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[摘要]目的：探讨细胞外信号调节激酶1／2(ERKl／2)及其活性形式磷酸化ERKl／2(p-ERKl／2)在血管瘤组织中的蛋白表达及其意义。方法：应用免疫组织化学sP法，检测2 3例增生期血管瘤组织及1 9例退化期血管瘤组织ERK1／2和p—ERK1／2的蛋白表达。结果：增生期血管瘤组织与退化期血管瘤组织ERKl／2的蛋白表达无统计学差异(z=-0.305，P>0.05)；增生期血管瘤组织p-ERKl／2的蛋白表达显著高于退化期血管瘤组织的表达(z=-4.271，P<0.01)结论：增生期血管瘤组织p-ERKl／2呈高表达，血管瘤的增生与ERK通路的激活有关。
[关键词]血管瘤；细胞外信号调节激酶；磷酸化细胞外信号调节激酶
[中图分类号]R732.2
[文献标识码]A
[文章编号]1008-6455(2012)07-1163-02
细胞外信号调节激酶
(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是介导和调控细胞外信号到细胞内反应的重要激酶。ERK主要有ERKl和ERK2两种亚型。ERKl和ERK2常被称为ERK1／2。磷酸化ERK1／2(phospho～ERR1／2，p-ERK1／2)是ERK的活性形式。ERK信号通路是与增殖相关的关键信号通路。婴幼儿血管瘤简称血管瘤，是婴幼儿时期最常见的良性肿瘤。增生期血管瘤的组织病理学特征为血管内皮细胞的过度增殖。有关血管瘤内皮细胞增生的机制目前尚不清楚。
由于增生期血管瘤存在内皮细胞的过度增殖，而ERK信号通路是与增殖相关的关键信号通路，据此推测增生期血管瘤可能存在ERK通路的激活；因此，有必要了解增生期血管瘤组织中ERK通路的活性状况。由于ERK是ERK信号通路下游的核心元件，因而可通过检测ERK的活性来了解ERK信号通路的状况。本研究采用免疫组织化学SP法检测增生期血管瘤组织和退化期血管瘤组织中ERK1／2及p-ERK1／2的蛋白表达，以探讨ERR1／2、p-ERK1／2及ERR通路在血管瘤发病中的作用。
1材料和方法
1.1诊断标准：参照Mulliken分类法，进行增生期血管瘤和退化期血管瘤的诊断。增生期血管瘤以条索状或团块状增生的内皮细胞为主，血管腔无或小，细胞间结缔组织少：退化期血管瘤以血管为主，血管腔增大，内皮细胞减少，血管间结缔组织增多。
1.2标本收集：选取2009年4月～2011年11月深圳市儿童医院手术切除的婴幼儿皮肤血管瘤石蜡包埋标本42例，其中增殖期血管瘤23例，退化期血管瘤19例。将增生期血管瘤设为实验组，将退化期血管瘤对照组。23例增殖期血管瘤中，男5例，女18例，年龄1月～8月(平均4.3月)；19例退化期血管瘤中，男4例，女14例，年龄3月～23月(平均12.1月)。两组病变均大多位于头颈、躯干部。
1.3主要试剂：兔抗p-ERK单克隆抗体(CST，#4377S)、兔抗ERK单克隆抗体(CST，#4695S)购自美国Cell signalingTechnology公司；免疫组化sP超敏试剂盒(KIT-5020，羊抗鼠／兔)和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物公司。1.4检测方法：石蜡切片脱蜡置水：于柠檬酸盐修复液中(0.01mM，pH6.0)，高压锅修复1.5～2.0min；滴加3％H1202，室温10min；滴加正常山羊血清封闭液，室温10～15min；滴加1：500稀释的兔抗ERK抗体、兔抗p-ERK抗体，空白对照用PBS代替一抗，置于湿盒内，4℃过夜；滴加复合二抗(HRP—Polymer Anti Ms／Rb IgG)，室温20 rain：DAB显色：苏木精复染；盐酸酒精分化；脱水；透明；封片。
1.5结果判断：每张切片随机选取5个高倍视野(×400)。按细胞染色深浅及显色细胞所占比例，进行结果判断。按细胞染色深浅计分：无染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；按显色细胞占细胞总数比例计分：<5％为O分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，>50％为3分。染色积分=(1)+(2)；染色强度按积分分级：0～1分为(一)，2分弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，>4分为强阳性(+++)。1.6统计学处理：运用SPSSl2.O软件，对实验数据进行Man-Whitney.U检验。
