论文部分内容阅读
摘要 [目的]通过对新疆塔城地区传统发酵酸马奶中Lactobacillus的分离鉴定和耐药谱分析，确定乳杆菌组成及其安全性。[方法]采用梯度稀释涂平板法分离，结合生理生化、属引物和16S rRNA基因扩增进行鉴定。[结果]从7份传统酸马奶中鉴定得到20株乳杆菌，L.plantarum为优势种。所有菌株对万古霉素具有耐受性，多重耐药菌株占85%。[结论]传统酸马奶中蕴含优良的微生物菌种资源，值得进一步研发和保护。
关键词 酸马奶;乳杆菌;鉴定;耐药谱
中图分类号 TS207.3文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）10-0144-03
Abstract [Objective] The composition and safety of Lactobacillus were determined by the isolation，identification and drug resistance spectrum analysis of Lactobacillus in traditional fermented koumiss in Tacheng area of Xinjiang.[Methods]The Lactobacillus were separated by gradient dilution coating plate method and combined with physiological and biochemical test， genusspecific primers amplification， and 16S rRNA gene amplification.[Results] Twenty strains of Lactobacillus were isolated from 7 samples， and L. plantarum was the dominant species. All strains were resistant to vancomycin， and multidrug resistant strains accounted for 85%. [Conclusion] Traditional fermented koumiss contains excellent microbial resources and is worthy of further research and development.
Key words Koumiss;Lactobacillus;Identification;Drug resistant spectrum
我国新疆塔城地区哈萨克族、维吾尔族、蒙古族等少数民族具有悠久的游牧历史，拥有众多具有民族特色的传统乳品。其中，传统酸马奶因其特有風味、口感及丰富的营养和保健作用，深受人们喜爱。传统的酸马奶通常是在夏天将刚挤出的新鲜马奶倒入皮囊中，加入适量自留的发酵引子，搅拌均匀后密封、保温存放，每天不定时的搅拌，发酵数日即可[1]。这种传统的发酵过程在酸马奶中自然的筛选、富集了具有地理、环境、气候、民俗等特征的土著性微生物，为工业化生产发酵乳制品及益生菌产品提供了宝贵的菌种资源[2]。然而，受牧区卫生条件的限制，人、畜常用的青霉素、卡那霉素、万古霉素等抗生素药残在水体、排泄物、土壤之间循环，产生了获得性耐药微生物，引起了微生物的耐药基因不断传播和富集，对人类临床疾病的治疗和传统发酵乳品的安全性造成了很大的影响[3]。因此，优良微生物资源的开发及其安全性评估显得非常有必要。该研究通过对新疆塔城地区传统酸马奶样品中乳杆菌的分离、鉴定及其菌株耐药谱分析，为乳杆菌资源的开发和乳品生物安全性评估提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
7份传统酸马奶样品采集自额敏县（Em）、和布克赛尔县（Hb）、塔城市（Tc）、托里县（Tl）;乳酸杆菌选择性琼脂（LSA）、MRS培养基生物纯试剂购自青岛
海博生物技术有限公司;Pre-Mix购自TaKaRa公司;PCR引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成;抗生素纸片（氯霉素，C30;环丙沙星，CIP5;庆大霉素，CN10;红霉素，E15;卡那霉素，K30;新霉素，N30;青霉素G，P10;利福平，RD5;链霉素，S10;四环素，TE30;万古霉素，VA30）为英国的Oxoid;其余分析纯试剂购自天津市化学试剂三厂。模式菌株为L.plantarum CGMCC1.7487、L.raffinolactis CGMCC1.1935、L.casei CGMCC1.575。
