室温通风条件下其贮藏寿命只有数天至数周，不能像正常性种子一样进行干燥或低温贮藏（Berjak & Pammenter，2001）。因此，顽拗性种子的贮藏条件不易掌控，需保证其含水量高于临界含水量（critical moisture content，CMC）。此外，Ellis et al.（1990）把介于正常性和顽拗性之间的种子定义为中间性（intermediate）种子，其在含水量降低至7%～12%时受到伤害。产中间性种子的植物若起源于热带，则该种子对低温敏感（Hong & Eliis，1996）。
顽拗性种子脱水过程中活力下降的主要原因是膜脂过氧化作用导致膜结构与功能被破坏，抗氧化保护系统活性下降和自由基的积累，致使细胞代谢紊乱（Greggains et al.，2001;Varghese et al.，2011）。全球气候变化将对产顽拗性种子的植物生存造成一定威胁，因此顽拗性种子的脱水敏感性及储藏一直是研究热点。Pelissari et al.（2018）对巴西的66个树种种子脱水耐性的研究表明顽拗性种子脱水耐性的评估可从胚和胚乳、种皮和果皮的含水量着手。藤黄属的热带植物Garcinia gummi-gutta种子萌发缓慢，在含水量低于34%时萌发率大幅下降，于-10 ℃或5 ℃下贮藏2个月即完全失活，为热带休眠顽拗性种子，其在密闭的塑料箱中于15 ℃下贮藏18个月仍有90%的萌发率（Joshi et al.，2017）。此外，藤黄属其他植物如G. indica、G. xanthochymus等的种子也具有脱水敏感性。贮藏顽拗性种子的原则是在种子所能承受的最低温度下维持其含水量和活力，并防止微生物侵害（Berjak & Pammenter，2007）。布迪椰子（Butia capitata）种子在冷冻状态下保存易失去活力，但其分离出的胚可保存于超低温液氮中（Dias et al.，2015）。
金丝李（Garcinia paucinervis）系藤黄科（Guttiferae）藤黄属（Garcinia）常绿乔木，属国家二级重点保护植物和濒危级植物（Farm et al.，2003），为喀斯特山体特有珍贵树种，分布于广西西部、西南部和云南东南部海拔194～830 m的岩溶山林中（张俊杰等，2017），是集观赏价值、生态价值、药用价值和经济价值为一体的优良树种（Zhang et al.，2015a）。日前，该物种野生种群分布点有限且分散，大树及能结实的植株极少，天然更新困难（张俊杰等，2017）。近年来，喀斯特地貌生境的恶化已制约着喀斯特地区社会经济的发展。金丝李作为该地区优良生态修复树种，日前人工栽培较少，且鲜有关于其人工繁殖的报道。据作者前期研究发现，金丝李枝条扦插难以成活，其种子具休眠特性（张俊杰等，2018），在通风处存放1个月后便干瘪，生活力随之丧失，种子贮藏问题十分棘手，其苗木繁育极大受限。因此，该文通过开展金丝李种子不同脱水程度的萌发情况及其复水后的吸水率、脱水过程中抗性生理指标的变化、不同贮藏方式下种子的萌发情况等研究，探明其脱水敏感性程度并找出科学贮藏方法，为金丝李的保育和利用提供科学指导。
1 材料与方法
1.1 材料
金丝李种子于2016年6月采自弄岗国家级自然保护区（106°57′18″ E，22°27′58″ N）。果实采收后带回实验室堆沤10 d左右，搓洗掉果皮果肉并洗净种子，晾干表面水分以备用。
1.2 测定项目及方法
1.2.1 种子基本特征及含水量测定 采用百粒法测量种子千粒重，随机抽取50粒饱满种子，测量其二维尺度。以TTC法测定新鲜种子的生活力（宋松泉等，2005）。随机取3粒新鲜种子，切成1 mm薄片，（105±2）℃烘17 h后，以鲜重为基础计算种子含水量（ISTA，1999），5次重复。
1.2.2 材料的脱水处理 將种子于分析天平上称量其原重量W1，随即放在室内通风处（26～31 ℃，72%～82%RH）自然脱水，定期称其重量W2，计算失水率：失水率=（W1-W2）/ W1×100%，控制种子的失水率在6%、12%、18%、24%、30%、36%和42%共7个含水量梯度（允许0.3%以内的误差）。将部分新鲜（即初始含水量）种子和不同失水率的种子用液氮冷冻保存于-80 ℃冰箱内，用于抗性生理指标测定。
1.2.3 脱水种子复水后吸水率的测定 以新鲜种子为对照，将失水率为6%、12%、18%、24%、36%和42%的种子浸泡于蒸馏水中，置于25 ℃恒温培养箱中自然复水吸胀，每1天称重1次并换水，当种子吸水达到饱和时记录其重量W3，结合种子原重量W1计算脱水种子复水后的吸水率：吸水率=（W3-W1）/ W1×100%，各重复3次，并统计各脱水梯度种子吸水达到饱和所需的时间（以下简称吸水饱和时间）。
1.2.4 脱水种子萌发试验与萌发参数的计算 将1.2.2中7个不同脱水程度的种子以新鲜种子为对照进行萌发试验。播种前种子经0.1%的K2MnO4溶液消毒30 min，清水洗净。试验容器为容量为1 000 mL、172 mm × 117 mm × 70 mm的塑料盒，铺以4 cm厚经消毒的河沙为基质，播种深度为1 cm，每梯度2盒，每盒播10粒，3次重复，放入设定为25 ℃、周期性光照（3 000 lx，12 h·d-1）的LRH-250-G光照培养箱，适时添加蒸馏水保持基质湿润。萌发试验时长为448 d，以芽顶出沙层为种子萌发标准，观察到第1粒萌发的种子后，每7天统计1次萌发的种子数。根据种子萌发情况计算以下指标：萌发时滞（germination time lag，GTL）、萌发率（germination percentage，GP）和平均萌发时间（mean germination time，MGT），计算方法如下： GTL（d）：即萌发启动时间，指从萌发试验开始至第1粒种子开始萌发所用时间;
