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自从20世纪70年代利用花药培养技术获得大量花粉单倍体以来，花培技术的应用潜力已日益显示出来。花粉单倍体加倍后的二倍体(DH)在植物育种、突变、玻璃质选择、分子制图和植物改良方面具有广阔的应用前景。花培育种的目的就是要获得加倍的双倍体植株以及选育出综合性状稳定的优良品种(系)。目前报道的小麦花粉加倍方法均是采用在分蘖盛期用秋水仙素溶液浸泡分蘖节的方法，也有在组织培养过程中接加入秋水仙素的方法。但是，由于秋水仙素对植株的毒害作用较大，植株死亡率较高，结果仍不够理想。为此，研究人员对这两种加倍方法进行了比较和改良。
1材料和方法
试验于2005～2007年进行。供试小麦材料为晋麦47×975025、农大5013×临远993两个不同杂种基因型F1代花药。
诱导培养基为N6+2，4-D2mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖10％；分化培养基为N6+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖3％：壮苗培养基为MS+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+多效唑3mg/L+蔗糖3％。
取穗时间以花粉单核中、晚期为最佳时期(即幼穗顶部距旗叶基部5～10cm，幼穗未露出旗叶鞘，花药长度在2～3mm)。取回的穗子用湿毛巾包裹，放入4℃的冰箱预处理2～3天。接种前，剪去旗叶(留叶鞘)，用75％的酒精消毒，并从叶鞘下端将幼穗取出，无菌接种。
试验分3种处理：
(1)对愈伤组织的处理。秋水仙碱的浓度为：O(CK)、0.02‰、0.05‰、0.1‰、0.3‰。处理温度分两种：一是愈伤组织在4℃低温下春化一个月后，转入含有秋水仙碱的脱分化培养基中，在25℃常温下培养20天后将绿芽(苗)转入壮苗培养基中(T1)，二是将愈伤组织转入含有秋水仙碱的脱分化培养基中，在4℃低温下培养30天左右，再在25％常温下培养15天(T2)，然后经1～2次壮苗后移栽温室，统计结实株数，计算结实株率。
(2)对再生苗根系的处理。将再生植株经过壮苗培养基培养后，分别用0.2％的秋水仙碱溶液浸根5小时(处理1)和10小时(处理2) (24～25℃)、0.05％的秋水仙碱溶液浸根5小时(处理3)和10小时(处理4)(24～25％)，处理后将苗移栽温室。统计结实株数，并计算结实株率。
(3)对分蘖节的处理。在分蘖盛期，将花粉植株从土中挖出，洗净根部的泥土，在24～25℃条件下，用0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节，分5小时和10小时两个处理，处理后重新移栽土中，统计结实株数，并计算结实株率。
结实株率(％)=结实株数/移栽绿苗数×100％
2结果与分析
2.1秋水仙碱对愈伤组织分化和加倍率的影响
由表1看出，无论在T1和T2处理中，0.02‰和0.05‰秋水仙碱浓度处理的愈伤组织再生植株结实率都明显高于对照和其它处理，最高结实率达61.5％。最低33.3％，T2处理与T1处理相比，T2处理的结实率又高于T1。但从绿苗分化率来看，0.02‰的绿苗分化率显著高于0.05‰的绿苗分化率，0.02‰的绿苗分化率比0.05‰的绿苗分化率高53.2～43.2个百分点。0.1‰和0.3‰秋水仙碱浓度处理的愈伤组织在25℃常温下培养10天后逐渐褐化，只有“晋麦47×975025”获得结实绿苗1株。
2.2秋水仙碱溶液浸根的浓度与时间对移栽成活率和加倍率的影响
秋水仙碱溶液浸根的浓度与时间对愈伤组织再生植株移栽成活率和加倍率有显著的影响。经过0.2％、0.05％浓度秋水仙碱5小时的浸根处理，“晋麦47×975025”花药愈伤组织再生壮苗移栽成活率分别为69.6％和86.7％，高于10小时的浸根处理38.9个百分点和49.9个百分点：“农大5013×临远993”花药愈伤组织再生壮苗移栽成活