1.2 仪器与设备
PCR仪为德国Biometra公司Tprofessional;凝胶成像系统为法国Vilber多功能成像系统;水平电泳仪为美国Bio-Rad公司PowerPac Universal。
1.3 方法
1.3.1 分离纯化。
移取10 mL样品于90 mL无菌生理盐水，振荡混匀。采用梯度稀释法，取10-2、10-3、10-4各100 μL分别在LSA、MRS培养基上涂布，37 ℃培养48 h。根据菌落形态、颜色等表面特征差异随机挑取10个不同的单菌落在相应的培养基上纯化3次后接种至MRS肉汤37 ℃富集24 h，补充25%的灭菌甘油冷冻保藏在-80 ℃[4]。
1.3.2 初筛。
参考东秀珠等[5]的方法，纯培养物通过革兰氏染色和接触媒试验的初步筛选，将筛选到的G+、接触酶阴性、细胞形态为杆状的菌株作为疑似乳杆菌进一步鉴定。
1.3.3 菌株属水平PCR扩增。
参考Justé等[6]的方法提取初筛菌株的基因组DNA保存于-20 ℃。 参考文献[7]，选用乳杆菌属特异性引物LbLMA1-rev（5'-CTTGAGAGTTTGATCCTGG-3'）、R16-1（5'-CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3'）进行扩增，以标准菌株作为阳性对照，目标片段大小约200 bp。其PCR扩增体系：Pre-Mix 12.5 μL，引物（20 μmol/L）各1 μL，DNA约50 ng，ddH2O补足25 μL。扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，4.5 V/cm电泳1.5 h，使用Vilber多功能成像系统对电泳凝胶进行成像分析。
1.3.4 乳杆菌16S rRNA基因的系统进化分析。
将乳杆菌属特异性PCR扩增结果呈阳性的菌株，采用细菌通用引物27F、1492R进行PCR扩增[8]。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，由生工生物工程（上海）股份有限公司纯化后进行测序。将测序结果进行BLAST在线分析，下载GenBank数据库中同源性达到98%以上的基因序列，建立系统发育树。用ClustalX 1.83软件将序列进行排列[9]，用邻接法neighbor-joining method计算进化距离，距离模型采用P-distances法和Kimura-2parameter双参数法进行，进化树分支模式的稳定性用MEGA 5.0[10]软件分析，可靠性验证采用Bootstrap法，重复次数为1 000。
1.3.5 耐药谱。
参考贾丽艳[11]的方法，将筛选的乳杆菌培养至对数期，调整菌液浓度为（2.0～2.5）×108 CFU/mL，移取200 μL，用无菌棉签将菌液涂布于MRS培养基。将抗生素纸片分别等距贴于平板上，37 ℃培养24 h，利用游标卡尺测定抑菌圈直径。每种纸片3个平行，结果求平均值。参考临床实验室标准化协会（CLSI）制定的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》分析菌株的耐药性[12]。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离、初步鉴定
将7份样品处理后从2种培养基中共分离到135株疑似乳杆菌纯培养物。通过革兰氏染色、镜检，筛选到59株细胞形态为杆状、G+菌株，其中41株接触媒试验呈阴性。菌落颜色主要有乳白色、白色、乳黄色，菌落大部分中部凸起，表面湿润。在液体富集时，培养基底部有沉淀，越靠上培养基越澄清，表明菌株嗜好低浓度氧的环境。
2.2 乳杆菌属特异性PCR扩增
41株初步筛选的疑似乳杆菌经属特异性引物PCR扩增后，扩增产物检测结果呈阳性，条带大小与模式菌株一致且符合目标片段的菌株共有20株（图1）。
2.3 乳杆菌16S rRNA基因的系统进化分析
