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摘要：类受体蛋白激酶（receptor-like protein kinases， RLKs）作为重要的信号分子受体，在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。RLKs主要通过胞内的激酶区磷酸化其底物蛋白来发挥作用，因此鉴定RLKs的底物蛋白对于其功能的研究至关重要。本研究利用酵母双杂交系统对FTPK1的互作蛋白进行筛选，初步确定了两个候选蛋白，为进一步研究该激酶的功能奠定了基础。
关键词：水稻;类受体蛋白激酶;FTPK1;酵母双杂交系统;互作蛋白
中图分类号：S511.03 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）01-0001-07
Screening of Interacting Proteins of Rice
Receptor-Like Kinase FTPK1 by Yeast Two-Hybrid System
Li Yingxiu Pan Jiaowen Li Zhen Wang Qingguo Liu Wei
（1. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial
Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China;
2.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014，China）
Abstract Plant receptor-like kinases （RLKs） acting as signal receptors play key roles in plant growth and development. As RLKs execute functions by phosphorylation of downstream targets， identification of targets for RLKs is critical for kinase function identification and analysis. In this study， the yeast two-hybrid system was used to screen interacting proteins of FTPK1， and two candidate interacting proteins were preliminarily identified. This research would lay the foundation for further study of the FTPK1 function.
Keywords Rice; Receptor-like kinase （RLKs）; FTPK1; Yeast two-hybrid system; Interacting protein
類受体蛋白激酶（receptor-like kinases， RLKs）是一类普遍存在于高等植物中的蛋白激酶，作为信号分子的受体参与胞内信号转导，在植物生长发育过程中起着重要作用。近年来该领域的研究受到国内外的广泛关注。典型的RLK包括胞外能够识别并结合配体的受体区、跨膜区和胞内保守的激酶区，当配基结合到胞外受体区后激活胞内的激酶区，启动信号转导，调控植物的生长发育和抗性反应[1，2]。
1990年在玉米中首次克隆到RLK，至今已在20多种植物中鉴定到类受体蛋白激酶，它是目前鉴定到的最大蛋白激酶家族之一。在水稻中鉴定到其1 131个成员，在拟南芥中鉴定到610个成员。根据胞外受体区的结构特点至少可将RLK分为21个亚家族，包括富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats， LRRs）LRR-RLKs 亚型、与细胞壁相联的蛋白激酶（wall-associated receptor kinases， WAKs）WAK-RLKs 亚型、S-结构域（S-domain， S）受体蛋白激酶S-RLKs和富含半胱氨酸（cysteine-rich repeat， CRR）的CRR-RLKs亚型等[3]。
虽然RLK广泛参与植物信号转导，但只有少部分RLK的功能被报道。在拟南芥中有35%的LRR-RLKs有功能报道[3]，水稻中有功能报道的不到10%。近几年在其它作物（如大豆、小麦、谷子等）以及杨树不同亚家族的RLKs也被鉴定出来[4-8]。RLKs主要通过胞内的激酶区磷酸化其底物蛋白来发挥作用，如GUDK（GROWTH UNDER DROUGHT KINASE）磷酸化并激活转录因子OsAP37介导干旱胁迫信号转导，激活后的OsAP37转录激活胁迫响应基因的表达来增强抗旱性和水稻产量[9]。对拟南芥的研究发现LRR-RLK SIRK1能够磷酸化并激活水孔蛋白PIP2F，从而参与调控蔗糖特异的渗透响应[10]。冷胁迫激活类受体胞质蛋白激酶CRPK1 （cold-responsive protein kinase 1），能够磷酸化14-3-3蛋白，磷酸化的14-3-3蛋白由胞质转移到胞内，与CBF1和CBF3蛋白互作促进其降解，从而精细地调控冷胁迫响应[11]。Lectin RLKs、SIT1（salt intolerance 1）介导盐胁迫信号转导，SIT1通过激活MPK3/MPK6促进乙烯和ROS的积累，最终导致氧化胁迫和生长抑制。因此筛选并鉴定RLKs底物互作蛋白，对于研究其功能至关重要[12]。 前期研究发现水稻S-型RLK FTPK1 可能参与水稻穗发育。为进一步解析该蛋白的功能，本研究利用膜系统酵母双杂交（DUAL membrane starter kits）对FTPK1进行互作蛋白的筛选鉴定，以期为下一步激酶功能的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试植物材料为水稻品种中花11，种植于山东省农业科学院饮马泉农场。
酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）NMY51菌株、pPR3-N Prey Vector、pBT3-SUC Bait Vector、pBT3-N Bait Vector、pBT3-STE Bait Vector、pTSU2-APP Positive Control Bait Vector、pNubG-Fe65 Control Prey Vector、pOst1-NubI Control Prey Vector质粒均购自上海欧易生物医学科技有限公司。
Yeastmaker Yeast Transformation System 2、YPDA Broth、Minimal SD Base、Bacto Agar、OD Supplement-leu、OD Supplement -leu/-trp、OD Supplement-leu/-trp/-his 、OD Supplement-leu/-trp/-his/-ade均购自Clotech公司（美国）;TransStart Fast-Pfu DNA Polymerase试剂盒、pEASY-Blunt3 Cloning Kit试剂盒、2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K Plus DNA Marker均购于Transgen 公司（济南雨同生物科技有限公司）;内切酶 Sfi Ⅰ购自BioLabs;T4 DNA Ligase购自 Thermo。
1.2 cDNA文库的构建及其保存
选取水稻中花11幼苗期的根、茎、叶;抽穗前、中、后期的幼穗及灌浆前、后期的穗作为材料，委托青岛欧易公司提取RNA并构建cDNA文库。将构建好的cDNA文库，保存于-80℃冰箱备用。
1.3 诱饵载体的构建
使用Primer Premier 5设计引物（表1）。扩增FTPK1，经测序正确后，利用 Sfi Ⅰ酶切与不同的诱饵载体连接，构建FTPK1诱饵载体pBT3- N- FTPK1、pBT3-STE-FTPK1、pBT3-SMC-FTPK1。
1.4 自激活检测及功能验证
以质粒pTSU2-APP Positive Control Bait Vector和pPR3-N Prey Vector为阴性对照，质粒pTSU2-APP Positive Control Bait Vector和pNubG-Fe65 Control Prey Vector为阳性对照。
将NMY51酵母菌种在YPDA平板上划线，30℃倒置培养3天，直到克隆大小为2～3 mm;挑取几个酵母克隆于50 mL的YPDA培养基中;在30℃摇床230～250 r/min振荡培养过夜;测定培养菌液OD 546 值达到0.6～0.8时2 500×g离心5 min，收集菌体;倒去上清并用2.5 mL无菌水重悬菌体。
将3个FTPK1诱耳载体分别按照表2构建反应体系，每个反应管加 300 μL PEG/LiOAc-Ⅰ（表3），轻轻斡旋混匀;每个反应管加100 μL重悬细胞，斡旋1 min至各组分充分混匀;42℃ 水浴孵育45 min;700×g离心5 min;弃掉上清，用 0.9% NaCl溶液150 μL重悬菌体。
1.5 筛选条件的选择
诱饵如果存在自激活现象，则需要进行筛选条件选择，将FTPK1诱饵载体和空质粒 pPR3-N Prey Vector通过醋酸锂法转化到表达诱饵质粒的酵母菌中，分別涂布于含不同浓度 3-AT （1、2.5、5、7.5、10 mmol/L）的SD-leu/-trp/-his（三缺）、SD-leu/-trp/-his/-ade（四缺）培养基中，观察酵母菌的生长情况。
1.6 膜体系酵母双杂交文库筛选
将经过功能验证符合要求的表达诱饵蛋白的NMY51酵母菌转化后（转化方法见1.4）涂布在SD-leu平板上，30℃倒置培养3天左右，直到克隆大小为2～3 mm;挑取新鲜的表达诱饵蛋白的酵母菌置于10 mL SD-leu培养液中，30℃、220 r/min摇床培养8 h;将摇好的菌液接入100 mL的SD-leu液体培养基中，30℃、220 r/min过夜;取3 mL过夜培养的菌液加入离心管，2 500× g离心5 min，将沉淀重悬于3 mL水中;室温 700× g离心5 min 以收集菌体;以水为空白对照，测量样品的OD 546 值。以30 个OD 546 单位计算菌液的数量，将这种数量级的过夜菌液置于50 mL离心管中;700× g 离心5 min;用10 mL 30℃预热的2×YPDA培养基重悬沉淀，然后转移到1 L锥形摇瓶中;用40 mL 30℃预热的2×YPDA培养基冲洗离心管后转移到1 L锥形瓶中;再加150 mL 30℃预热的2×YPDA培养基到锥形摇瓶中，确保最终菌液OD 546 值为 0.15; 30℃，220 r/min培养至OD 546 值达到0.6～0.7，可能需要3～5 h，此时细胞经历两次分裂，转化效率达到最优。 准备single-strand carrier DNA，99℃变性5 min，冰上2 min，重复一次。