率分别为66.7％和76.5％，高于10小时的浸根处理39.4个百分点和53.4个百分点。说明无论高浓度还是低浓度长时间用秋水仙碱溶液浸根对再生苗都有一定的危害，高浓度的危害程度更大。
用0.2％的秋水仙碱浸根处理5小时，2个杂种基因型结实株率平均高这37.5％，显著高于其它处理，说明用0.2％的秋水仙碱浸根处理5小时，是提高单倍体植株加倍率较为理想、有效的措施。
2.3秋水仙碱溶液浸泡分蘖节对加倍率的影响
从表3可以看出，无论用0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节5小时，还是10小时，其2个杂种基因型结实株率都高于用0.2％的秋水仙碱浸根处理5小时，0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节10小时，花粉植株加倍率可达50％以上，加倍效果比较稳定。但是，经过10小时处理的麦苗比经过5小时处理的麦苗缓苗时间延迟，植株发育不好。虽然5小时处理比10小时处理的结实株率低8.3％～8.4％，但5小时处理的麦苗缓苗时间短，植株的发育较好。因此，用0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节的时间应在5～10小时之间较为适宜。
3讨论
早在1979年，Wenzel等就根据当时科技发展情况提出了综合运用单倍体诱导技术、染色体加倍技术、细胞融合技术的“分解一综合育种”方案，而其中倍性操作是该方案的重要环节。到目前为止秋水仙素是诱导植物体细胞染色体加倍的最有效的化学诱变剂，通过该法诱导培育出的良种已在生产中使用。
在花药培养时利用秋水仙碱处理可增加双单倍体的数量。这在多种植物中得到证实，在小麦花药培养中也有许多报道。韩彬、陈孝等对硬粒小麦一簇毛麦的愈伤组织进行秋水仙碱处理，得到15.8％的结实率。王敬东，任贤等用0.2％的秋水仙碱浸根5小时，成活率为90.7％～100％，平均为94.2％；结实率的变化为7.7％～75.0％，平均为45.9％。鲍文奎等在小麦一黑麦杂种F1幼苗分蘖盛期用秋水仙碱溶液浸泡分蘖节，染色体加倍成功率为40.8％。
该试验证明，在小麦花药组织培养中，用0.02‰和0.05‰的秋水仙碱对愈伤组织(在时宜的条件下)进行染色体加倍处理可获得33.3％～61.5％结实株率，比用0.2‰秋水仙碱浸根法(15.4％～37.5％结实株率)更经济、简便，可达到快繁与加倍同时进行的目的。用0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节虽然能获得38.3％～58.3％的结实株率，加倍效果也比较稳定，但是，该方法需药剂量大，成本较高，而且移栽后，幼苗成活率会受到影响。
针对不同材料的差异性，秋水仙素作用的浓度、时间、温度、处理方法和材料部位等存在不同，有必要对秋水仙素诱导的关键技术因子进行研究。同时要对影响诱变效率的其它次要因素进行摸索，如预处理酸碱度，后处理手段等，这些方面人们往往忽视。所做工作和研究不多，有待加强。
参考文献：
1张玉玲，李德森，李宝森，等.小麦花粉植株染色体加倍和结实的研究，遗传，1984，6 (4)：6～8.
2隋新霞，樊庆琦，等.小麦花药培养研究进展[J].麦类作物学报，2005，24 (4)：127～131.
3景蕊莲，昌小平，等.用花药培养创建小麦加倍单倍体作图群体[J].1999，9 (3]：4～8.
4李浚明.植物组织培养教程.北京：中国农业出版社.108～109.
5韩彬，陈孝，徐惠君，等.硬粒小麦-簇毛麦双单倍体愈伤组织染色体加倍技术的研究[J].植物学报，1990，32(3)：191～197.
6郑永强，徐坤，等.秋水仙素在植物体细胞染色体加倍中的应用研究进展[J].中国农学通报，2003，19 (5)89～98.
7王敬东，任贤，等.春小麦花药单倍体植株染色体加倍技术初探[J].麦类作物学报，2005，25(2)：13～17.
8韩彬，陈孝，等.硬粒小麦-簇毛麦双单倍体愈伤组织染色体加倍技术的研究[J].植物学报，1990，32(3)：191～197.