通过对20株菌株进行16S rRNA基因的扩增、测序后得到菌株序列，通过Blast工具在GenBank数据库中与已发表的16S rRNA基因序列进行相似性比較，选取相似性在98%以上的序列构建系统发育树（图2），由系统发育树可知20株菌株均为Lactobacillus，包括L.plantarum、L.fermentum、L.acidophilus、L.casei、L.paracasei共5个种。其中Hb1-M-6、Hb1-L-1、Hb3-M-7、Tc-L-10、Tl1-L-6、Tl2-M-7、Tl2-L-9、Tl2-M-6的序列与L.plantarum的相似性达100%;Hb1-M-1、Hb2-M-1、Hb2-L-4、Tc-L-6、Tl1-M-10的基因序列与L.fermentum的相似性高于98%;Hb1-M-5、Hb2-L-3、Hb3-M-4、Hb3-M-8与已知的L.acidophilus的相似性均达99%;Em-L-9、Tl1-L-3与L.casei的相似性为99%，Tl1-L-5与L.paracasei的序列相似性为100%。
2.4 耐药谱
20株Lactobacillus对11种常用抗生素的耐药性统计如图3，所有菌株对万古霉素（VA30）具有耐受性，16株乳杆菌对卡那霉素（K30）具有耐受性，所有菌株对利福平（RD5）敏感。85%的菌株表现为多重耐药（MDR），耐受5、6种抗生素的菌株分别占35%、20%，菌株Tl1-L-3对7种抗生素具有耐受性。
3 讨论与结论
近年来，土著性优势微生物资源的开发受到国内广大学者的关注，尤其以Lactobacillus、Bifidobacterium、Bacillus等益生菌为主。我国新疆具有悠久的游牧历史，传统的发酵乳品种类繁多，发酵制品中包含了大量的土著性微生物，是优良菌种研发的一个重要资源库。该研究通过属特异性引物PCR扩增，结合16S rRNA基因测序，从7份传统酸马奶中分离、鉴定得到20株乳杆菌，包括5个种。其中，植物乳杆菌为优势菌种占40%，发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌分别为25%、20%，干酪乳杆菌分离到2株（10%），副干酪乳杆菌只有1株（5%）。孙天松等[13]的研究中瑞士乳杆菌为优势种，其次为嗜酸乳杆菌;孟和毕力格等[14]从内蒙古采集的酸马奶中干酪乳杆菌最多占32%，嗜酸乳杆菌占20%，植物乳杆菌8株占16%;张明珠[15]从乌鲁木齐市郊采集的样品中分离得到干酪乳杆菌占15.8%。相比发现，不同地区、不同研究中乳杆菌在种水平上的组成比例相差较大，这是由于地域、自然环境、季节等差异导致酸马奶营养成分、发酵条件不同。同时，不同地区、家庭、民族的制作方法、发酵引子、卫生习惯存在很大差异，从而导致微生物组成存在差异[16]。
微生物菌株对抗生素的敏感性是筛选益生菌和发酵剂时需首要考虑的安全特性[17]。该研究从7份传统酸马奶样品中分离的20株Lactobacillus均对万古霉素耐药，最多耐受7种抗生素，多重耐药率达85%。大量的研究报道了乳杆菌对万古霉素具有天然耐受性[18-19]，张爱民[20]、梁萌萌等[21]的研究结果与该研究较为接近。 新疆塔城地区传统酸马奶中Lactobacillus资源丰富，大量的菌株具有多重耐药性，优良菌株的开发和保护迫在眉睫。
参考文献
[1] 额尔登孟克，潘琳，阿木尔图布兴，等.传统发酵乳制品酸马奶的研究进展[J].内蒙古农业大学学报（自然科学版），2016，37（2）：134-140.
[2] 孔杭如，唐善虎，胡洋，等.酸马奶研究现状及进展[J].中国乳品工业，2016，44（5）：32-35.
[3] BERENDS B R，VAN DEN BOGAARD A E，VAN KNAPEN F，et al.Human health hazards associated with the administration of antimicrobials to slaughter animals.Part I.An assessment of the risks of residues of tetracyclines in pork[J].Veterinary quarterly，2001，23（1）：2-10.
[4] 倪亚雯.新疆北疆地区自然发酵乳品中Lactobacillus遗传差异及益生特性研究[D].石河子：石河子大学，2016.
[5] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：364-398.
