【摘 要】
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目的 了解创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnifru,cytolysin,WC)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡作用及其机制.方法 采用PCR扩增创伤弧菌GTC333株VVC编码基因vvhA,T-A克隆后测序
【机 构】
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浙江大学医学院病原生物学系,温州医学院检验医学院
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目的 了解创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnifru,cytolysin,WC)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡作用及其机制.方法 采用PCR扩增创伤弧菌GTC333株VVC编码基因vvhA,T-A克隆后测序并构建vvhA基因原核表达系统E.coli BL21DE3pET-42a-vvhA.采用Ni-NTA亲和层析法提纯目的 重组蛋白rVVC,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统确定rVVC表达量及提取物纯度.采用溶血试验检测rVVC溶解兔红细胞的活性.2,4-二硝基苯肼比色法和四苯硼钠比色法分别测定rVVC作用的HUVEC培养物上清中乳酸脱氢酶(LDH)和K+含量.采用流式细胞术检测rVVC诱导HUVEC凋亡的作用.将FITC标记rVVC,采用激光共聚焦技术对HUVEC中的FITC标记rVVC进行定位.结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的vvhA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.09%和98.26%.1μg/ml的rVVC即可溶解兔红细胞(P
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