9鲍文奎，严育瑞，等.禾谷类作物的多倍体育种方法研究-加倍小麦-黑麦杂种第一代染色体数的秋水仙碱技术[J].作物学报，1963，2(2)：161～176.
10彭尽晖，张良波，等.秋水仙索在植物倍性育种中的应用进展[J].湖南林业科技，2004，31(5)，22～25.
1材料和方法
试验于2005～2007年进行。供试小麦材料为晋麦47×975025、农大5013×临远993两个不同杂种基因型F1代花药。
诱导培养基为N6+2，4-D2mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖10％；分化培养基为N6+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖3％：壮苗培养基为MS+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+多效唑3mg/L+蔗糖3％。
取穗时间以花粉单核中、晚期为最佳时期(即幼穗顶部距旗叶基部5～10cm，幼穗未露出旗叶鞘，花药长度在2～3mm)。取回的穗子用湿毛巾包裹，放入4℃的冰箱预处理2～3天。接种前，剪去旗叶(留叶鞘)，用75％的酒精消毒，并从叶鞘下端将幼穗取出，无菌接种。
试验分3种处理：
(1)对愈伤组织的处理。秋水仙碱的浓度为：O(CK)、0.02‰、0.05‰、0.1‰、0.3‰。处理温度分两种：一是愈伤组织在4℃低温下春化一个月后，转入含有秋水仙碱的脱分化培养基中，在25℃常温下培养20天后将绿芽(苗)转入壮苗培养基中(T1)，二是将愈伤组织转入含有秋水仙碱的脱分化培养基中，在4℃低温下培养30天左右，再在25％常温下培养15天(T2)，然后经1～2次壮苗后移栽温室，统计结实株数，计算结实株率。
(2)对再生苗根系的处理。将再生植株经过壮苗培养基培养后，分别用0.2％的秋水仙碱溶液浸根5小时(处理1)和10小时(处理2) (24～25℃)、0.05％的秋水仙碱溶液浸根5小时(处理3)和10小时(处理4)(24～25％)，处理后将苗移栽温室。统计结实株数，并计算结实株率。
(3)对分蘖节的处理。在分蘖盛期，将花粉植株从土中挖出，洗净根部的泥土，在24～25℃条件下，用0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节，分5小时和10小时两个处理，处理后重新移栽土中，统计结实株数，并计算结实株率。
结实株率(％)=结实株数/移栽绿苗数×100％
2结果与分析
2.1秋水仙碱对愈伤组织分化和加倍率的影响
由表1看出，无论在T1和T2处理中，0.02‰和0.05‰秋水仙碱浓度处理的愈伤组织再生植株结实率都明显高于对照和其它处理，最高结实率达61.5％。最低33.3％，T2处理与T1处理相比，T2处理的结实率又高于T1。但从绿苗分化率来看，0.02‰的绿苗分化率显著高于0.05‰的绿苗分化率，0.02‰的绿苗分化率比0.05‰的绿苗分化率高53.2～43.2个百分点。0.1‰和0.3‰秋水仙碱浓度处理的愈伤组织在25℃常温下培养10天后逐渐褐化，只有“晋麦47×975025”获得结实绿苗1株。
2.2秋水仙碱溶液浸根的浓度与时间对移栽成活率和加倍率的影响
秋水仙碱溶液浸根的浓度与时间对愈伤组织再生植株移栽成活率和加倍率有显著的影响。经过0.2％、0.05％浓度秋水仙碱5小时的浸根处理，“晋麦47×975025”花药愈伤组织再生壮苗移栽成活率分别为69.6％和86.7％，高于10小时的浸根处理38.9个百分点和49.9个百分点：“农大5013×临远993”花药愈伤组织再生壮苗移栽成活
率分别为66.7％和76.5％，高于10小时的浸根处理39.4个百分点和53.4个百分点。说明无论高浓度还是低浓度长时间用秋水仙碱溶液浸根对再生苗都有一定的危害，高浓度的危害程度更大。
用0.2％的秋水仙碱浸根处理5小时，2个杂种基因型结实株率平均高这37.5％，显著高于其它处理，说明用0.2％的秋水仙碱浸根处理5小时，是提高单倍体植株加倍率较为理想、有效的措施。