GP=萌发种子数/播种种子数×100%;
MGT = ∑（ti×ni）/∑ni。
式中，ti为播种之日开始的第i天，ni为播种后第i天萌发的种子数（Liu et al.，2005）。
1.2.5 脱水种子抗性生理指标的测定 取失水率为6%、12%、18%、24%、36%和42%的种子，用解剖刀剥去种皮。以新鲜种子为对照，用电导仪法测定脱水种子胚和胚乳的相对电导率（Chai et al.，2018）;用氮蓝四唑（NBT）法和愈创木酚法分别测定其超氧化物歧化酶（superoxide ismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性;用硫代巴比妥酸（TBA）法、蒽酮比色法和磺基水杨酸法分别测定其丙二醛（malondialdehyde，MDA）、可溶性糖和脯氨酸含量（李合生等，2000），各重复3次。
1.2.6 种子贮藏试验 将新鲜种子按以下8种方法进行贮藏：（1）室温干藏1个月;（2）4 ℃干藏1个月，种子装入牛皮纸袋保存于4 ℃冰箱;（3）水浸贮藏1个月，将种子置于烧杯中，加蒸馏水没过种子，置于25 ℃培养箱内，每天换水1次;（4）-20 ℃湿藏（将种子与含水量约7.5%的河沙按体积比1∶3混匀，下同）1个月;（5）-1 ℃湿藏1个月;（6）4 ℃湿藏1个月;（7）4 ℃湿藏3个月;（8）4 ℃湿藏6个月。将种子贮藏后按照1.2.4进行萌发试验，试验时长设定为350 d。
1.3 数据分析
用Microsoft Excel 2010软件统计数据并作表，采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，Duncan法进行数据差异比较（将萌发率拟进行平方根反正弦转换，使之方差齐性）。统计值以平均值±标准误（x±sx）表示。以SigmaPlot 11.0软件绘图。
2 结果与分析
2.1 金丝李种子的大小及含水量
金丝李种子卵形至宽卵形，胚包裹于胚乳层中，不易与胚乳分离。种子长（30.80±2.14）mm，直径（15.39±0.96）mm，千粒重（438 1.75±77.53）g。成熟种子的初始含水量为（45.29±0.72）%，种子生活力达（95.56±1.92）%。
2.2 室温储藏对种子脱水的影响
种子脱水的持续时间与失水率关系见图1，随着自然风干时间的增加种子均匀地脱水，当种子失水35 d之后，失水率在45%左右趋于平稳。
2.3 不同脱水程度种子复水后的吸水情况
金丝李种子的吸水过程十分缓慢，新鲜种子吸水饱和时间约为24 d，吸水率为14.55%。当种子失水率低于18%时，其饱和吸水率及吸水饱和时间与新鲜种子相比差异不显著。随着种子脱水程度的加深，其饱和吸水率与吸水饱和时间逐渐降低，失水率为42%的种子复水约12 d即达到饱和状态，此时的吸水率为-6.69%，表明失水率为42%的种子复水后已经恢复不到原来新鲜种子的重量（图2）。
2.4 脱水处理对种子萌发的影响
失水率为42%的金丝李种子萌发率为0。各脱水程度的种子萌发动态与萌发参数见图3和表1，未萌发的种子已完全腐烂。失水率36%的种子萌发率始终低于其他脱水程度的种子。如表1所示，脱水处理的种子GTL随着种子脱水程度的增加而逐渐延长。新鲜种子的GP为93.33%，当种子失水率低于18%时，GP没有显著变化;失水率超过18%时，GP下降较快，与对照差异均达显著水平。当种子脱水超过临界含水量（CMC）时种子活力大幅下降（Probert & Brierley，1989;Pammenter et al.，1998），以新鲜种子含水量为45.29%计，可知
金丝李种子的CMC为27.29%。当种子失水率为36%时，其GP仅为21.67%。而平均萌发时间随着脱水程度的加深呈波动性变化，失水率为12%时MGT已显著延长至242.88 d，在失水率为18%～24%时与对照无显著性差异，但失水率为36%时MGT又大幅延长至337.33 d。
种子萌发率低至新鲜种子萌发率一半时的含水量称为“半致死含水量（lethal moisture content of 50%，LMC50）”（何惠英和宋松泉，2003）。以新鲜种子萌发率和含水量分别为93.33%和45.29%计。由图4可知，金丝李种子的LMC50为12.72%。由图1可知，室内自然干燥约19 d即达到种子的半致死含水量。
2.5 种子脱水过程中抗性生理指标的变化
由新鲜金丝李种子脱水至失水率为42%时，相对电导率由52.03%直线上升至98.24%。由新鲜种子脱水至失水率为18%时，胚和胚乳的丙二醛含量上升了34.43%，差异不显著;而种子由失水率18%上升至42%时，MDA含量显著提高了
187.92%（图5：A）。
随着种子脱水程度的增加，SOD和POD活性均呈波动性变化趋势（图5：B）。失水率为18%时SOD与POD活性均达脱水过程的最高值;当种子失水率超过24%时，SOD与POD活性显著下降;失水率达42%时，活性均有所回升。