2结果
ERKl／2主要表达于胞浆，部分表达于胞核。p-ERKI／2主要表达于胞核，部分表达于胞浆。ERKl／2和p-ERKl／2在增生期血管瘤及退化期血管瘤中的细胞染色强度及显色细胞所占比例见表1。增生期血管瘤组织中ERKl／2的表达(图1)与退化期血管瘤组织中ERKl／2的表达(图2)相比较，无统计学差异(z=-0.305，P>0.05)。增生期血管瘤组织p-ERK1／2的表达(图3)与退化期血管瘤组织p-ERKl／2的表达(图4)相比较，差异有显著性意义(z=-4.271，P<0.01)。
3讨论
ERK是介导和调控细胞外信号到细胞内反应的重要激酶。ERK信号通路是与增殖相关的关键信号通路。ERK是ERK信号通路下游的核心元件。ERK正常定位于胞浆，当它被激活后转位至胞核。ERK的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键，只有p-ERK才具有活性。活化的ERK可以磷酸化c-FOS、c-JUN、NF-Kb等蛋白，维持细胞的正常生长、发育。ERK过度活化后，可通过影响cyclin、MITF及MMP等因子，促使细胞生长过度和分化不良，促进肿瘤的发生和发展。
目前尚无有关血管瘤组织ERRl／2的报道，而有关血管瘤组织p-ERKl／2的报道少见。ERKl／2蛋白包括磷酸化ERKl／2蛋白以及非磷酸化ERKl／2蛋白。本研究中，增生期血管瘤组织与退化期血管瘤组织ERKl／2的蛋白表达无差异，这说明血管瘤的增生可能与ERK蛋白表达水平无关系。本研究发现，与退化期血管瘤组织相比，增生期血管瘤组织p-ERKl／2呈高表达，这一结果与有关的报道_5’相一致；这说明血管瘤的增生与ERK的磷酸化水平有关，即血管瘤的增生与ERK的过度活化及ERK通路的激活有关。
ERK活化的大致路径为：胞外刺激一细胞表面受体一Ras→Raf→MEK→ERK。目前，已有一些关于ERK信号通路的胞外信号或受体在血管瘤中高表达的研究报道。例如，Takahashi等发现，血管内皮生长因子在增生期血管瘤内皮细胞内高表达；Ritter等发现，胰岛素样生长因子一2在血管瘤增生期高表达；Reggiani等认为，雌激素及其受体与血管瘤的发生和发展有关。因此，ERK的过度活化与多种可激活ERK信号通路的胞外信号及受体的高表达有关。
本研究发现血管瘤的增生与ERK的过度活化及ERK通路的激活有关；这一方面在细胞信号转导水平上阐述了血管瘤的一种发病机制，另一方面提示在治疗血管瘤时可选用作用于ERK通路尤其是ERK的抑制剂。
[关键词]血管瘤；细胞外信号调节激酶；磷酸化细胞外信号调节激酶
[中图分类号]R732.2
[文献标识码]A
[文章编号]1008-6455(2012)07-1163-02
细胞外信号调节激酶
(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是介导和调控细胞外信号到细胞内反应的重要激酶。ERK主要有ERKl和ERK2两种亚型。ERKl和ERK2常被称为ERK1／2。磷酸化ERK1／2(phospho～ERR1／2，p-ERK1／2)是ERK的活性形式。ERK信号通路是与增殖相关的关键信号通路。婴幼儿血管瘤简称血管瘤，是婴幼儿时期最常见的良性肿瘤。增生期血管瘤的组织病理学特征为血管内皮细胞的过度增殖。有关血管瘤内皮细胞增生的机制目前尚不清楚。
由于增生期血管瘤存在内皮细胞的过度增殖，而ERK信号通路是与增殖相关的关键信号通路，据此推测增生期血管瘤可能存在ERK通路的激活；因此，有必要了解增生期血管瘤组织中ERK通路的活性状况。由于ERK是ERK信号通路下游的核心元件，因而可通过检测ERK的活性来了解ERK信号通路的状况。本研究采用免疫组织化学SP法检测增生期血管瘤组织和退化期血管瘤组织中ERK1／2及p-ERK1／2的蛋白表达，以探讨ERR1／2、p-ERK1／2及ERR通路在血管瘤发病中的作用。
1材料和方法
1.1诊断标准：参照Mulliken分类法，进行增生期血管瘤和退化期血管瘤的诊断。增生期血管瘤以条索状或团块状增生的内皮细胞为主，血管腔无或小，细胞间结缔组织少：退化期血管瘤以血管为主，血管腔增大，内皮细胞减少，血管间结缔组织增多。