2.3秋水仙碱溶液浸泡分蘖节对加倍率的影响
从表3可以看出，无论用0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节5小时，还是10小时，其2个杂种基因型结实株率都高于用0.2％的秋水仙碱浸根处理5小时，0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节10小时，花粉植株加倍率可达50％以上，加倍效果比较稳定。但是，经过10小时处理的麦苗比经过5小时处理的麦苗缓苗时间延迟，植株发育不好。虽然5小时处理比10小时处理的结实株率低8.3％～8.4％，但5小时处理的麦苗缓苗时间短，植株的发育较好。因此，用0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节的时间应在5～10小时之间较为适宜。
3讨论
早在1979年，Wenzel等就根据当时科技发展情况提出了综合运用单倍体诱导技术、染色体加倍技术、细胞融合技术的“分解一综合育种”方案，而其中倍性操作是该方案的重要环节。到目前为止秋水仙素是诱导植物体细胞染色体加倍的最有效的化学诱变剂，通过该法诱导培育出的良种已在生产中使用。
在花药培养时利用秋水仙碱处理可增加双单倍体的数量。这在多种植物中得到证实，在小麦花药培养中也有许多报道。韩彬、陈孝等对硬粒小麦一簇毛麦的愈伤组织进行秋水仙碱处理，得到15.8％的结实率。王敬东，任贤等用0.2％的秋水仙碱浸根5小时，成活率为90.7％～100％，平均为94.2％；结实率的变化为7.7％～75.0％，平均为45.9％。鲍文奎等在小麦一黑麦杂种F1幼苗分蘖盛期用秋水仙碱溶液浸泡分蘖节，染色体加倍成功率为40.8％。
该试验证明，在小麦花药组织培养中，用0.02‰和0.05‰的秋水仙碱对愈伤组织(在时宜的条件下)进行染色体加倍处理可获得33.3％～61.5％结实株率，比用0.2‰秋水仙碱浸根法(15.4％～37.5％结实株率)更经济、简便，可达到快繁与加倍同时进行的目的。用0.04％的秋水仙碱加1％的二甲亚砜溶液浸泡分蘖节虽然能获得38.3％～58.3％的结实株率，加倍效果也比较稳定，但是，该方法需药剂量大，成本较高，而且移栽后，幼苗成活率会受到影响。
针对不同材料的差异性，秋水仙素作用的浓度、时间、温度、处理方法和材料部位等存在不同，有必要对秋水仙素诱导的关键技术因子进行研究。同时要对影响诱变效率的其它次要因素进行摸索，如预处理酸碱度，后处理手段等，这些方面人们往往忽视。所做工作和研究不多，有待加强。
参考文献：
1张玉玲，李德森，李宝森，等.小麦花粉植株染色体加倍和结实的研究，遗传，1984，6 (4)：6～8.
2隋新霞，樊庆琦，等.小麦花药培养研究进展[J].麦类作物学报，2005，24 (4)：127～131.
3景蕊莲，昌小平，等.用花药培养创建小麦加倍单倍体作图群体[J].1999，9 (3]：4～8.
4李浚明.植物组织培养教程.北京：中国农业出版社.108～109.
5韩彬，陈孝，徐惠君，等.硬粒小麦-簇毛麦双单倍体愈伤组织染色体加倍技术的研究[J].植物学报，1990，32(3)：191～197.
6郑永强，徐坤，等.秋水仙素在植物体细胞染色体加倍中的应用研究进展[J].中国农学通报，2003，19 (5)89～98.
7王敬东，任贤，等.春小麦花药单倍体植株染色体加倍技术初探[J].麦类作物学报，2005，25(2)：13～17.
8韩彬，陈孝，等.硬粒小麦-簇毛麦双单倍体愈伤组织染色体加倍技术的研究[J].植物学报，1990，32(3)：191～197.
9鲍文奎，严育瑞，等.禾谷类作物的多倍体育种方法研究-加倍小麦-黑麦杂种第一代染色体数的秋水仙碱技术[J].作物学报，1963，2(2)：161～176.
10彭尽晖，张良波，等.秋水仙索在植物倍性育种中的应用进展[J].湖南林业科技，2004，31(5)，22～25.