种子的可溶性糖含量在失水率低于6%时保持平稳，之后呈直线上升趋势，失水率为42%時可溶性糖含量是新鲜种子的3.03倍。随着种子脱水程度的增加，脯氨酸含量呈逐步上升趋势，失水率为42%时脯氨酸含量比新鲜种子显著增加了7.10倍（图5：C）。
2.6 贮藏方法对金丝李种子萌发的影响
室温干藏1个月的种子和-1、-20 ℃湿藏1个月的种子至试验结束后均完全腐烂。其余贮藏方法金丝李种子的萌发进程和萌发参数如图6和表2所示。最终GP显示，除WI1的种子GP显著低于对照外，其余4种贮藏方式与对照比均无显著差异。除DS1的GTL显著长于对照外，其余贮藏方式的GTL与对照相比无显著性差异。对于MGT、DS1和WI1与对照相比差异不显著，而SH1、SH3和SH6处理均显著延缓了种子萌发，即4 ℃湿藏延缓了金丝李种子萌发，但对GP影响不大。 3 讨论与结论
金丝李种子大而重且含水量高，形态上表现出顽拗性种子的特征。在种子失水率低于18%时，其饱和吸水率、吸水饱和时间与新鲜种子差异不显著，当失水率超过18%时，两个指标均急剧下降，失水率为42%的种子复水后已恢复不到种子原重。可能是种子在脱水程度较低时，可通过吸涨作用修复在脱水时膜结构与酶的改变，但种子在高度脱水时，结构蛋白质与酶发生了不可逆转的改变，吸涨作用减弱导致吸水量降低，种子逐渐失活。
金丝李种子在失水率低于18%时GP趋于平稳，失水率超过18%后GP急剧下降，说明轻度的脱水对种子萌发影响不大，但高度脱水则显著降低其萌发率。相关性分析表明金丝李种子失水率与萌发率呈极显著负相关（P<0.01），说明其对脱水敏感。因此在播种时，宜采用失水率低于18%，或夏季室温通风放置不超过8 d的种子。金丝李种子萌发过程漫长，其GTL随着种子脱水程度的加深而延长，可能是由于脱水后的种子生理修复需要时间。金丝李种子的MGT随着脱水程度的加深呈现波动性变化的趋势，这种现象在顽拗性的山血丹（Ardisia punctata）种子上也有体现（杨期和等，2013）。失水率在18%～24%时MGT与新鲜种子差异不大，可能与该含水量范围内引起了种子内源激素含量或某些酶的活性变化有关。
相对电导率和MDA含量常用来衡量种子劣变和受伤害程度（Chen et al.，2016）。MDA是膜脂过氧化的终产物，脂质过氧化会损害细胞的膜系统，增大膜透性，造成代谢紊乱，且MDA会毒害细胞，降低SOD、POD等抗氧化保护酶的活性，使蛋白质的结构和功能发生变化（Ma et al.，2015），这是种子劣变的主要原因。活性氧（reactive oxygen species，ROS）能加速膜脂过氧化，伤害蛋白质和DNA（Farooq et al.，2009），种子在正常代谢受影响时会累积ROS，且种子的脱水耐性与其抗氧化防御系统有关。金丝李种子在脱水初期，种子水分逆境胁迫机制被激活，引发保护性反应，SOD、POD等酶的活性在种子脱水过程中逐渐增强以清除不断产生的ROS，维持细胞膜的稳定性和完整性（Zhang et al.，2015b），所以相对电导率和MDA的增加均较缓慢;当种子失水率在18%～36%时，MDA含量的迅速上升表明膜脂过氧化加剧，MDA和ROS等有害物质的积累对细胞的毒害程度加深，超出了种子的耐受范围，致使SOD和POD等酶的活性骤降，不能有效清除ROS（Tang，2012），伴随着细胞膜透性增大、细胞内含物外渗，表现为相对电导率的急剧增加，种子的劣变加剧而逐渐失活。金丝李种子在失水率低于36%时，其相对电导率、MDA、SOD和POD 4个抗性生理指标与顽拗性的三七（Panax notoginseng）和板栗（Castanea mollissima）种子的整体变化趋势一致（段银妹等，2014; 宗梅等，2006）。但当种子失水率超过36%时，POD酶则参与了ROS的产生，对细胞产生毒害，或是与引起褐变的酚类物质和H2O2反应（杨淑慎和高俊凤，2001），加速已受伤种子的劣变，造成细胞解体而死亡，这种情况在七叶树（Aesculus chinensis）种子的脱水后期也有体现（陳淑芬，2006）。而脱水后期SOD升高的原因尚需进一步研究。可溶性糖能与LEA蛋白形成复合物协同控制脱水速度，脯氨酸则能稳定组织内的代谢及原生质胶体（李合生等，2000）。这两种渗透调节物质可协助POD、SOD清除细胞体内多余的自由基，保护细胞免受伤害。金丝李种子随着脱水程度的增加，可溶性糖、脯氨酸含量直线上升，积累溶质以降低渗透势，维持细胞渗透平衡，说明其具有一定的渗透调节能力。结合上述分析可知，金丝李种子在失水率低于18%时，其萌发率和复水后的吸水情况与新鲜种子差异不显著，种子可通过抗性调节维持细胞的正常代谢;当失水率超过18%时，种子代谢失衡而发生劣变直至死亡。
室温干藏1个月与-1、-20 ℃湿藏1个月的金丝李种子不能萌发，4 ℃干藏下有少量种子干瘪，说明其不宜干藏，对0 ℃以下低温敏感。因其种子含水量高，直接贮藏于低于0 ℃环境会引起细胞内结冰，冻融时破坏膜系统而诱发劣变。低于15 ℃的储藏温度对于大多数热带种子来说是致命的（Bedi & Basra，1993），如Garcinia gummi-gutta种子（Joshi et al.，2017）。而金丝李种子可在4 ℃湿藏6个月，虽然其GTL和MGT有所延长，但最终GP变化不大，说明4 ℃湿沙藏降低了种子贮藏过程中的新陈代谢，减缓水份散失，是短期贮藏金丝李种子的良好方法。水浸贮藏法可能由于部分种子缺氧或微生物感染坏死导致萌发率较低。