将200 mL菌液分装到4个离心管中，每管50 mL，700×g离心5 min;倒去上清，每管用30 mL无菌水重悬，700×g离心5 min;倒去上清，每管用1 mL LiOAc/TE溶液（表5）重悬，并转到 1.5 mL离心管中，700×g离心5 min;每管加入600 μL LiOAc/TE溶液（表5）吹打均匀，备用。
准备4个15 mL离心管，按照表6构建反应体系。斡旋1 min，至所有组分充分混匀;30℃水浴45 min，每15 min摇菌一次;加入160 μL DMSO，轻轻摇匀;42℃水浴热激20 min，每10 min上下颠倒混匀一次;700×g离心5 min;加入3 mL 2× YPDA，30℃、150 r/min复苏培养90 min; 700× g离心5 min，收集菌体;每管加入0.9% NaCl悬浮菌体，终体积4.8 mL左右。
其余菌液涂布于含有20 mg/L X-gal的筛选平板上，每个平板300 μL，每管涂16块;30℃，恒温培养箱培养3～5天，至有克隆生长。
1.7 LacZ基因表达检测
将阳性克隆菌落影印于滤纸上。将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30 s，取出后晾干。培养皿加入适量显色液（Z buffer/X-gal solution新鲜配制），垫一层滤纸，让其完全浸润，将冻溶后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9 cm培养皿加2 mL显色液，15 cm培养皿加5 mL显色液。盖上皿盖，避光放于37℃培养箱中。20 min后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3 h为准，特殊情况下可观察过夜是否变蓝。反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。
1.8 阳性克隆酵母质粒的抽提
准备灭菌的1.5 mL EP管，每個管中加入35 μL灭菌超纯水，取单克隆菌落分别混合于水中;65℃ 水浴5 min后液氮冷冻30 s，反复冻融5次;12 000 r/min离心2 min，吸取约35 μL上清至新EP管中;上清即为酵母质粒，可直接用于下一步菌落PCR模板。
1.9 酵母质粒PCR检测及测序
以所提取的质粒为模板，用文库载体通用引物S1：5′-GTCGAAAATTCAAGACAAGG-3′、A1：5′-GTAATTAGTTATGTCACGCTT-3′，对所提取的酵母质粒进行PCR鉴定，将条带长度大于750 bp的扩增产物送到青岛擎科公司进行测序。测序结果经NCBI数据库中检索比对，获得候选基因的序列全长及预测功能。
1.10 酵母质粒的扩增
将抽提的酵母质粒转化DH5α感受态细胞后，挑取单克隆培养过夜，利用质粒抽提试剂盒提取质粒。
1.11 Prey质粒与Bait质粒一对一互作验证
将诱饵质粒和筛选出的文库质粒共同转化NMY51酵母菌株，涂布在SD-leu/-trp平板和含有20 mg/L X-gal的筛选平板上，30℃培养4天左右。观察菌株生长情况，若菌落在含X-gal的筛选平板上正常生长并且变蓝说明诱饵与猎物蛋白能够在酵母菌中发生互作。
2 结果与分析
2.1 诱饵载体的构建
将测序正确的FTPK1，经 Sfi Ⅰ酶切分别连接诱饵载体质粒pBT3-N、pBT3-STE、pBT3-SUC，菌落PCR验证正确后，提取质粒进一步进行酶切鉴定（图1），大小都正确，即为pBT3-N-FTPK1、pBT3-STE-FTPK1、pBT3-SUC-FTPK1重组质粒，将正确质粒放于-20℃保存备用。
2.2 自激活检测及功能验证
将目的重组质粒转化酵母菌株后，均匀涂布于不同筛选培养基上。2天后观察菌落生长情况发现，含有pBT3-N-FTPK1和pOst1-NubI质粒的酵母菌株在三缺和四缺培养基上没有生长，说明该诱饵载体不能进行下一步试验;而含有pBT3-STE-FTPK1和pOst1-NubI、pBT3-SUC-FTPK1和pOstl-NubI质粒的菌株在三缺和四缺培养基上均有菌落长出，说明诱饵在酵母菌中能正常表达，并且具有功能，可以进行下一步试验。
2.3 筛选条件的选择
将重组质粒转化酵母菌株后涂布于含不同浓度3-AT 的SD-leu/-trp/-his（三缺）、SD-leu/-trp/-his/-ade（四缺）固体筛选培养基上，统计酵母菌的生长情况。试验结果如表7所示，pBT3-SUC-FTPK1在三缺培养基上的的活性比pBT3-STE-FTPK1高，所以拟选用pBT3-SUC-FTPK1进行文库筛选;而pBT3-SUC- FTPK1 在3-AT浓度不同的三缺板上几乎都有酵母菌生长，所以选用不含3-AT的四缺培养基进行文库筛选。