[6] JUST A，THOMMA B P H J，LIEVENS B.Recent advances in molecular techniques to study microbial communities in food-associated matrices and processes[J].Food microbiology，2008，25（6）：745-761.
[7] DUBERNET S，DESMASURES N，GUGUEN M.A PCRbased method for identification of lactobacilli at the genus level[J].FEMS Microbiology Letters，2002，214（2）：271-275.
[8] KHALIL E S，ABD MANAP M Y，MUSTAFA S，et al.Probiotic properties of exopolysaccharide-producing Lactobacillus strains isolated from Tempoyak[J].Molecules，2018，23（2）：398-417.
[9] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The CLUSTAL_X windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic acids research，1997，25（24）：4876-4882.
[10] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[11] 賈丽艳.产类细菌素菌株的筛选鉴定及类细菌素的研究[D].太谷：山西农业大学，2014.
[12] FALLIS A G.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，Clinical and Laboratory Standards institute，CLSI[J].Journal of chemical information and modeling，2013，53（9）：1689-1699.
[13] 孙天松，王俊国，张列兵，等.中国新疆地区酸马奶中乳酸菌生物多样性研究[J].微生物学通报，2007，34（3）：451-454.
[14] 孟和毕力格，乌日娜，王立平，等.不同地区酸马奶中乳杆菌的分离及其生物学特性的研究[J].中国乳品工业，2004，32（11）：6-11.
[15] 张明珠.新疆酸马奶中乳酸菌的多态性分析及发酵性能研究[J].食品与发酵科技，2015，51（3）：44-48.
[16] 陆东林，刘朋龙.传统酸马奶中的微生物多样性及其益生作用[J].新疆畜牧业，2018，33（5）：4-9.
[17] PARK M S，JI G E.Development of probiotics and industrialization[J].Food science and industry，2014，47：19-28.
[18] HUMMEL A S，HERTEL C，HOLZAPFEL W H，et al.Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria[J].Applied & environmental microbiology，2007，73（3）：730-739.
[19] 邵玉宇.干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2015.
[20] 张爱民.不同来源乳酸菌的耐药性分析及药敏性乳酸菌的应用[D].扬州：扬州大学，2008.
[21] 梁萌萌，张柏林，赵紫华，等.几株益生乳杆菌耐药性的研究[J].河北工业科技，2011，28（4）：250-253.
关键词 酸马奶;乳杆菌;鉴定;耐药谱
中图分类号 TS207.3文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）10-0144-03
Abstract [Objective] The composition and safety of Lactobacillus were determined by the isolation，identification and drug resistance spectrum analysis of Lactobacillus in traditional fermented koumiss in Tacheng area of Xinjiang.[Methods]The Lactobacillus were separated by gradient dilution coating plate method and combined with physiological and biochemical test， genusspecific primers amplification， and 16S rRNA gene amplification.[Results] Twenty strains of Lactobacillus were isolated from 7 samples， and L. plantarum was the dominant species. All strains were resistant to vancomycin， and multidrug resistant strains accounted for 85%. [Conclusion] Traditional fermented koumiss contains excellent microbial resources and is worthy of further research and development.