根据种子对脱水耐性和低温敏感性的差异，将顽拗性种子分为高度、中度和低度顽拗性3种类型（Ntuli et al.，2015）。通常温带与热带地区的顽拗性种子相比，其耐脱水和低温能力要强（Pammenter & Berjak，2000）。金丝李生于热带向亚热带的气候过渡带，其种子能忍受一定程度的干燥脱水和0 ℃以上的低温，其CMC为27.29%，LMC50为12.72%，低于0 ℃则种子死亡，其顽拗性程度低于产于北热带的同属植物云树（G. cowa，种子初始含水量为50.1%，CMC为39%，4 ℃贮藏1个月均死亡）（Liu et al.，2005），与低度顽拗性的板栗（Castanea mollissima）种子接近（自然干燥9 d的种子萌发率100%，干燥15 d萌发率为53.5%，可于0～2 ℃甚至-4 ℃下湿藏）（陶月良和朱诚，2004; 王贵禧等，1999），高于中间性的凹叶木兰（Magnolia sargentiana）种子（CMC和LMC50分别为15.3%、5.3～7.1%）（唐安军，2014）。因此，金丝李种子属于低度的顽拗性种子。根据Baskin & Baskin（2005）对休眠种子的定义，未经处理的金丝李种子萌发启动时间超过4周，其种子存在休眠。由于高含水量，顽拗性种子大多萌发迅速，被认为无休眠特性或胎生性（Tweddle et al.，2003）。但近年来，陆续有文献报道某些顽拗性种子具有休眠特性（Jayasuriya et al.，2012;Joshi et al.，2017），本研究支持后者的观点。 金丝李分布于桂西和滇东南石灰岩山林里，凋落物对种子的掩埋可保持种子的含水量，冬季的相对低温为种子创造了天然的湿藏条件。石山上由于岩石裸露、土层薄而较干旱，其种子低度顽拗性的特点使之在短期轻度的干旱下保持较高的生活力。本研究结果可为金丝李这一珍贵资源的保育与利用奠定基础，而金丝李种质的长期保存可否用离体胚的超低温保存法，需后续探讨。
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关键词：种子含水量，萌发率，脱水敏感性，顽拗性种子，种子贮藏
Abstract：We studied the dehydration sensitivity and storage characteristics of G. paucinervis seeds by measuring the germination of seeds with different dehydration extents and the water absorption after rehydration，the change of physiological indices of resistance in the process of dehydration as well as the seed germination under different storage methods. The results were as follows：（1） The initial moisture content of G. paucinervis seeds was 45.29%. The dehydration rate was up to 45% when placed after 35 d in the indoor ventilated place. （2） When the dehydration rate was less than 18%，germination percentage（GP） and the water absorption rate after rewatering were not significantly different from those of fresh seeds. However，when the dehydration rate exceeded 18%，GP and the water absorption rate after rewatering were significantly decreased，and GP was 0 at dehydration rate 42%. The critical moisture content of seeds was 27.29%，and the lethal moisture content of 50% was 12.72%. （3） The relative conductivity，the contents of soluble sugar and proline were increased gradually with the deepening of seed dehydration. The content of malondialdehyde （MDA） changed little when the dehydration rate was less than 24%，and increased significantly when exceeding 24%. Both activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） showed a trend of fluctuation and peaked at dehydration rate 18%. （4） Seeds with desiccation storage for one month at room temperature，and all the seeds with storage in damp sand at -1 ℃ and -20 ℃ for one month could not germinate. GP of seeds with water immersion for one month dropped significantly. Germination processes of seeds with storage in damp sand for one month，three months or six months at 4 ℃ were delayed，but there was no significant effect on GP. It indicates that when the dehydration rate of G. paucinervis is less than 18%，seeds can regulate resistance to maintain normal metabolism of cells. The seeds can endure a certain degree of dehydration and low temperature. When the dehydration rate exceeds 18%，the metabolism of seeds is unba-lanced，and then deteriorated until death，which belong to minimally recalcitrant seeds. It also indicates that storage in damp sand at 4 ℃ （moisture content 7.5%） is a good method for short-term storage of G. paucinervis seeds. Key words：moisture content of seeds， germination percentage， dehydration sensitivity， recalcitrant seeds，seed storage
了解植物种子的贮藏特性对植物种质资源保存、引种及迁地保护至关重要（Costa et al.，2018;Wyse et al.，2017）。Roberts（1973）根据种子的贮藏行为将种子分为顽拗性（recalcitrant）种子与正常性（orthodox）种子。顽拗性种子在脱离母株时没经历成熟脱水，其含水量通常高达30%～60%，对脱水和低温敏感，干燥至含水量为15%～20%时大多死亡，在室温通风条件下其贮藏寿命只有数天至数周，不能像正常性种子一样进行干燥或低温贮藏（Berjak & Pammenter，2001）。因此，顽拗性种子的贮藏条件不易掌控，需保证其含水量高于临界含水量（critical moisture content，CMC）。此外，Ellis et al.（1990）把介于正常性和顽拗性之间的种子定义为中间性（intermediate）种子，其在含水量降低至7%～12%时受到伤害。产中间性种子的植物若起源于热带，则该种子对低温敏感（Hong & Eliis，1996）。
顽拗性种子脱水过程中活力下降的主要原因是膜脂过氧化作用导致膜结构与功能被破坏，抗氧化保护系统活性下降和自由基的积累，致使细胞代谢紊乱（Greggains et al.，2001;Varghese et al.，2011）。全球气候变化将对产顽拗性种子的植物生存造成一定威胁，因此顽拗性种子的脱水敏感性及储藏一直是研究热点。Pelissari et al.（2018）对巴西的66个树种种子脱水耐性的研究表明顽拗性种子脱水耐性的评估可从胚和胚乳、种皮和果皮的含水量着手。藤黄属的热带植物Garcinia gummi-gutta种子萌发缓慢，在含水量低于34%时萌发率大幅下降，于-10 ℃或5 ℃下贮藏2个月即完全失活，为热带休眠顽拗性种子，其在密闭的塑料箱中于15 ℃下贮藏18个月仍有90%的萌发率（Joshi et al.，2017）。此外，藤黄属其他植物如G. indica、G. xanthochymus等的种子也具有脱水敏感性。贮藏顽拗性种子的原则是在种子所能承受的最低温度下维持其含水量和活力，并防止微生物侵害（Berjak & Pammenter，2007）。布迪椰子（Butia capitata）种子在冷冻状态下保存易失去活力，但其分离出的胚可保存于超低温液氮中（Dias et al.，2015）。