M：Trans2K Plus DNA Marker，下同;1：FTPK1加酶切位点后酶切;2：pBT3-N载体质粒酶切;3：pBT3-N质粒未酶切对照;4：pBT3-N-FTPK1连接后酶切鉴定;5：FTPK1加酶切位点后酶切;6：pBT3- STE载体质粒酶切;7：pBT3- STE质粒未酶切对照;8：pBT3- STE-FTPK1连接后酶切鉴定;9：FTPK1加酶切位点后酶切;10：pBT3- SUC载体质粒酶切;11：pBT3- SUC质粒未酶切对照;12：pBT3- SUC-FTPK1连接后酶切鉴定。 2.4 cDNA文庫筛选结果
进行筛库反应4天后，四缺培养基上的酵母菌落数共有167个，将每个菌落划线于新的四缺固体培养基上培养。生长2天后将每个菌落影印于滤纸上进行LacZ染色，结果（图2）显示，除82号菌落以外均变蓝，共计166个，对其进行质粒提取并保存。
2.5 文库筛选单克隆菌落质粒的提取、菌落PCR及序列比对
利用酵母文库质粒上的通用引物对所提质粒进行菌落PCR，选择条带大小在1 000 bp以上的PCR产物进行测序（图3），测序结果在NCBI中进行Blast，检索得到对应的基因，并记录其预测功能。
PCR产物的测序结果中，有若干重复序列，忽略不计重复的结果，在NCBI上进行序列比对，查找基因全长，共得到17个基因。基因的NCBI登录号及预测功能如表8所示。
2.6 利用酵母双杂交系统重新验证FTPK1与候选互作蛋白的互作
根据筛选结果，我们选取2个候选蛋白b5、SNARE，与诱饵蛋白FTPK1重新转化酵母菌株，在含有X-gal的四缺培养基上进一步验证。如图4 A所示，FTPK1与b5共转酵母菌株在含有 X- gal的四缺培养基上正常生长并且变蓝，说明可能发生互作，还需要其它体内和体外试验做进一步验证。图4 B是阳性对照和阴性对照质粒转化酵母后的培养结果。
3 讨论与结论
利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白是研究蛋白互作的经典传统技术，能够利用酵母cDNA文库筛选诱导蛋白的互作蛋白，但也存在很多弊端，如假阳性率比较高，有些蛋白翻译后需要后期的加工修饰，在酵母系统中常常形成错误的构象而影响筛选结果，后期需要利用其它技术来进行验证[13]。膜系统酵母双杂交（DUAL membrane starter kits）是将泛素分为两部分表达，即其N端部分（NubI）和C端部分（Cub），后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白（[NubI∶Cub]-reporter）体系。该系统能够利用膜蛋白作为诱饵在细胞膜上原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号。类受体蛋白激酶作为一种膜定位的蛋白激酶主要通过磷酸化下游底物来发挥作用。本研究利用膜系统酵母双杂交技术，初步筛选得到17个与FTPK1可能互作的候选蛋白，从中挑选2个与发育相关的基因，重新转化酵母做进一步的验证，发现FTPK1可能与b5和SNARE蛋白发生互作。由于酵母双杂交结果假阳性率较高。下一步我们将会结合其它体内、体外互作试验，如双分子荧光互补试验、pulldown技术、Co-IP等，对候选蛋白进一步验证。
另外，根据近两年的报道，利用磷酸蛋白质组学分析来寻找RLK下游的底物蛋白也受到越来越多的关注[9，14]。该方法主要是通过获得目的RLK的突变体，然后进行磷酸化组学分析，根据差异的磷酸化底物蛋白来确定候选底物蛋白。我们目前也正在利用Crisp-Cas9系统来敲除FTPK1基因，希望通过磷酸化蛋白质组学分析结合酵母双杂交试验进一步确定该蛋白的候选互作蛋白。
本试验结果为进一步研究FTPK1的功能及探究FTPK1的下游信号调控通路奠定了基础。
参 考 文 献：
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关键词：水稻;类受体蛋白激酶;FTPK1;酵母双杂交系统;互作蛋白
中图分类号：S511.03 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）01-0001-07
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Abstract Plant receptor-like kinases （RLKs） acting as signal receptors play key roles in plant growth and development. As RLKs execute functions by phosphorylation of downstream targets， identification of targets for RLKs is critical for kinase function identification and analysis. In this study， the yeast two-hybrid system was used to screen interacting proteins of FTPK1， and two candidate interacting proteins were preliminarily identified. This research would lay the foundation for further study of the FTPK1 function.
