【摘 要】
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目的 建立有错配的加尾双引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应（T-ARMS PCR）多重检测的方法，实现针对肝细胞癌常见基因突变位点TP53 R249S、TP53 R273H、CTNNB1 S45F的多重检测。方法 针对3个基因突变位点进行引物设计，每个基因突变位点所设计引物序列的5′端不加一段DNA序列（Tail Free Primer）或者所设计的引物序列5′端加一段相同的DNA序列（Tailed
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（61874133,61901469,22005331）； 江苏省科技项目（BE2019684,BE2020768）； 江苏省苏州市基础研究试点项目（SJC2021019）；
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目的 建立有错配的加尾双引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应（T-ARMS PCR）多重检测的方法，实现针对肝细胞癌常见基因突变位点TP53 R249S、TP53 R273H、CTNNB1 S45F的多重检测。方法 针对3个基因突变位点进行引物设计，每个基因突变位点所设计引物序列的5′端不加一段DNA序列（Tail Free Primer）或者所设计的引物序列5′端加一段相同的DNA序列（Tailed Primer）,利用实时荧光定量PCR仪分别检测并比较3个基因突变位点的不同引物序列形成的单重体系、三重体系的扩增结果，研究T-AMRS PCR方法对突变型基因位点突变负荷的检测限、特异性和多靶标检测能力。结果 3个基因突变位点Tailed Primer单重体系扩增结果显示，突变型质粒的扩增均优于野生型质粒，野生型质粒的扩增均被有效抑制，突变负荷检测限低至0.10%,特异性良好。Tailed Primer三重体系减少了引物二聚体的产生，调控CTNNB1 S45F、TP53 R249S、TP53 R273H的解链温度分别为81.11℃、82.36℃、86.35℃,实现不同突变位点的显著区分。与Taqman探针基因分型方法相比，T-AMRS PCR方法野生型和突变型基因的Ct值差异更显著，单荧光通道即可实现突变基因检测。结论 运用T-ARMS PCR进行一管三重检测，分析熔解曲线，能有效检测到目的基因突变，抑制野生型模板的扩增，并区分不同的基因突变位点；同时，Tailed Primer设计减少了多重情况下引物二聚体的产生。该方法可为临床中肝细胞癌的早期筛查、预后预测、病情监测提供理论依据。
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