金丝李（Garcinia paucinervis）系藤黄科（Guttiferae）藤黄属（Garcinia）常绿乔木，属国家二级重点保护植物和濒危级植物（Farm et al.，2003），为喀斯特山体特有珍贵树种，分布于广西西部、西南部和云南东南部海拔194～830 m的岩溶山林中（张俊杰等，2017），是集观赏价值、生态价值、药用价值和经济价值为一体的优良树种（Zhang et al.，2015a）。日前，该物种野生种群分布点有限且分散，大树及能结实的植株极少，天然更新困难（张俊杰等，2017）。近年来，喀斯特地貌生境的恶化已制约着喀斯特地区社会经济的发展。金丝李作为该地区优良生态修复树种，日前人工栽培较少，且鲜有关于其人工繁殖的报道。据作者前期研究发现，金丝李枝条扦插难以成活，其种子具休眠特性（张俊杰等，2018），在通风处存放1个月后便干瘪，生活力随之丧失，种子贮藏问题十分棘手，其苗木繁育极大受限。因此，该文通过开展金丝李种子不同脱水程度的萌发情况及其复水后的吸水率、脱水过程中抗性生理指标的变化、不同贮藏方式下种子的萌发情况等研究，探明其脱水敏感性程度并找出科学贮藏方法，为金丝李的保育和利用提供科学指导。
1 材料与方法
1.1 材料
金丝李种子于2016年6月采自弄岗国家级自然保护区（106°57′18″ E，22°27′58″ N）。果实采收后带回实验室堆沤10 d左右，搓洗掉果皮果肉并洗净种子，晾干表面水分以备用。
1.2 测定项目及方法
1.2.1 种子基本特征及含水量测定 采用百粒法测量种子千粒重，随机抽取50粒饱满种子，测量其二维尺度。以TTC法测定新鲜种子的生活力（宋松泉等，2005）。随机取3粒新鲜种子，切成1 mm薄片，（105±2）℃烘17 h后，以鲜重为基础计算种子含水量（ISTA，1999），5次重复。
1.2.2 材料的脱水处理 將种子于分析天平上称量其原重量W1，随即放在室内通风处（26～31 ℃，72%～82%RH）自然脱水，定期称其重量W2，计算失水率：失水率=（W1-W2）/ W1×100%，控制种子的失水率在6%、12%、18%、24%、30%、36%和42%共7个含水量梯度（允许0.3%以内的误差）。将部分新鲜（即初始含水量）种子和不同失水率的种子用液氮冷冻保存于-80 ℃冰箱内，用于抗性生理指标测定。
1.2.3 脱水种子复水后吸水率的测定 以新鲜种子为对照，将失水率为6%、12%、18%、24%、36%和42%的种子浸泡于蒸馏水中，置于25 ℃恒温培养箱中自然复水吸胀，每1天称重1次并换水，当种子吸水达到饱和时记录其重量W3，结合种子原重量W1计算脱水种子复水后的吸水率：吸水率=（W3-W1）/ W1×100%，各重复3次，并统计各脱水梯度种子吸水达到饱和所需的时间（以下简称吸水饱和时间）。
1.2.4 脱水种子萌发试验与萌发参数的计算 将1.2.2中7个不同脱水程度的种子以新鲜种子为对照进行萌发试验。播种前种子经0.1%的K2MnO4溶液消毒30 min，清水洗净。试验容器为容量为1 000 mL、172 mm × 117 mm × 70 mm的塑料盒，铺以4 cm厚经消毒的河沙为基质，播种深度为1 cm，每梯度2盒，每盒播10粒，3次重复，放入设定为25 ℃、周期性光照（3 000 lx，12 h·d-1）的LRH-250-G光照培养箱，适时添加蒸馏水保持基质湿润。萌发试验时长为448 d，以芽顶出沙层为种子萌发标准，观察到第1粒萌发的种子后，每7天统计1次萌发的种子数。根据种子萌发情况计算以下指标：萌发时滞（germination time lag，GTL）、萌发率（germination percentage，GP）和平均萌发时间（mean germination time，MGT），计算方法如下： GTL（d）：即萌发启动时间，指从萌发试验开始至第1粒种子开始萌发所用时间;
GP=萌发种子数/播种种子数×100%;
MGT = ∑（ti×ni）/∑ni。
式中，ti为播种之日开始的第i天，ni为播种后第i天萌发的种子数（Liu et al.，2005）。
1.2.5 脱水种子抗性生理指标的测定 取失水率为6%、12%、18%、24%、36%和42%的种子，用解剖刀剥去种皮。以新鲜种子为对照，用电导仪法测定脱水种子胚和胚乳的相对电导率（Chai et al.，2018）;用氮蓝四唑（NBT）法和愈创木酚法分别测定其超氧化物歧化酶（superoxide ismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性;用硫代巴比妥酸（TBA）法、蒽酮比色法和磺基水杨酸法分别测定其丙二醛（malondialdehyde，MDA）、可溶性糖和脯氨酸含量（李合生等，2000），各重复3次。
1.2.6 种子贮藏试验 将新鲜种子按以下8种方法进行贮藏：（1）室温干藏1个月;（2）4 ℃干藏1个月，种子装入牛皮纸袋保存于4 ℃冰箱;（3）水浸贮藏1个月，将种子置于烧杯中，加蒸馏水没过种子，置于25 ℃培养箱内，每天换水1次;（4）-20 ℃湿藏（将种子与含水量约7.5%的河沙按体积比1∶3混匀，下同）1个月;（5）-1 ℃湿藏1个月;（6）4 ℃湿藏1个月;（7）4 ℃湿藏3个月;（8）4 ℃湿藏6个月。将种子贮藏后按照1.2.4进行萌发试验，试验时长设定为350 d。
1.3 数据分析
用Microsoft Excel 2010软件统计数据并作表，采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，Duncan法进行数据差异比较（将萌发率拟进行平方根反正弦转换，使之方差齐性）。统计值以平均值±标准误（x±sx）表示。以SigmaPlot 11.0软件绘图。