1.2标本收集：选取2009年4月～2011年11月深圳市儿童医院手术切除的婴幼儿皮肤血管瘤石蜡包埋标本42例，其中增殖期血管瘤23例，退化期血管瘤19例。将增生期血管瘤设为实验组，将退化期血管瘤对照组。23例增殖期血管瘤中，男5例，女18例，年龄1月～8月(平均4.3月)；19例退化期血管瘤中，男4例，女14例，年龄3月～23月(平均12.1月)。两组病变均大多位于头颈、躯干部。
1.3主要试剂：兔抗p-ERK单克隆抗体(CST，#4377S)、兔抗ERK单克隆抗体(CST，#4695S)购自美国Cell signalingTechnology公司；免疫组化sP超敏试剂盒(KIT-5020，羊抗鼠／兔)和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物公司。1.4检测方法：石蜡切片脱蜡置水：于柠檬酸盐修复液中(0.01mM，pH6.0)，高压锅修复1.5～2.0min；滴加3％H1202，室温10min；滴加正常山羊血清封闭液，室温10～15min；滴加1：500稀释的兔抗ERK抗体、兔抗p-ERK抗体，空白对照用PBS代替一抗，置于湿盒内，4℃过夜；滴加复合二抗(HRP—Polymer Anti Ms／Rb IgG)，室温20 rain：DAB显色：苏木精复染；盐酸酒精分化；脱水；透明；封片。
1.5结果判断：每张切片随机选取5个高倍视野(×400)。按细胞染色深浅及显色细胞所占比例，进行结果判断。按细胞染色深浅计分：无染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；按显色细胞占细胞总数比例计分：<5％为O分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，>50％为3分。染色积分=(1)+(2)；染色强度按积分分级：0～1分为(一)，2分弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，>4分为强阳性(+++)。1.6统计学处理：运用SPSSl2.O软件，对实验数据进行Man-Whitney.U检验。
2结果
ERKl／2主要表达于胞浆，部分表达于胞核。p-ERKI／2主要表达于胞核，部分表达于胞浆。ERKl／2和p-ERKl／2在增生期血管瘤及退化期血管瘤中的细胞染色强度及显色细胞所占比例见表1。增生期血管瘤组织中ERKl／2的表达(图1)与退化期血管瘤组织中ERKl／2的表达(图2)相比较，无统计学差异(z=-0.305，P>0.05)。增生期血管瘤组织p-ERK1／2的表达(图3)与退化期血管瘤组织p-ERKl／2的表达(图4)相比较，差异有显著性意义(z=-4.271，P<0.01)。
3讨论
ERK是介导和调控细胞外信号到细胞内反应的重要激酶。ERK信号通路是与增殖相关的关键信号通路。ERK是ERK信号通路下游的核心元件。ERK正常定位于胞浆，当它被激活后转位至胞核。ERK的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键，只有p-ERK才具有活性。活化的ERK可以磷酸化c-FOS、c-JUN、NF-Kb等蛋白，维持细胞的正常生长、发育。ERK过度活化后，可通过影响cyclin、MITF及MMP等因子，促使细胞生长过度和分化不良，促进肿瘤的发生和发展。
目前尚无有关血管瘤组织ERRl／2的报道，而有关血管瘤组织p-ERKl／2的报道少见。ERKl／2蛋白包括磷酸化ERKl／2蛋白以及非磷酸化ERKl／2蛋白。本研究中，增生期血管瘤组织与退化期血管瘤组织ERKl／2的蛋白表达无差异，这说明血管瘤的增生可能与ERK蛋白表达水平无关系。本研究发现，与退化期血管瘤组织相比，增生期血管瘤组织p-ERKl／2呈高表达，这一结果与有关的报道_5’相一致；这说明血管瘤的增生与ERK的磷酸化水平有关，即血管瘤的增生与ERK的过度活化及ERK通路的激活有关。
ERK活化的大致路径为：胞外刺激一细胞表面受体一Ras→Raf→MEK→ERK。目前，已有一些关于ERK信号通路的胞外信号或受体在血管瘤中高表达的研究报道。例如，Takahashi等发现，血管内皮生长因子在增生期血管瘤内皮细胞内高表达；Ritter等发现，胰岛素样生长因子一2在血管瘤增生期高表达；Reggiani等认为，雌激素及其受体与血管瘤的发生和发展有关。因此，ERK的过度活化与多种可激活ERK信号通路的胞外信号及受体的高表达有关。
本研究发现血管瘤的增生与ERK的过度活化及ERK通路的激活有关；这一方面在细胞信号转导水平上阐述了血管瘤的一种发病机制，另一方面提示在治疗血管瘤时可选用作用于ERK通路尤其是ERK的抑制剂。