【摘 要】
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目的 构建表达小鼠KGFR基因的重组腺病毒.方法 提取小鼠肺组织RNA,RT-PCR获得cDNA后,PCR扩增目的 基因片段.将获得的KGFR基因插入载体质粒pShuttle-CMV,构建穿梭质粒pShuttle
【机 构】
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中国人民解放军总医院急救医学中心,北京,100853;中国人民解放军总后勤部管理保障局第二门诊部;天津天和医院
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目的 构建表达小鼠KGFR基因的重组腺病毒.方法 提取小鼠肺组织RNA,RT-PCR获得cDNA后,PCR扩增目的 基因片段.将获得的KGFR基因插入载体质粒pShuttle-CMV,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-KGFR(pKGFR).线性化pKGFR后,转化入含Adeasy-1病毒骨架的BJ5183细菌中.筛选正确的同源重组质粒pAdeasy-1-pShuttle-CMV-KGFR(pAd-KGFR),转染HEK293细胞,产生病毒颗粒Adeasy-1-pShuttle-CMV-KGFR(Ad-KGFR).进一步,大量扩增病毒,氯化铯梯度离心纯化,测量病毒滴度.结果 ①经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pKGFR构建成功;②限制性内切酶酶切,确定穿梭质粒重组于病毒骨架;显微镜下观察HEK293细胞形态,证实病毒包装复制成功;③病毒滴度2.25×1010PFU/ml,达到进一步体内、体外实验要求.结论 成功构建的重组腺病毒Ad-KGFR,为了解KGFR在肺部疾病中的作用,及进一步的基因治疗肺纤维化奠定基础.
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