2 结果与分析
2.1 金丝李种子的大小及含水量
金丝李种子卵形至宽卵形，胚包裹于胚乳层中，不易与胚乳分离。种子长（30.80±2.14）mm，直径（15.39±0.96）mm，千粒重（438 1.75±77.53）g。成熟种子的初始含水量为（45.29±0.72）%，种子生活力达（95.56±1.92）%。
2.2 室温储藏对种子脱水的影响
种子脱水的持续时间与失水率关系见图1，随着自然风干时间的增加种子均匀地脱水，当种子失水35 d之后，失水率在45%左右趋于平稳。
2.3 不同脱水程度种子复水后的吸水情况
金丝李种子的吸水过程十分缓慢，新鲜种子吸水饱和时间约为24 d，吸水率为14.55%。当种子失水率低于18%时，其饱和吸水率及吸水饱和时间与新鲜种子相比差异不显著。随着种子脱水程度的加深，其饱和吸水率与吸水饱和时间逐渐降低，失水率为42%的种子复水约12 d即达到饱和状态，此时的吸水率为-6.69%，表明失水率为42%的种子复水后已经恢复不到原来新鲜种子的重量（图2）。
2.4 脱水处理对种子萌发的影响
失水率为42%的金丝李种子萌发率为0。各脱水程度的种子萌发动态与萌发参数见图3和表1，未萌发的种子已完全腐烂。失水率36%的种子萌发率始终低于其他脱水程度的种子。如表1所示，脱水处理的种子GTL随着种子脱水程度的增加而逐渐延长。新鲜种子的GP为93.33%，当种子失水率低于18%时，GP没有显著变化;失水率超过18%时，GP下降较快，与对照差异均达显著水平。当种子脱水超过临界含水量（CMC）时种子活力大幅下降（Probert & Brierley，1989;Pammenter et al.，1998），以新鲜种子含水量为45.29%计，可知
金丝李种子的CMC为27.29%。当种子失水率为36%时，其GP仅为21.67%。而平均萌发时间随着脱水程度的加深呈波动性变化，失水率为12%时MGT已显著延长至242.88 d，在失水率为18%～24%时与对照无显著性差异，但失水率为36%时MGT又大幅延长至337.33 d。
种子萌发率低至新鲜种子萌发率一半时的含水量称为“半致死含水量（lethal moisture content of 50%，LMC50）”（何惠英和宋松泉，2003）。以新鲜种子萌发率和含水量分别为93.33%和45.29%计。由图4可知，金丝李种子的LMC50为12.72%。由图1可知，室内自然干燥约19 d即达到种子的半致死含水量。
2.5 种子脱水过程中抗性生理指标的变化
由新鲜金丝李种子脱水至失水率为42%时，相对电导率由52.03%直线上升至98.24%。由新鲜种子脱水至失水率为18%时，胚和胚乳的丙二醛含量上升了34.43%，差异不显著;而种子由失水率18%上升至42%时，MDA含量显著提高了
187.92%（图5：A）。
随着种子脱水程度的增加，SOD和POD活性均呈波动性变化趋势（图5：B）。失水率为18%时SOD与POD活性均达脱水过程的最高值;当种子失水率超过24%时，SOD与POD活性显著下降;失水率达42%时，活性均有所回升。
种子的可溶性糖含量在失水率低于6%时保持平稳，之后呈直线上升趋势，失水率为42%時可溶性糖含量是新鲜种子的3.03倍。随着种子脱水程度的增加，脯氨酸含量呈逐步上升趋势，失水率为42%时脯氨酸含量比新鲜种子显著增加了7.10倍（图5：C）。
2.6 贮藏方法对金丝李种子萌发的影响
室温干藏1个月的种子和-1、-20 ℃湿藏1个月的种子至试验结束后均完全腐烂。其余贮藏方法金丝李种子的萌发进程和萌发参数如图6和表2所示。最终GP显示，除WI1的种子GP显著低于对照外，其余4种贮藏方式与对照比均无显著差异。除DS1的GTL显著长于对照外，其余贮藏方式的GTL与对照相比无显著性差异。对于MGT、DS1和WI1与对照相比差异不显著，而SH1、SH3和SH6处理均显著延缓了种子萌发，即4 ℃湿藏延缓了金丝李种子萌发，但对GP影响不大。 3 讨论与结论
金丝李种子大而重且含水量高，形态上表现出顽拗性种子的特征。在种子失水率低于18%时，其饱和吸水率、吸水饱和时间与新鲜种子差异不显著，当失水率超过18%时，两个指标均急剧下降，失水率为42%的种子复水后已恢复不到种子原重。可能是种子在脱水程度较低时，可通过吸涨作用修复在脱水时膜结构与酶的改变，但种子在高度脱水时，结构蛋白质与酶发生了不可逆转的改变，吸涨作用减弱导致吸水量降低，种子逐渐失活。
金丝李种子在失水率低于18%时GP趋于平稳，失水率超过18%后GP急剧下降，说明轻度的脱水对种子萌发影响不大，但高度脱水则显著降低其萌发率。相关性分析表明金丝李种子失水率与萌发率呈极显著负相关（P<0.01），说明其对脱水敏感。因此在播种时，宜采用失水率低于18%，或夏季室温通风放置不超过8 d的种子。金丝李种子萌发过程漫长，其GTL随着种子脱水程度的加深而延长，可能是由于脱水后的种子生理修复需要时间。金丝李种子的MGT随着脱水程度的加深呈现波动性变化的趋势，这种现象在顽拗性的山血丹（Ardisia punctata）种子上也有体现（杨期和等，2013）。失水率在18%～24%时MGT与新鲜种子差异不大，可能与该含水量范围内引起了种子内源激素含量或某些酶的活性变化有关。