Key words Koumiss;Lactobacillus;Identification;Drug resistant spectrum
我国新疆塔城地区哈萨克族、维吾尔族、蒙古族等少数民族具有悠久的游牧历史，拥有众多具有民族特色的传统乳品。其中，传统酸马奶因其特有風味、口感及丰富的营养和保健作用，深受人们喜爱。传统的酸马奶通常是在夏天将刚挤出的新鲜马奶倒入皮囊中，加入适量自留的发酵引子，搅拌均匀后密封、保温存放，每天不定时的搅拌，发酵数日即可[1]。这种传统的发酵过程在酸马奶中自然的筛选、富集了具有地理、环境、气候、民俗等特征的土著性微生物，为工业化生产发酵乳制品及益生菌产品提供了宝贵的菌种资源[2]。然而，受牧区卫生条件的限制，人、畜常用的青霉素、卡那霉素、万古霉素等抗生素药残在水体、排泄物、土壤之间循环，产生了获得性耐药微生物，引起了微生物的耐药基因不断传播和富集，对人类临床疾病的治疗和传统发酵乳品的安全性造成了很大的影响[3]。因此，优良微生物资源的开发及其安全性评估显得非常有必要。该研究通过对新疆塔城地区传统酸马奶样品中乳杆菌的分离、鉴定及其菌株耐药谱分析，为乳杆菌资源的开发和乳品生物安全性评估提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
7份传统酸马奶样品采集自额敏县（Em）、和布克赛尔县（Hb）、塔城市（Tc）、托里县（Tl）;乳酸杆菌选择性琼脂（LSA）、MRS培养基生物纯试剂购自青岛
海博生物技术有限公司;Pre-Mix购自TaKaRa公司;PCR引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成;抗生素纸片（氯霉素，C30;环丙沙星，CIP5;庆大霉素，CN10;红霉素，E15;卡那霉素，K30;新霉素，N30;青霉素G，P10;利福平，RD5;链霉素，S10;四环素，TE30;万古霉素，VA30）为英国的Oxoid;其余分析纯试剂购自天津市化学试剂三厂。模式菌株为L.plantarum CGMCC1.7487、L.raffinolactis CGMCC1.1935、L.casei CGMCC1.575。
1.2 仪器与设备
PCR仪为德国Biometra公司Tprofessional;凝胶成像系统为法国Vilber多功能成像系统;水平电泳仪为美国Bio-Rad公司PowerPac Universal。
1.3 方法
1.3.1 分离纯化。
移取10 mL样品于90 mL无菌生理盐水，振荡混匀。采用梯度稀释法，取10-2、10-3、10-4各100 μL分别在LSA、MRS培养基上涂布，37 ℃培养48 h。根据菌落形态、颜色等表面特征差异随机挑取10个不同的单菌落在相应的培养基上纯化3次后接种至MRS肉汤37 ℃富集24 h，补充25%的灭菌甘油冷冻保藏在-80 ℃[4]。
1.3.2 初筛。
参考东秀珠等[5]的方法，纯培养物通过革兰氏染色和接触媒试验的初步筛选，将筛选到的G+、接触酶阴性、细胞形态为杆状的菌株作为疑似乳杆菌进一步鉴定。
1.3.3 菌株属水平PCR扩增。
参考Justé等[6]的方法提取初筛菌株的基因组DNA保存于-20 ℃。 参考文献[7]，选用乳杆菌属特异性引物LbLMA1-rev（5'-CTTGAGAGTTTGATCCTGG-3'）、R16-1（5'-CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3'）进行扩增，以标准菌株作为阳性对照，目标片段大小约200 bp。其PCR扩增体系：Pre-Mix 12.5 μL，引物（20 μmol/L）各1 μL，DNA约50 ng，ddH2O补足25 μL。扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，4.5 V/cm电泳1.5 h，使用Vilber多功能成像系统对电泳凝胶进行成像分析。
1.3.4 乳杆菌16S rRNA基因的系统进化分析。
将乳杆菌属特异性PCR扩增结果呈阳性的菌株，采用细菌通用引物27F、1492R进行PCR扩增[8]。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，由生工生物工程（上海）股份有限公司纯化后进行测序。将测序结果进行BLAST在线分析，下载GenBank数据库中同源性达到98%以上的基因序列，建立系统发育树。用ClustalX 1.83软件将序列进行排列[9]，用邻接法neighbor-joining method计算进化距离，距离模型采用P-distances法和Kimura-2parameter双参数法进行，进化树分支模式的稳定性用MEGA 5.0[10]软件分析，可靠性验证采用Bootstrap法，重复次数为1 000。