Keywords Rice; Receptor-like kinase （RLKs）; FTPK1; Yeast two-hybrid system; Interacting protein
類受体蛋白激酶（receptor-like kinases， RLKs）是一类普遍存在于高等植物中的蛋白激酶，作为信号分子的受体参与胞内信号转导，在植物生长发育过程中起着重要作用。近年来该领域的研究受到国内外的广泛关注。典型的RLK包括胞外能够识别并结合配体的受体区、跨膜区和胞内保守的激酶区，当配基结合到胞外受体区后激活胞内的激酶区，启动信号转导，调控植物的生长发育和抗性反应[1，2]。
1990年在玉米中首次克隆到RLK，至今已在20多种植物中鉴定到类受体蛋白激酶，它是目前鉴定到的最大蛋白激酶家族之一。在水稻中鉴定到其1 131个成员，在拟南芥中鉴定到610个成员。根据胞外受体区的结构特点至少可将RLK分为21个亚家族，包括富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats， LRRs）LRR-RLKs 亚型、与细胞壁相联的蛋白激酶（wall-associated receptor kinases， WAKs）WAK-RLKs 亚型、S-结构域（S-domain， S）受体蛋白激酶S-RLKs和富含半胱氨酸（cysteine-rich repeat， CRR）的CRR-RLKs亚型等[3]。
虽然RLK广泛参与植物信号转导，但只有少部分RLK的功能被报道。在拟南芥中有35%的LRR-RLKs有功能报道[3]，水稻中有功能报道的不到10%。近几年在其它作物（如大豆、小麦、谷子等）以及杨树不同亚家族的RLKs也被鉴定出来[4-8]。RLKs主要通过胞内的激酶区磷酸化其底物蛋白来发挥作用，如GUDK（GROWTH UNDER DROUGHT KINASE）磷酸化并激活转录因子OsAP37介导干旱胁迫信号转导，激活后的OsAP37转录激活胁迫响应基因的表达来增强抗旱性和水稻产量[9]。对拟南芥的研究发现LRR-RLK SIRK1能够磷酸化并激活水孔蛋白PIP2F，从而参与调控蔗糖特异的渗透响应[10]。冷胁迫激活类受体胞质蛋白激酶CRPK1 （cold-responsive protein kinase 1），能够磷酸化14-3-3蛋白，磷酸化的14-3-3蛋白由胞质转移到胞内，与CBF1和CBF3蛋白互作促进其降解，从而精细地调控冷胁迫响应[11]。Lectin RLKs、SIT1（salt intolerance 1）介导盐胁迫信号转导，SIT1通过激活MPK3/MPK6促进乙烯和ROS的积累，最终导致氧化胁迫和生长抑制。因此筛选并鉴定RLKs底物互作蛋白，对于研究其功能至关重要[12]。 前期研究发现水稻S-型RLK FTPK1 可能参与水稻穗发育。为进一步解析该蛋白的功能，本研究利用膜系统酵母双杂交（DUAL membrane starter kits）对FTPK1进行互作蛋白的筛选鉴定，以期为下一步激酶功能的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试植物材料为水稻品种中花11，种植于山东省农业科学院饮马泉农场。
酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）NMY51菌株、pPR3-N Prey Vector、pBT3-SUC Bait Vector、pBT3-N Bait Vector、pBT3-STE Bait Vector、pTSU2-APP Positive Control Bait Vector、pNubG-Fe65 Control Prey Vector、pOst1-NubI Control Prey Vector质粒均购自上海欧易生物医学科技有限公司。