相对电导率和MDA含量常用来衡量种子劣变和受伤害程度（Chen et al.，2016）。MDA是膜脂过氧化的终产物，脂质过氧化会损害细胞的膜系统，增大膜透性，造成代谢紊乱，且MDA会毒害细胞，降低SOD、POD等抗氧化保护酶的活性，使蛋白质的结构和功能发生变化（Ma et al.，2015），这是种子劣变的主要原因。活性氧（reactive oxygen species，ROS）能加速膜脂过氧化，伤害蛋白质和DNA（Farooq et al.，2009），种子在正常代谢受影响时会累积ROS，且种子的脱水耐性与其抗氧化防御系统有关。金丝李种子在脱水初期，种子水分逆境胁迫机制被激活，引发保护性反应，SOD、POD等酶的活性在种子脱水过程中逐渐增强以清除不断产生的ROS，维持细胞膜的稳定性和完整性（Zhang et al.，2015b），所以相对电导率和MDA的增加均较缓慢;当种子失水率在18%～36%时，MDA含量的迅速上升表明膜脂过氧化加剧，MDA和ROS等有害物质的积累对细胞的毒害程度加深，超出了种子的耐受范围，致使SOD和POD等酶的活性骤降，不能有效清除ROS（Tang，2012），伴随着细胞膜透性增大、细胞内含物外渗，表现为相对电导率的急剧增加，种子的劣变加剧而逐渐失活。金丝李种子在失水率低于36%时，其相对电导率、MDA、SOD和POD 4个抗性生理指标与顽拗性的三七（Panax notoginseng）和板栗（Castanea mollissima）种子的整体变化趋势一致（段银妹等，2014; 宗梅等，2006）。但当种子失水率超过36%时，POD酶则参与了ROS的产生，对细胞产生毒害，或是与引起褐变的酚类物质和H2O2反应（杨淑慎和高俊凤，2001），加速已受伤种子的劣变，造成细胞解体而死亡，这种情况在七叶树（Aesculus chinensis）种子的脱水后期也有体现（陳淑芬，2006）。而脱水后期SOD升高的原因尚需进一步研究。可溶性糖能与LEA蛋白形成复合物协同控制脱水速度，脯氨酸则能稳定组织内的代谢及原生质胶体（李合生等，2000）。这两种渗透调节物质可协助POD、SOD清除细胞体内多余的自由基，保护细胞免受伤害。金丝李种子随着脱水程度的增加，可溶性糖、脯氨酸含量直线上升，积累溶质以降低渗透势，维持细胞渗透平衡，说明其具有一定的渗透调节能力。结合上述分析可知，金丝李种子在失水率低于18%时，其萌发率和复水后的吸水情况与新鲜种子差异不显著，种子可通过抗性调节维持细胞的正常代谢;当失水率超过18%时，种子代谢失衡而发生劣变直至死亡。
室温干藏1个月与-1、-20 ℃湿藏1个月的金丝李种子不能萌发，4 ℃干藏下有少量种子干瘪，说明其不宜干藏，对0 ℃以下低温敏感。因其种子含水量高，直接贮藏于低于0 ℃环境会引起细胞内结冰，冻融时破坏膜系统而诱发劣变。低于15 ℃的储藏温度对于大多数热带种子来说是致命的（Bedi & Basra，1993），如Garcinia gummi-gutta种子（Joshi et al.，2017）。而金丝李种子可在4 ℃湿藏6个月，虽然其GTL和MGT有所延长，但最终GP变化不大，说明4 ℃湿沙藏降低了种子贮藏过程中的新陈代谢，减缓水份散失，是短期贮藏金丝李种子的良好方法。水浸贮藏法可能由于部分种子缺氧或微生物感染坏死导致萌发率较低。
根据种子对脱水耐性和低温敏感性的差异，将顽拗性种子分为高度、中度和低度顽拗性3种类型（Ntuli et al.，2015）。通常温带与热带地区的顽拗性种子相比，其耐脱水和低温能力要强（Pammenter & Berjak，2000）。金丝李生于热带向亚热带的气候过渡带，其种子能忍受一定程度的干燥脱水和0 ℃以上的低温，其CMC为27.29%，LMC50为12.72%，低于0 ℃则种子死亡，其顽拗性程度低于产于北热带的同属植物云树（G. cowa，种子初始含水量为50.1%，CMC为39%，4 ℃贮藏1个月均死亡）（Liu et al.，2005），与低度顽拗性的板栗（Castanea mollissima）种子接近（自然干燥9 d的种子萌发率100%，干燥15 d萌发率为53.5%，可于0～2 ℃甚至-4 ℃下湿藏）（陶月良和朱诚，2004; 王贵禧等，1999），高于中间性的凹叶木兰（Magnolia sargentiana）种子（CMC和LMC50分别为15.3%、5.3～7.1%）（唐安军，2014）。因此，金丝李种子属于低度的顽拗性种子。根据Baskin & Baskin（2005）对休眠种子的定义，未经处理的金丝李种子萌发启动时间超过4周，其种子存在休眠。由于高含水量，顽拗性种子大多萌发迅速，被认为无休眠特性或胎生性（Tweddle et al.，2003）。但近年来，陆续有文献报道某些顽拗性种子具有休眠特性（Jayasuriya et al.，2012;Joshi et al.，2017），本研究支持后者的观点。 金丝李分布于桂西和滇东南石灰岩山林里，凋落物对种子的掩埋可保持种子的含水量，冬季的相对低温为种子创造了天然的湿藏条件。石山上由于岩石裸露、土层薄而较干旱，其种子低度顽拗性的特点使之在短期轻度的干旱下保持较高的生活力。本研究结果可为金丝李这一珍贵资源的保育与利用奠定基础，而金丝李种质的长期保存可否用离体胚的超低温保存法，需后续探讨。
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