1.3.5 耐药谱。
参考贾丽艳[11]的方法，将筛选的乳杆菌培养至对数期，调整菌液浓度为（2.0～2.5）×108 CFU/mL，移取200 μL，用无菌棉签将菌液涂布于MRS培养基。将抗生素纸片分别等距贴于平板上，37 ℃培养24 h，利用游标卡尺测定抑菌圈直径。每种纸片3个平行，结果求平均值。参考临床实验室标准化协会（CLSI）制定的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》分析菌株的耐药性[12]。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离、初步鉴定
将7份样品处理后从2种培养基中共分离到135株疑似乳杆菌纯培养物。通过革兰氏染色、镜检，筛选到59株细胞形态为杆状、G+菌株，其中41株接触媒试验呈阴性。菌落颜色主要有乳白色、白色、乳黄色，菌落大部分中部凸起，表面湿润。在液体富集时，培养基底部有沉淀，越靠上培养基越澄清，表明菌株嗜好低浓度氧的环境。
2.2 乳杆菌属特异性PCR扩增
41株初步筛选的疑似乳杆菌经属特异性引物PCR扩增后，扩增产物检测结果呈阳性，条带大小与模式菌株一致且符合目标片段的菌株共有20株（图1）。
2.3 乳杆菌16S rRNA基因的系统进化分析
通过对20株菌株进行16S rRNA基因的扩增、测序后得到菌株序列，通过Blast工具在GenBank数据库中与已发表的16S rRNA基因序列进行相似性比較，选取相似性在98%以上的序列构建系统发育树（图2），由系统发育树可知20株菌株均为Lactobacillus，包括L.plantarum、L.fermentum、L.acidophilus、L.casei、L.paracasei共5个种。其中Hb1-M-6、Hb1-L-1、Hb3-M-7、Tc-L-10、Tl1-L-6、Tl2-M-7、Tl2-L-9、Tl2-M-6的序列与L.plantarum的相似性达100%;Hb1-M-1、Hb2-M-1、Hb2-L-4、Tc-L-6、Tl1-M-10的基因序列与L.fermentum的相似性高于98%;Hb1-M-5、Hb2-L-3、Hb3-M-4、Hb3-M-8与已知的L.acidophilus的相似性均达99%;Em-L-9、Tl1-L-3与L.casei的相似性为99%，Tl1-L-5与L.paracasei的序列相似性为100%。
2.4 耐药谱
20株Lactobacillus对11种常用抗生素的耐药性统计如图3，所有菌株对万古霉素（VA30）具有耐受性，16株乳杆菌对卡那霉素（K30）具有耐受性，所有菌株对利福平（RD5）敏感。85%的菌株表现为多重耐药（MDR），耐受5、6种抗生素的菌株分别占35%、20%，菌株Tl1-L-3对7种抗生素具有耐受性。
3 讨论与结论
近年来，土著性优势微生物资源的开发受到国内广大学者的关注，尤其以Lactobacillus、Bifidobacterium、Bacillus等益生菌为主。我国新疆具有悠久的游牧历史，传统的发酵乳品种类繁多，发酵制品中包含了大量的土著性微生物，是优良菌种研发的一个重要资源库。该研究通过属特异性引物PCR扩增，结合16S rRNA基因测序，从7份传统酸马奶中分离、鉴定得到20株乳杆菌，包括5个种。其中，植物乳杆菌为优势菌种占40%，发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌分别为25%、20%，干酪乳杆菌分离到2株（10%），副干酪乳杆菌只有1株（5%）。孙天松等[13]的研究中瑞士乳杆菌为优势种，其次为嗜酸乳杆菌;孟和毕力格等[14]从内蒙古采集的酸马奶中干酪乳杆菌最多占32%，嗜酸乳杆菌占20%，植物乳杆菌8株占16%;张明珠[15]从乌鲁木齐市郊采集的样品中分离得到干酪乳杆菌占15.8%。相比发现，不同地区、不同研究中乳杆菌在种水平上的组成比例相差较大，这是由于地域、自然环境、季节等差异导致酸马奶营养成分、发酵条件不同。同时，不同地区、家庭、民族的制作方法、发酵引子、卫生习惯存在很大差异，从而导致微生物组成存在差异[16]。
微生物菌株对抗生素的敏感性是筛选益生菌和发酵剂时需首要考虑的安全特性[17]。该研究从7份传统酸马奶样品中分离的20株Lactobacillus均对万古霉素耐药，最多耐受7种抗生素，多重耐药率达85%。大量的研究报道了乳杆菌对万古霉素具有天然耐受性[18-19]，张爱民[20]、梁萌萌等[21]的研究结果与该研究较为接近。 新疆塔城地区传统酸马奶中Lactobacillus资源丰富，大量的菌株具有多重耐药性，优良菌株的开发和保护迫在眉睫。
参考文献
[1] 额尔登孟克，潘琳，阿木尔图布兴，等.传统发酵乳制品酸马奶的研究进展[J].内蒙古农业大学学报（自然科学版），2016，37（2）：134-140.