Yeastmaker Yeast Transformation System 2、YPDA Broth、Minimal SD Base、Bacto Agar、OD Supplement-leu、OD Supplement -leu/-trp、OD Supplement-leu/-trp/-his 、OD Supplement-leu/-trp/-his/-ade均购自Clotech公司（美国）;TransStart Fast-Pfu DNA Polymerase试剂盒、pEASY-Blunt3 Cloning Kit试剂盒、2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K Plus DNA Marker均购于Transgen 公司（济南雨同生物科技有限公司）;内切酶 Sfi Ⅰ购自BioLabs;T4 DNA Ligase购自 Thermo。
1.2 cDNA文库的构建及其保存
选取水稻中花11幼苗期的根、茎、叶;抽穗前、中、后期的幼穗及灌浆前、后期的穗作为材料，委托青岛欧易公司提取RNA并构建cDNA文库。将构建好的cDNA文库，保存于-80℃冰箱备用。
1.3 诱饵载体的构建
使用Primer Premier 5设计引物（表1）。扩增FTPK1，经测序正确后，利用 Sfi Ⅰ酶切与不同的诱饵载体连接，构建FTPK1诱饵载体pBT3- N- FTPK1、pBT3-STE-FTPK1、pBT3-SMC-FTPK1。
1.4 自激活检测及功能验证
以质粒pTSU2-APP Positive Control Bait Vector和pPR3-N Prey Vector为阴性对照，质粒pTSU2-APP Positive Control Bait Vector和pNubG-Fe65 Control Prey Vector为阳性对照。
将NMY51酵母菌种在YPDA平板上划线，30℃倒置培养3天，直到克隆大小为2～3 mm;挑取几个酵母克隆于50 mL的YPDA培养基中;在30℃摇床230～250 r/min振荡培养过夜;测定培养菌液OD 546 值达到0.6～0.8时2 500×g离心5 min，收集菌体;倒去上清并用2.5 mL无菌水重悬菌体。
将3个FTPK1诱耳载体分别按照表2构建反应体系，每个反应管加 300 μL PEG/LiOAc-Ⅰ（表3），轻轻斡旋混匀;每个反应管加100 μL重悬细胞，斡旋1 min至各组分充分混匀;42℃ 水浴孵育45 min;700×g离心5 min;弃掉上清，用 0.9% NaCl溶液150 μL重悬菌体。
1.5 筛选条件的选择
诱饵如果存在自激活现象，则需要进行筛选条件选择，将FTPK1诱饵载体和空质粒 pPR3-N Prey Vector通过醋酸锂法转化到表达诱饵质粒的酵母菌中，分別涂布于含不同浓度 3-AT （1、2.5、5、7.5、10 mmol/L）的SD-leu/-trp/-his（三缺）、SD-leu/-trp/-his/-ade（四缺）培养基中，观察酵母菌的生长情况。
1.6 膜体系酵母双杂交文库筛选
将经过功能验证符合要求的表达诱饵蛋白的NMY51酵母菌转化后（转化方法见1.4）涂布在SD-leu平板上，30℃倒置培养3天左右，直到克隆大小为2～3 mm;挑取新鲜的表达诱饵蛋白的酵母菌置于10 mL SD-leu培养液中，30℃、220 r/min摇床培养8 h;将摇好的菌液接入100 mL的SD-leu液体培养基中，30℃、220 r/min过夜;取3 mL过夜培养的菌液加入离心管，2 500× g离心5 min，将沉淀重悬于3 mL水中;室温 700× g离心5 min 以收集菌体;以水为空白对照，测量样品的OD 546 值。以30 个OD 546 单位计算菌液的数量，将这种数量级的过夜菌液置于50 mL离心管中;700× g 离心5 min;用10 mL 30℃预热的2×YPDA培养基重悬沉淀，然后转移到1 L锥形摇瓶中;用40 mL 30℃预热的2×YPDA培养基冲洗离心管后转移到1 L锥形瓶中;再加150 mL 30℃预热的2×YPDA培养基到锥形摇瓶中，确保最终菌液OD 546 值为 0.15; 30℃，220 r/min培养至OD 546 值达到0.6～0.7，可能需要3～5 h，此时细胞经历两次分裂，转化效率达到最优。 准备single-strand carrier DNA，99℃变性5 min，冰上2 min，重复一次。
将200 mL菌液分装到4个离心管中，每管50 mL，700×g离心5 min;倒去上清，每管用30 mL无菌水重悬，700×g离心5 min;倒去上清，每管用1 mL LiOAc/TE溶液（表5）重悬，并转到 1.5 mL离心管中，700×g离心5 min;每管加入600 μL LiOAc/TE溶液（表5）吹打均匀，备用。