[2] 孔杭如，唐善虎，胡洋，等.酸马奶研究现状及进展[J].中国乳品工业，2016，44（5）：32-35.
[3] BERENDS B R，VAN DEN BOGAARD A E，VAN KNAPEN F，et al.Human health hazards associated with the administration of antimicrobials to slaughter animals.Part I.An assessment of the risks of residues of tetracyclines in pork[J].Veterinary quarterly，2001，23（1）：2-10.
[4] 倪亚雯.新疆北疆地区自然发酵乳品中Lactobacillus遗传差异及益生特性研究[D].石河子：石河子大学，2016.
[5] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：364-398.
[6] JUST A，THOMMA B P H J，LIEVENS B.Recent advances in molecular techniques to study microbial communities in food-associated matrices and processes[J].Food microbiology，2008，25（6）：745-761.
[7] DUBERNET S，DESMASURES N，GUGUEN M.A PCRbased method for identification of lactobacilli at the genus level[J].FEMS Microbiology Letters，2002，214（2）：271-275.
[8] KHALIL E S，ABD MANAP M Y，MUSTAFA S，et al.Probiotic properties of exopolysaccharide-producing Lactobacillus strains isolated from Tempoyak[J].Molecules，2018，23（2）：398-417.
[9] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The CLUSTAL_X windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic acids research，1997，25（24）：4876-4882.
[10] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[11] 賈丽艳.产类细菌素菌株的筛选鉴定及类细菌素的研究[D].太谷：山西农业大学，2014.
[12] FALLIS A G.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，Clinical and Laboratory Standards institute，CLSI[J].Journal of chemical information and modeling，2013，53（9）：1689-1699.
[13] 孙天松，王俊国，张列兵，等.中国新疆地区酸马奶中乳酸菌生物多样性研究[J].微生物学通报，2007，34（3）：451-454.
[14] 孟和毕力格，乌日娜，王立平，等.不同地区酸马奶中乳杆菌的分离及其生物学特性的研究[J].中国乳品工业，2004，32（11）：6-11.
[15] 张明珠.新疆酸马奶中乳酸菌的多态性分析及发酵性能研究[J].食品与发酵科技，2015，51（3）：44-48.
[16] 陆东林，刘朋龙.传统酸马奶中的微生物多样性及其益生作用[J].新疆畜牧业，2018，33（5）：4-9.
[17] PARK M S，JI G E.Development of probiotics and industrialization[J].Food science and industry，2014，47：19-28.
[18] HUMMEL A S，HERTEL C，HOLZAPFEL W H，et al.Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria[J].Applied & environmental microbiology，2007，73（3）：730-739.
[19] 邵玉宇.干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2015.
[20] 张爱民.不同来源乳酸菌的耐药性分析及药敏性乳酸菌的应用[D].扬州：扬州大学，2008.
[21] 梁萌萌，张柏林，赵紫华，等.几株益生乳杆菌耐药性的研究[J].河北工业科技，2011，28（4）：250-253.