准备4个15 mL离心管，按照表6构建反应体系。斡旋1 min，至所有组分充分混匀;30℃水浴45 min，每15 min摇菌一次;加入160 μL DMSO，轻轻摇匀;42℃水浴热激20 min，每10 min上下颠倒混匀一次;700×g离心5 min;加入3 mL 2× YPDA，30℃、150 r/min复苏培养90 min; 700× g离心5 min，收集菌体;每管加入0.9% NaCl悬浮菌体，终体积4.8 mL左右。
其余菌液涂布于含有20 mg/L X-gal的筛选平板上，每个平板300 μL，每管涂16块;30℃，恒温培养箱培养3～5天，至有克隆生长。
1.7 LacZ基因表达检测
将阳性克隆菌落影印于滤纸上。将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30 s，取出后晾干。培养皿加入适量显色液（Z buffer/X-gal solution新鲜配制），垫一层滤纸，让其完全浸润，将冻溶后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9 cm培养皿加2 mL显色液，15 cm培养皿加5 mL显色液。盖上皿盖，避光放于37℃培养箱中。20 min后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3 h为准，特殊情况下可观察过夜是否变蓝。反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。
1.8 阳性克隆酵母质粒的抽提
准备灭菌的1.5 mL EP管，每個管中加入35 μL灭菌超纯水，取单克隆菌落分别混合于水中;65℃ 水浴5 min后液氮冷冻30 s，反复冻融5次;12 000 r/min离心2 min，吸取约35 μL上清至新EP管中;上清即为酵母质粒，可直接用于下一步菌落PCR模板。
1.9 酵母质粒PCR检测及测序
以所提取的质粒为模板，用文库载体通用引物S1：5′-GTCGAAAATTCAAGACAAGG-3′、A1：5′-GTAATTAGTTATGTCACGCTT-3′，对所提取的酵母质粒进行PCR鉴定，将条带长度大于750 bp的扩增产物送到青岛擎科公司进行测序。测序结果经NCBI数据库中检索比对，获得候选基因的序列全长及预测功能。
1.10 酵母质粒的扩增
将抽提的酵母质粒转化DH5α感受态细胞后，挑取单克隆培养过夜，利用质粒抽提试剂盒提取质粒。
1.11 Prey质粒与Bait质粒一对一互作验证
将诱饵质粒和筛选出的文库质粒共同转化NMY51酵母菌株，涂布在SD-leu/-trp平板和含有20 mg/L X-gal的筛选平板上，30℃培养4天左右。观察菌株生长情况，若菌落在含X-gal的筛选平板上正常生长并且变蓝说明诱饵与猎物蛋白能够在酵母菌中发生互作。
2 结果与分析
2.1 诱饵载体的构建
将测序正确的FTPK1，经 Sfi Ⅰ酶切分别连接诱饵载体质粒pBT3-N、pBT3-STE、pBT3-SUC，菌落PCR验证正确后，提取质粒进一步进行酶切鉴定（图1），大小都正确，即为pBT3-N-FTPK1、pBT3-STE-FTPK1、pBT3-SUC-FTPK1重组质粒，将正确质粒放于-20℃保存备用。
2.2 自激活检测及功能验证
将目的重组质粒转化酵母菌株后，均匀涂布于不同筛选培养基上。2天后观察菌落生长情况发现，含有pBT3-N-FTPK1和pOst1-NubI质粒的酵母菌株在三缺和四缺培养基上没有生长，说明该诱饵载体不能进行下一步试验;而含有pBT3-STE-FTPK1和pOst1-NubI、pBT3-SUC-FTPK1和pOstl-NubI质粒的菌株在三缺和四缺培养基上均有菌落长出，说明诱饵在酵母菌中能正常表达，并且具有功能，可以进行下一步试验。
2.3 筛选条件的选择
将重组质粒转化酵母菌株后涂布于含不同浓度3-AT 的SD-leu/-trp/-his（三缺）、SD-leu/-trp/-his/-ade（四缺）固体筛选培养基上，统计酵母菌的生长情况。试验结果如表7所示，pBT3-SUC-FTPK1在三缺培养基上的的活性比pBT3-STE-FTPK1高，所以拟选用pBT3-SUC-FTPK1进行文库筛选;而pBT3-SUC- FTPK1 在3-AT浓度不同的三缺板上几乎都有酵母菌生长，所以选用不含3-AT的四缺培养基进行文库筛选。
M：Trans2K Plus DNA Marker，下同;1：FTPK1加酶切位点后酶切;2：pBT3-N载体质粒酶切;3：pBT3-N质粒未酶切对照;4：pBT3-N-FTPK1连接后酶切鉴定;5：FTPK1加酶切位点后酶切;6：pBT3- STE载体质粒酶切;7：pBT3- STE质粒未酶切对照;8：pBT3- STE-FTPK1连接后酶切鉴定;9：FTPK1加酶切位点后酶切;10：pBT3- SUC载体质粒酶切;11：pBT3- SUC质粒未酶切对照;12：pBT3- SUC-FTPK1连接后酶切鉴定。 2.4 cDNA文庫筛选结果
进行筛库反应4天后，四缺培养基上的酵母菌落数共有167个，将每个菌落划线于新的四缺固体培养基上培养。生长2天后将每个菌落影印于滤纸上进行LacZ染色，结果（图2）显示，除82号菌落以外均变蓝，共计166个，对其进行质粒提取并保存。
2.5 文库筛选单克隆菌落质粒的提取、菌落PCR及序列比对
利用酵母文库质粒上的通用引物对所提质粒进行菌落PCR，选择条带大小在1 000 bp以上的PCR产物进行测序（图3），测序结果在NCBI中进行Blast，检索得到对应的基因，并记录其预测功能。
PCR产物的测序结果中，有若干重复序列，忽略不计重复的结果，在NCBI上进行序列比对，查找基因全长，共得到17个基因。基因的NCBI登录号及预测功能如表8所示。
2.6 利用酵母双杂交系统重新验证FTPK1与候选互作蛋白的互作
根据筛选结果，我们选取2个候选蛋白b5、SNARE，与诱饵蛋白FTPK1重新转化酵母菌株，在含有X-gal的四缺培养基上进一步验证。如图4 A所示，FTPK1与b5共转酵母菌株在含有 X- gal的四缺培养基上正常生长并且变蓝，说明可能发生互作，还需要其它体内和体外试验做进一步验证。图4 B是阳性对照和阴性对照质粒转化酵母后的培养结果。
3 讨论与结论
利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白是研究蛋白互作的经典传统技术，能够利用酵母cDNA文库筛选诱导蛋白的互作蛋白，但也存在很多弊端，如假阳性率比较高，有些蛋白翻译后需要后期的加工修饰，在酵母系统中常常形成错误的构象而影响筛选结果，后期需要利用其它技术来进行验证[13]。膜系统酵母双杂交（DUAL membrane starter kits）是将泛素分为两部分表达，即其N端部分（NubI）和C端部分（Cub），后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白（[NubI∶Cub]-reporter）体系。该系统能够利用膜蛋白作为诱饵在细胞膜上原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号。类受体蛋白激酶作为一种膜定位的蛋白激酶主要通过磷酸化下游底物来发挥作用。本研究利用膜系统酵母双杂交技术，初步筛选得到17个与FTPK1可能互作的候选蛋白，从中挑选2个与发育相关的基因，重新转化酵母做进一步的验证，发现FTPK1可能与b5和SNARE蛋白发生互作。由于酵母双杂交结果假阳性率较高。下一步我们将会结合其它体内、体外互作试验，如双分子荧光互补试验、pulldown技术、Co-IP等，对候选蛋白进一步验证。
另外，根据近两年的报道，利用磷酸蛋白质组学分析来寻找RLK下游的底物蛋白也受到越来越多的关注[9，14]。该方法主要是通过获得目的RLK的突变体，然后进行磷酸化组学分析，根据差异的磷酸化底物蛋白来确定候选底物蛋白。我们目前也正在利用Crisp-Cas9系统来敲除FTPK1基因，希望通过磷酸化蛋白质组学分析结合酵母双杂交试验进一步确定该蛋白的候选互作蛋白。
本试验结果为进一步研究FTPK1的功能及探究FTPK1的下游信号调控通路奠定了基础。
参 考 文 献：
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